以蛋白激酶B为靶点的新型抗结核药物高通量筛选模型的建立和应用

【目的】建立以结核分枝杆菌蛋白激酶B为靶点的高通量筛选模型,并运用此模型进行化合物的筛选。【方法】克隆和表达结核分枝杆菌蛋白激酶B,并以其为靶酶建立并优化PknB抑制剂高通量筛选模型,利用该模型对化合物样品进行筛选,并对筛选到的阳性化合物进行抗菌和抑酶活性评价。【结果】利用该模型筛选了化合物样品18 000个,得到具有抑酶活性的阳性化合物8个,其中3个化合物具有较好的对结核分枝杆菌、海分枝杆菌、耻垢分枝杆菌的抑菌活性。【结论】建立的以PknB为靶点的抗结核药物高通量筛选模型具有灵敏度高、稳定性强等优点,可成功用于化合物的高效筛选。筛选得到3个在抑酶水平和抗菌方面均具有良好活性的阳性化合物样品,值得进一步研究。     

以苯丙氨酰-tRNA合成酶为靶点的新型抗结核药物高通量筛选模型的建立和应用

【目的】建立结核分枝杆菌PheRS抑制剂高通量模型,并运用此模型筛选化合物和发酵液样品。【方法】克隆和表达结核分枝杆菌PheRS蛋白并优化其酶活测定方法,在此基础上建立结核分枝杆菌PheRS抑制剂高通量筛选模型,并通过耻垢分枝杆菌作为检定菌对筛选到的样品进行抗菌活性测定及细胞毒性评价。【结果】运用此模型筛选了化合物样品11 600个,发酵液样品5 200个,筛选得到阳性化合物9个,阳性发酵液37个。而后通过耻垢分枝杆菌作为检定菌的抗菌活性测定及细胞毒性评价后,得到了6个发酵液阳性样品。【结论】建立的PheRS抑制剂模型可成功用于化合物和微生物发酵液的高效筛选,得到的6个发酵液阳性样品在酶水平和抗分枝杆菌方面均具有良好活性且毒性较低,值得进一步研究。     

以蛋白激酶G为靶点的抗结核药物筛选模型的建立和初步应用

结核分枝杆菌可以产生11种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其中蛋白激酶G(PknG)对于结核分枝杆菌在巨噬细胞内以"持留"状态长期存活有着重要作用。本研究以结核分枝杆菌基因组DNA为模板,在大肠杆菌中克隆表达了MTBPknG蛋白,并分离纯化得到PknG纯酶。本研究还采用三步级联反应方法测定了PknG酶活性,建立和优化了PknG抑制剂高通量筛选模型。利用此模型共筛选发酵液样品2120个,化合物样品2300个,筛选得到阳性化合物1个,阳性发酵液13个,阳性率0.32%。     

新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂荧光共振能量转移高通量筛选模型的优化与应用北大核心CSCD

基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理,以新冠病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)为靶标,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,以期快速筛选新型Mpro小分子抑制剂。利用大肠杆菌原核表达与分离纯化高活性的Mpro,再以FRET法进行比活力测定。基于FRET原理,以7-甲氧基香豆素-4-乙酸(7-methoxycoumarin-4-acetic acid, MCA)与2,4-二硝基苯酚(2,4-dinitropheno, Dnp)标记的多肽作为Mpro水解底物,通过优化反应缓冲液、Mpro反应浓度、反应温度与时间及DMSO耐受浓度,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型进行苗头化合物的筛选。利用大肠杆菌实现了高活性Mpro的原核表达与分离纯化,且比活力不低于40 000 U/mg。通过一系列优化实验,使用0.4μmol/L Mpro与5μmol/L底物建立了Z′因子值为0.79的Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,且反应体系中含有的二硫苏糖醇(1,4-dithiothreitol,DTT)是影响FRET筛选模型可靠性的重要因素。通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,发现白花丹素与银杏酸在体外对Mpro酶活性具有良好的抑制作用。本研究建立了基于FRET原理的Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型,初步证实了白花丹素与银杏酸是一类新型苗头化合物,为抗新型冠状病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定了基础。     

微生物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的建立和初步应用

本研究用昆明种小鼠十二指肠上段提取的α-葡萄糖苷酶,以4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷为反应底物,建立α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型。用该模型对1276株放线菌和132株细菌等共计2224个发酵液粗提物样品进行筛选。初筛得到抑制率超过50%的阳性样品23个,初筛阳性率为1.03%。将阳性菌株再次进行发酵提取,得到新发酵液的阳性样品数为17,复筛阳性率为0.74%。其中细菌3株,放线菌13株。3个阳性样品经α-葡萄糖苷酶验证后的抑制率均在75%以上。本研究建立的α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型具有很强的实用价值,可用于新型糖尿病药物的开发。     

促葡萄糖摄取细胞模型的构建及应用

植物是发现先导药物的天然宝库,目前抗糖尿病药物的一个重要来源是植物。从植物中发现抗糖尿病药物的关键在于抗糖尿病药物筛选模型的建立。为获得一个更稳定、筛选结果更可靠的抗糖尿病药物筛选模型,本文对基于脂肪细胞摄取葡萄糖的药物筛选模型进行优化。文献报道的该类模型,只将胰岛素作为阳性对照,而本文同时将胰岛素和罗格列酮作为阳性对照,使模型更加稳定、筛选结果更加可靠。此外,本文还以胰岛素信号通路抑制剂Akt1/2抑制剂作为另一阳性对照,使之还可应用于胰岛素信号通路抑制剂的筛选,扩展了该模型的用途。最后,对16个植物来源的天然产物在该模型进行筛选,其结果稳定,并发现3个活性化合物。进一步对活性化合物X15、X16进行浓度梯度实验,结果表明,两者的活性都具有明显的浓度依赖性。X15和X16的细胞增敏活性的研究为后续进一步研究其分子作用机理奠定基础,并为后期可能的药物开发提供分子候选。     

人胰腺α-淀粉酶抑制剂高通量筛选模型的建立及其应用

【目的】针对人胰腺α-淀粉酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白,建立α-淀粉酶抑制剂高通量筛选模型。【方法】采用毕赤酵母表达系统克隆和表达人胰腺α-淀粉酶;利用酶的催化特性建立α-淀粉酶抑制剂筛选模型;应用该模型对放线菌发酵液冻干物进行高通量筛选;通过构建16S rRNA系统发育树分析阳性菌株的分类地位。【结果】成功克隆、表达了具催化活性的人胰腺α-淀粉酶;建立了α-淀粉酶抑制剂的筛选模型;对近2000株放线菌的发酵液冻干物进行高通量筛选,最终得到14株α-淀粉酶抑制剂产生菌株,且在分类学上具有丰富的菌种多样性。【结论】本研究建立的α-淀粉酶抑制剂高通量筛选模型具有很强的实用价值,可用于新型淀粉酶抑制剂类降糖药物的开发。     

靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂酶联免疫吸附法高通量筛选模型的优化与应用

在经典的Wnt/β-catenin信号通路中,β-catenin/TCF4 (T-cell factor 4) 相互作用在非小细胞肺癌 (Non-small cell lung cancer,NSCLC) 的生长分化、化疗耐药、转移复发等过程中发挥着重要的促进作用,已成为新型靶向性抗NSCLC转移药物开发的理想靶标之一。为了高效地发现抑制β-catenin/TCF4相互作用的苗头化合物,本研究在应用酶联免疫吸附实验 (Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 原理的基础上,通过优化GST-TCF4 βBD包被浓度和β-catenin反应浓度,建立ELISA高通量筛选模型并成功应用于苗头化合物的筛选。ELISA筛选模型优化实验结果表明,选用2 μg/mL GST-TCF4 βBD和0.5 μg/mL β-catenin建立ELISA高通量筛选模型,其Z′因子值为0.83,并成功筛选到具有良好抑制活性的白花丹素 (Plumbagin)。肿瘤细胞增殖实验结果表明,白花丹素对A549、H1299、MCF7和SW480细胞具有明显的细胞毒性。TOPFlash实验结果证实,白花丹素对转染的HEK293细胞内β-catenin介导的转录活性具有显著的抑制作用,β-catenin/TCF4相互作用可能是白花丹素抗癌活性的潜在分子靶标之一。文中以β-catenin/TCF4相互作用为靶标,通过系统的实验优化方案,成功地建立了适用于药物高通量筛选的ELISA筛选模型,为高效筛选靶向β-catenin/TCF4相互作用的小分子抑制剂奠定了实验基础。     

基于β-catenin/Lef1相互作用为靶标的新型抗肿瘤药物高通量筛选模型的建立

旨在以β-catenin/Lef1相互作用为靶标,建立基于ELISA原理的适用于靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂筛选的高通量筛选模型。利用DNA重组技术,将构建的β-catenin-pET-30a(+)重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3),经诱导培养后进行β-catenin原核表达。采用亲和层析方法分离纯化β-catenin后,以GSTPulldown实验进行生物学活性鉴定。利用ELISA原理建立β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型,通过优选GST-Lef1最佳包被浓度和β-catenin最佳反应浓度,建立适用于靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂筛选的高通量筛选模型。SDS-PAGE和Western blotting实验证实β-catenin的原核表达。GST Pulldown实验证实纯化的β-catenin具有良好的生物学活性。通过对基于ELISA原理建立的β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型优化,选用10μg/mL GST-Lef1和6μg/mLβ-catenin建立ELISA高通量筛选模型,其Z?因子为0.76。本研究成功建立了基于ELISA原理的β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型,为靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂的高通量筛选奠定了基础。     

α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的建立及其应用

【目的】针对人α-麦芽糖苷酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白,建立α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型。【方法】采用毕赤酵母表达系统克隆和表达人α-麦芽糖苷酶。利用酶的催化特性建立α-糖苷酶抑制剂筛选模型。应用该模型对放线菌代谢产物库进行高通量筛选。通过构建16SrRNA系统发育树分析阳性菌株的分类地位。【结果】首次成功克隆、表达了具催化活性的人α-麦芽糖苷酶N端结构域。针对人α-麦芽糖苷酶N端催化结构域,建立α-糖苷酶抑制剂的筛选模型。对包含近2000株放线菌代谢产物的天然产物库进行高通量筛选,最终得到20株α-麦芽糖苷酶抑制剂生产菌株。其中19株放线菌为链霉菌属,且在分类学上具有丰富的多样性。【结论】本研究建立的α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型具有很强的实用价值,可用于新型糖苷酶抑制剂类降糖药物的开发。     

以STAT3为靶标的抗肿瘤药物高通量筛选模型的建立和应用

旨在建立稳定可靠的以转导与转录激活子(STAT3)为靶标的抗肿瘤高通量筛选模型,应用该模型筛选潜在的抗癌药物。利用基因重组、蛋白表达纯化技术,获得STAT3目的蛋白,使用酶联免疫吸附法(ELISA)进行高通量药物筛选,将筛选出的抑制剂在细胞水平上利用MTT比色法测定化合物对癌细胞增殖的影响。结果显示,成功构建表达载体pET-28a-STAT3;所建立的模型稳定可行,可用于以STAT3为靶标的抗肿瘤药物的高通量筛选;用该模型对8 248个样品进行筛选,在500μmol/L药物浓度下,化合物MDC6抑制率为92%,另外,进行IC50值的测定时,分子水平上最低达到3.37μmol/L,在细胞水平上可达到15.92μmol/L。建立的高通量药物筛选模型,具有操作方便、成本低、结果稳定等特点,可用于STAT3抑制剂的大规模筛选。     

流感病毒神经氨酸酶抑制剂的筛选

以神经氨酸酶为药物靶点筛选神经氨酸酶抑制剂, 是研究和开发抗流感病毒药物的重要途径. 应用虚拟药物筛选方法, 从化合物数据库中选出部分待测化合物, 然后应用已建立的 神经氨酸酶抑制剂的高通量筛选模型, 检测了这些化合物的抑制活性, 从中发现了3个活性较高、结构新颖的化合物, 其IC50在0.1~3 μmol/L之间, 这些活性化合物的结构特点, 对于新型神经氨酸酶抑制剂的设计与开发, 将提供重要的信息指导. 流感病毒神经氨酸酶抑制剂的筛选结果表明, 虚拟筛选技术与高通量筛选技术的合理结合, 将有利于促进药物筛选与药物发现.     

绿脓杆菌SecA ATPase抑制剂筛选模型的建立和应用

Sec途径(分泌途径,Secretion pathway)是蛋白质转运的主要途径。其中,SecA ATPase是蛋白质转运途径中的"动力泵",它通过ATP的水解循环驱使蛋白质前体穿过细菌内膜。SecA蛋白在细菌中是独有且不可缺少的。克隆和高效表达绿脓杆菌PasecAN75蛋白(绿脓杆菌SecA蛋白N端645个氨基酸残基组成的片段,大小约75 kD)并优化其ATPase酶活测定体系,在此基础上建立了更为灵敏的SecA蛋白ATPase活性抑制剂的筛选模型。运用该模型从化合物库的3220个样品中筛选得到可抑制绿脓杆菌SecA ATP酶的活性阳性化合物4个,从7196个微生物发酵液中得到66个阳性样品,筛选阳性率为0.67%(以抑制率大于30%为筛选阳性标准)。而后通过已建立的细胞水平筛选模型对其抗菌活性进行验证。研究结果表明3个化合物样品和6个发酵液样品在酶水平和细胞水平对绿脓杆菌SecA ATPase均有较好的抑制作用,值得进一步研究。     

高通量技术在萜类合成酶筛选中的应用

萜类化合物种类繁多,生物活性多样,在食品、药品与化妆品等行业中具有广泛的应用。萜类化合物多来源于植物,然而随着合成生物学的快速发展,相较于传统的天然植物提取与化学合成方法,利用工程微生物进行萜类化合物异源合成的方法显得更为经济与环保。萜类合成酶的催化活性及合成产物的结构特性是萜类化合物异源合成的关键。通过蛋白定向进化与理性设计可以有针对性地优化萜类合成酶的催化性能及产物专一性,但该方案需要一个特异的筛选方法来实现蛋白突变体库的高通量筛选。近年来,一系列高通量筛选方法的建立使得萜类合成酶的筛选变得更加灵敏与高效。本文对近期建立的萜类合成酶高通量筛选方法进行了综述,简要概述了各种筛选方法的基本原理与优缺点,并对高通量筛选技术在萜类合成酶改造中的应用做出了展望。     

鸡血藤中黄酮类化合物与环氧合酶-2对接研究北大核心CSCD

探索黄酮类化合物抗环氧合酶-2的分子机理,筛选鸡血藤中选择性抗环氧合酶-2的黄酮类化合物。本研究应用Autodock 4.2软件对环氧合酶和环氧合酶抑制剂进行分子对接研究,建立阳性抑制剂结合自由能与抑制活性关系模型,并筛选鸡血藤中选择性抗环氧合酶-2的黄酮类化合物。阳性抑制剂与环氧合酶的对接模型R2分别为0.96997和0.84171,建立了预测能力较好的对接模型,可用于指导环氧合酶抑制剂的筛选。筛选结果表明,3',4',7-三羟基黄酮、儿茶素、没食子儿茶素、表儿茶素具有较强的环氧合酶-2选择性抑制活性,可作为母体用于新型抗炎药物设计。     

建立新型的常见腹泻相关病毒的多重检测方法

利用GenomeLab(tm)GeXP遗传分析系统建立一种同时检测A组轮状病毒、诺如病毒GI、GII型、札如病毒、肠道腺病毒、星状病毒、人博卡病毒II型7种常见腹泻相关病毒的方法。对反应条件进行优化后,非同日三次重复实验表明至少在104拷贝/μL水平可同时特异地检测出7种病毒,对Enterovirus71、Human Parechovirus、Picobir-navirusII阳性标本无交叉反应。本研究初步建立了一种高通量、快速的常见腹泻相关病毒的检测方法,为腹泻病原的分子诊断提供了新的方法。     

鸡血藤中黄酮类化合物与环氧合酶-2对接研究

探索黄酮类化合物抗环氧合酶-2的分子机理,筛选鸡血藤中选择性抗环氧合酶-2的黄酮类化合物。本研究应用Autodock 4.2软件对环氧合酶和环氧合酶抑制剂进行分子对接研究,建立阳性抑制剂结合自由能与抑制活性关系模型,并筛选鸡血藤中选择性抗环氧合酶-2的黄酮类化合物。阳性抑制剂与环氧合酶的对接模型R2分别为0.96997和0.84171,建立了预测能力较好的对接模型,可用于指导环氧合酶抑制剂的筛选。筛选结果表明,3',4',7-三羟基黄酮、儿茶素、没食子儿茶素、表儿茶素具有较强的环氧合酶-2选择性抑制活性,可作为母体用于新型抗炎药物设计。     

以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的抗结核药物筛选及其与D-环丝氨酸的共结晶

【目的】阐释结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶原有抑制剂D-环丝氨酸的作用机制,建立丙氨酸消旋酶抑制剂的高通量筛选模型,并用此模型筛选到新的抑制剂分子。【方法】将结核分枝杆菌中丙氨酸消旋酶基因克隆到pET-28a表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到可溶性的大量表达。表达后的蛋白质通过镍离子亲和层析和阴离子交换层析得到纯化,一方面将纯化后的蛋白和D-环丝氨酸共结晶以解析其抑制剂作用的分子机制。另一方面建立并优化丙氨酸消旋酶抑制剂的高通量筛选体系,用D-环丝氨酸验证体系的可行性并用该体系筛选本实验室药物库中的384种小分子片段、792种化合物及2 200种中药样品。【结果】得到的共晶晶体衍射能力2.50?,晶体空间群为P41212,晶胞参数a=b=163.92?,c=57.44?。结构分析表明,D-环丝氨酸进入活性位点之后与磷酸吡哆醛相互作用形成磷酸吡哆胺,使得磷酸吡哆醛的C4?原子与K42之间的相互作用被破坏,从而改变了结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶的活性中心氢键网络。同时经D-环丝氨酸验证建立的抑制剂筛选体系可行,获得阳性化合物分子2个。【结论】依据我们所建立的高通量筛选体系可以有效地为结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶筛选到可信的抑制剂分子。     

蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂高通量筛选模型建立和应用

本文以蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase,PTP1B）作为靶点,采用分子克隆GST融合蛋白的方法,重组表达获得PTP1B,结合自动化操作技术和比色分析,建立了一种PTP1B抑制剂的高通量筛选模型.经在96孔板优化各种反应条件并对17940个样品的筛选结果表明,靶向PTP1B建立的高通量筛选模型具有微量、快速、特异、灵敏等特点,平均日筛选量可达15000样次以上,为寻找新的抗糖尿病药物和先导化合物提供了一种先进的手段.     

抗呼吸道合胞病毒药物高通量筛选方法

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是分布在世界范围内的一种病原体,而本文介绍了几种高通量筛选抗RSV化合物的方法,为病毒定量等研究提供一定的借鉴。