黑蜂王台病毒中国BQCV-JL1株5'UTR的序列分析

蜜蜂黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)是引起蜜蜂蜜蜂黑蜂王台病的病原体,主要侵染蜜蜂蜂王幼虫。BQCV基因组为单正链RNA,包括5'端的ORF 1和3'端的ORF 2两个开放阅读框。分别编码非结构蛋白和结构蛋白。本实验室首次成功分离鉴定得到中国首株BQCV毒株,命名为中国BQCV-JL1株。该株全长为8 358 nt。【目的】本文主要研究该株核苷酸序列位置为1~1 124 nt的片段,该段序列的1~545 nt为该毒株的5'UTR区域。【方法】通过Blast及DNAStar等软件对核苷酸及氨基酸序列进行分析。【结果】5'UTR区域的同源性为94%~99%,为高度保守序列。【结论】经Mega5软件作多重序列对比分析得知,该中国BQCV-JL1株的5'UTR区域与其他毒株差异性很大,经分析推断原因为碱基的缺失与碱基置换。     

福建一例HAstV-5型星状病毒的全基因组测序与重组分析

为了探究一例福建省检出的HAstV-5型星状病毒2013/Fuzhou/85毒株基因组分子结构特点,本研究采用PCR分段扩增、测序、拼接的方法,获得2013/Fuzhou/85毒株基因组序列全长6 803bp:5’端和3’端均有85bp非编码区;中间3个开放阅读框:ORF1a长2 802bp(86～2 887nt),编码非结构蛋白丝氨酸蛋白酶;ORF1b长1 548bp(2 827～4 374nt),编码非结构蛋白RNA聚合酶;ORF2长2 352bp(4 367～6 718nt),编码结构蛋白衣壳蛋白前体。目前,GenBank中仅有两株HAstV-5型星状病毒全基因组序列:中国辽宁毒株(JQ403108)和巴西哥亚尼亚毒株(DQ028633),2013/Fuzhou/85毒株和中国辽宁毒株核苷酸相似度最高,达94.4%。对该HAstV-5型星状病毒3个开放阅读框分别构建系统进化树,发现ORF1a与HAstV-1(JF327666)相似度最高,ORF1b和ORF2与HAstV-5(JQ403108)相似度最高,提示其有可能存在重组,用Simplot软件进行重组分析,重组位点位于2 741bp,在ORF1a和ORF1b重叠区的上游。本研究中对2013/Fuzhou/85毒株的全基因组测序和重组分析,可以为星状病毒的重组和遗传进化规律研究提供参考。     

兔出血症病毒（RHDV）WHNRH株的分离鉴定及基因组全序列的测定与分析

从发病长毛兔中分离鉴定了兔病毒性出血症病毒WHNRH株。参考GenBank中已登录的RHDV毒株序列对RHDV WHNRH分离株进行了全基因组序列测定与分析。设计5对扩增区段相互重叠的RHDV特异性引物,扩增除5′和3′末端以外的序列,采用设计锚引物的5′RACE方法以及针对RHDV 3′末端的polyA结构设计引物获得了RHDV WHNRH株的5′和3′末端序列。胶回收各PCR产物,连接pMD 18-T克隆载体,测得RHDV WHNRH分离株的基因组全长为7437nt(不包括polyA),与GenBank公布的全部共6株RHDV全基因序列进行同源性比较分析,同源性在89.0%~97.1%之间,ORF1同源性为89.0%~97.1%,编码氨基酸序列的同源性为95.2%~98.7%;ORF2的核酸苷序列同源性为92.1%~97.7%,编码氨基酸序列的同源性为94.1%~96.6%。     

中国牛病毒性腹泻病毒JZ05-1分离株全基因测序及分析

牛病毒性腹泻病毒为瘟病毒属成员,呈世界性分布并在乳/肉牛业中造成严重经济损失。本研究利用MD-BK细胞增殖一株分离于我国吉林地区的牛源牛病毒性腹泻病毒JZ05-1毒株,观察发现其具有典型的致细胞病变效应。使用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分别扩增覆盖基因组全长的八个片段并测序,拼接获得该病毒的全基因组序列长12285核苷酸(nt),GenBank登录号:GQ888686。该病毒基因组具有编码多聚蛋白的一个11694nt可读框,5'非翻译区(UTR)长387nt,3'非翻译区长204nt。分别分析BVDVJZ05-1的5'-UTR序列和全基因组序列,发现该病毒属于BVDV-2a亚型。BVDV-2型多数毒株之间的相似性约为96%,与JZ05-1全基因组序列相似性最高的加拿大p11Q毒株和中国XJ-04毒株的相似性为90%和91%。因此,JZ05-1全基因组序列与BVDV-2型其他毒株的全基因组序列具有较大差异。     

鹅源新城疫病毒ZJ1株全基因组的序列测定

依据GenBank上公布的新城疫病毒(NDV)的基因序列,自行设计了9对引物,运用反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)获取覆盖NDV鹅源毒株ZJ1株全基因组的部分重叠片段。病毒RNA的5’及3’端的序列由cT)NA末端快速扩增技术(RACE)获取。整个病毒基因组序列由15192个碱基组成,比GenBank上公布的其它4个NDV毒株Beaudettec、B1、Lasota及Clone-30的全基因组序列长6个核苷酸。这6个核苷酸位于核衣壳蛋白(NP)基因内,相对于NDV毒株Lasota株全基因序列的1647nt～1648nt位。其它10个NDV毒株中的9个毒株也被验证具有此特征,且它们分属于3个不同的基因型。     

中国狂犬病疫苗生产株CTN-1全基因序列分析

本文首次对我国现行狂犬病疫苗生产用毒株CTN-1进行全长基因组序列测定和分析,为CTN-1疫苗在我国实际应用中的优势提供理论基础。利用RT-PCR方法分段扩增CTN-1全基因组序列,随后将PCR产物克隆到T载体、测序、拼接,用MegAlign软件比较CTN-1全基因组序列与国内外狂犬病疫苗株和街毒株全基因组序列的同源性;再以糖蛋白(G)基因为模板,用ClustalX和MEGA4软件进行系统进化分析。测序结果表明CTN-1全基因组序列的长度为11925nt(GenBank登录号FJ959397),序列分析表明CTN-1为基因Ⅰ型;CTN-1株全基因组序列与国内外狂犬病疫苗株和街毒株全基因组之间的同源性是81.5%～93.4%;与美国蝙蝠分离株SHBRV18的同源性最低,仅为81.5%;与新近从中国国内分离的野毒株HN10株的同源性最高,达93.4%。系统进化分析结果表明,CTN-1与国内不同地区大多数分离的狂犬病街毒株聚类于同一组内;而我国另一疫苗株aG株与国外疫苗株如Flury、PM、PV、ERA、RC-HL和个别中国街毒株分在另一组内。G基因氨基酸对比也显示CTN-1株与国内大多数街毒株的同源性高于其他疫苗株,结果说明CTN-1株较其他疫苗株病毒更适合制备用于预防中国狂犬病的灭活疫苗。     

一起无菌性脑膜炎疫情中埃可病毒30型的全基因组分析

对引起一起无菌性脑膜炎的埃可病毒30型（（Echovirus 30,E30）毒株进行全基因组测序,并分析其遗传变异和分子进化特征。提取病毒RNA,荧光RT-PCR确定为肠道病毒,再扩增其VP1区,测序确定为E30,设计针对E30全基因组的引物,RT-PCR扩增和序列测定获得全基因序列。利用DNAMAN 9.0、MEGA X、RDP 5和SimPlot 3.5.1软件分析全基因序列。E30无锡株基因组全长7 425 bp个核苷酸（nt）,5′端和3′端分别为743 nt和97 nt的UTR,二个UTR之间为一个6 585 nt长的开放阅读框,编码一个含2 195个氨基酸（aa）的多聚蛋白。与GenBank中基因组序列比对,最同源的是毒株USA/2017/CA-RGDS-1048 （基因登录号：MN153801）,核苷酸同源性为97.5%,氨基酸同源性为99.1%。VP1基因进化树分析显示,E30无锡株属于h型,并可归类于h型下分的基因簇GroupⅣ。种系进化分析和同源性分析提示E30无锡株可上溯到中国江苏毒株FDJS03毒株。分析还发现E30无锡株在非结构区存在重组,重组序列可能来自E3...     

中国6株狂犬病病毒街毒株全基因组测序与分析

实验研究中对分离于中国的6株狂犬病病毒街毒株进行了全基因组测序,对基因组的5个结构基因(N、P、M、G和L)的核苷酸和推断的氨基酸序列以及非编码区序列进行了分析与比较,并与来自GenBank的40株毒株从全基因组水平进行了分子进化分析。所测6株中国狂犬病病毒街毒株的全基因组核苷酸序列长度介于11 907 nt(CQ92)和11 924 nt(SH06和gg4)之间,基因组结构相同,用全基因组和不同的结构基因构建的进化树拓扑结构相似,基因组3′和5′末端高度保守而且末端11个核苷酸互补配对,5个结构基因的保守性依次是NLMGP,核苷酸同源性的最小值依次分别是81.9%、81.7%、80.7%、78.3%和76.7%。     

22株猪圆环病毒2型安徽分离株全基因组遗传进化分析

为了解安徽地区猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学及流行毒株遗传变异情况,本研究应用DNA Star软件,针对22株PCV2安徽分离株和26株GenBank登录的PCV2参考毒株,进行全基因组核苷酸序列、ORF1和ORF2核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性分析,并运用MEGA 6.0软件构建系统进化树.结果显示,22株PCV2安徽分离株基因组全长均为1 767 bp,相互之间的核苷酸序列相似度为94.6％～99.8％,与GenBank登录的26株PCV2参考毒株之间的核苷酸序列相似度为92.4％～99.8％.PCV2安徽分离株的ORF1核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与参考毒株之间的相似度分别为94.3％～100％和85.4％～100％,ORF2核苷酸序列及其推导的氨基酸序列相似度分别为85.9％～99.9％和76.9％～100％.ORF2编码的Cap蛋白氨基酸序列在8～30、44～91、121～140及190～224几个区域存在突变,且有部分变异位点位于抗原表位区.22株PCV2安徽分离株分布于两个基因亚型,8株属于PCV2b,14株属于PCV2d.结果表明,PCV2安徽分离株的全基因组核苷酸序列较稳定且彼此间亲缘关系密切.ORF2的变异程度远高于ORF1,PCV2d基因亚型己经逐渐过渡成为安徽地区的主要流行毒株.Cap蛋白氨基酸序列在免疫反应区域内的变异可能影响PCV2的免疫原性.本研究结果丰富了安徽地区猪圆环病毒病的分子流行病学资料,同时也为有效防控该病提供了一定的参考依据.     

犬圆环病毒全基因组克隆与序列分析

犬圆环病毒(Dog circovirus,DogCV)是近年来新发现的一种哺乳动物圆环病毒。为研究DogCV中国流行毒株基因组特性和遗传进化,以犬血清样品提取的DNA为模板,采用重叠PCR技术首次获得DogCV中国流行毒株的全基因组序列,命名为JZ98/2014。序列分析表明JZ98/2014全基因组长度为2063nt,编码3个主要开放阅读框:ORF V1(Rep蛋白,303个氨基酸)、ORF C1(Cap蛋白,270个氨基酸)和ORF C2(106个氨基酸)。同源性比较显示JZ98/2014与美国、欧洲流行毒株的全基因组序列同源性为82.1%-89.5%,而Rep和Cap基因同源性分别为82.1%-89.5%和84.6%-89.1%。遗传进化树分析显示,目前世界流行的DogCV存在多个分支,而JZ98/2014与美国、欧洲流行毒株处于不同分支。     

GI型诺如病毒湖州株2008/Huzhou/N11进行全基因组序列测定与分析

为了对GI型诺如病毒湖州株2008/Huzhou/N11进行全基因组序列测定,了解其分子特征及基因类型。方法是根据GenBank上下载的GI型诺如病毒各基因型代表株保守序列设计特异性引物对2008/Huzhou/N11进行全基因组测序,并与GI型诺如病毒各基因型的原型株进行全序列的比对,使用MEGA 4.0软件绘制系统进化树。利用Simplot3.5.1软件进行相似性分析,对基因重组加以验证。结果表明,诺如病毒2008/Huzhou/N11基因组全长7 691bp,有3个开放阅读框(ORF)。ORF1长5 367bp(5~5 371nt),ORF2长1 623bp(5 355~6 977nt),ORF3长630bp(6 977~7 606nt)。RNA聚合酶区(4 320~5 091bp)系统进化分析显示2008/Huzhou/N11属于GI.2基因型,VP1区(5 355~6 977bp)和VP2区(6 977~7 606bp)的系统进化分析显示2008/Huzhou/N11属于GI.6基因型。进一步的Simplot分析提示2008/Huzhou/N11为GI.2/GI.6重组株,重组位点位于ORF1和ORF2重叠区的上游。本文确定了我国GI型诺如病毒湖州株2008/Huzhou/N11为GI.2/GI.6重组株,可为国内诺如病毒的遗传进化研究提供序列参考。     

FMDV OH99株基因组全序列的测定及其基因特征研究

采用RT-PCR方法对FMDV OH99株基因组全序列进行了分子克隆与测序。结果表明OH99株基因组全基因组序列长8040nt,其中5’NCR长1026nt,前导蛋白(L)编码区长603nt。该毒株结构蛋白与非结构蛋白编码区的核苷酸序列为6318nt,3’NCR长93nt,其后是poly(A)尾巴,测序结果表明该结构至少含有56个A。应用分子生物学软件,将OH99株与其它参考毒株进行了序列比较,并对其基因特征、推导的氨基酸序列进行了研究分析。结果显示,在分类地位上OH99株归属于O型FMDV,与OTY TW／97具有较高的同源性,而与其他参考毒株的差异性比较大,而且在基因组功能未知区域和3A编码区域具有两处明显的基因片段缺失现象,其中3A编码区缺失30nt,与OTY TW/97株相同,但功能未知区域的缺失状况与OTY TW／97稍有差异。根据VP1基因序列,对OH99株与参考毒株进行了系统发生树分析,分析结果表明OH99株与0TY TW／97株在同一基因型内,其遗传关系最近,而与其毒株遗传关系较远。     

FMDV OH99株基因组全序列的测定及其基因特征研究

采用RT-PCR方法对FMDV OH99株基因组全序列进行了分子克隆与测序.结果表明OH99株基因组全基因组序列长8040nt,其中5'NCR长1026nt,前导蛋白(L)编码区长603nt.该毒株结构蛋白与非结构蛋白编码区的核苷酸序列为6318nt,3'NCR长93nt,其后是poly(A)尾巴,测序结果表明该结构至少含有56个A.应用分子生物学软件,将OH99株与其它参考毒株进行了序列比较,并对其基因特征、推导的氨基酸序列进行了研究分析.结果显示,在分类地位上OH99株归属于O型FMDV,与OTY TW/97具有较高的同源性,而与其他参考毒株的差异性比较大,而且在基因组功能未知区域和3A编码区域具有两处明显的基因片段缺失现象,其中3A编码区缺失30nt,与OTY TW/97株相同,但功能未知区域的缺失状况与OTY TW/97稍有差异.根据VP1基因序列,对OH99株与参考毒株进行了系统发生树分析,分析结果表明OH99株与OTY TW/97株在同一基因型内,其遗传关系最近,而与其毒株遗传关系较远.     

鸭圆环病毒全基因组克隆与序列分析

为研究鸭圆环病毒全基因组的分子生物学特性,运用重叠PCR技术从鸭组织脏器提取的DNA中扩增出2条核苷酸序列,拼接后对其核酸组成、基因组结构及病毒的遗传变异进行分析.结果表明所获病毒核酸为大小1 995nt的环型DNA,包含6个ORF,与登录在GenBank中克隆株MuDCV(AY228555)的同源性高达97.4%,可见所扩增的核酸序列为鸭圆环病毒基因组序列.     

家蚕浓核病毒 Bm DNV-3(中国株)VD1基因组结构与转录分析

为了进一步认识家蚕浓核病毒BmDNV-3(中国株)VD1基因组的结构和功能,VD1被分离、纯化、克隆到pUC119载体上,完成了基因组全序列的测定。序列分析显示VD1基因组全长为6543个核苷酸,末端拥有224个核苷酸反向重复序列(ITRs)。VD1基因组正链含有3个大的开放阅读框(ORF1-3),负链含有1个大的开放阅读框(ORF4)。比较BmDNV-3的VD1和BmDNV-2(Yamanashiisolate)的VD1基因组全序列,两者同源性为98.4%,并且有107个碱基的替代和1个碱基插入,氨基酸突变集中在VD1ORF3和VD1ORF4。Northern杂交结果显示VD1的左边正链上有1.1kb和1.5kb两个转录本,右边的负链上有一个3.3kb转录本。3′和5′-RACE结果显示1.1kb转录本开始于nt290,结束于nt1437;1.5kb转录本开始于nt1423,结束于nt2931;3.3kb转录本开始于nt6287,结束于nt2922。正链上1.5kb转录本和负链上3.3kb转录本拥有10个核苷酸的3′端的共同序列。研究结果显示该病毒基因转录与已报道的其它浓核病毒存在较大的差异性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株基因组序列测定和分析

应用RT-PCR方法分段扩增出PRRSV上海分离株S1毒株的4条基因大片段,扩增后的产物分别克隆于pCR-XL-TOPO载体鉴定后测序,同时应用RACE方法对S1毒株的3'和5'基因末端进行了成功的扩增并克隆于pMD-18T载体进行测序,按顺序将这些序列进行拼接得到PRRSV S1株全基因组cDNA序列.测序结果表明PRRSV S1株基因组全长15441 bp,包含9个开放式阅读框,5'UTR含有189nt,3'端UTR含有181nt,其中包含30nt Poly (A).基因组序列分析结果显示该病毒与ATCC VR-2332和BJ-4分离株的核苷酸同源性分别99.5%和99.6%.与另一国内分离株CH-1a的核苷酸同源性为90.8%.     

致胰腺泛黄鸭1型甲肝病毒全基因组分子特征

【目的】揭示致胰腺泛黄鸭1型甲肝病毒(duck hepatitis A virus 1,DHAV-1)全基因组的分子特征。【方法】运用RT-PCR技术,扩增出致胰腺泛黄DHAV-1 MPZJ1206株全基因组序列,并与鸭甲肝病毒参考毒株基因组序列进行比对分析。【结果】致胰腺泛黄DHAV-1 MPZJ1206株基因组全长为7703 nt,(G+C)%为43.05%,包含一个大的开放阅读框,编码2249个氨基酸残基的多聚蛋白,基因组结构与其他DHAV-1参考毒株一致。序列比对结果显示,MPZJ1206株全基因组序列与GenBank数据库中DHAV-1参考毒株核苷酸序列同源性在93.5%-99.6%之间,氨基酸同源性在97.9%-99.6%之间,遗传距离均低于7%;分子系统进化分析显示与2011年分离的2株DHAV-1(Du/CH/LGD/111238和Du/CH/LGD/111239)亲缘关系最近。【结论】尽管MPZJ1206毒株感染雏番鸭引起的临床病变与传统DHAV-1差异明显,但其基因组分子特征与传统的DHAV-1毒株相似,病毒致病型的改变可能与其组织嗜性改变相关。     

云南省疫苗衍生脊髓灰质炎病毒全基因组序列遗传特征分析

为了解云南省疫苗衍生脊髓灰质炎病毒(Vaccine-derived Poliovirus,VDPV)的基因组特征,对2010年及2012年监测到的4株VDPV进行全基因组序列测定。结果显示,2株Ⅱ型VDPV的基因组全长均为7439nt,与Sabin Ⅱ疫苗株全基因组核苷酸和氨基酸的序列同源性分别为95.4%和97.7%;2株I型VDPV基因组全长均为7441nt,与Sabin I疫苗株全基因组核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93.9%和97.9%。减毒位点分析发现II型和I型VDPV毒株分别有两个(nt 481和nt 2909)和三个减毒位点(nt 480、nt 2795和nt 6203)发生了回复突变。VP1序列分析显示II型和I型VDPV毒株与相应Sabin株的变异分别为1%和2.3%,重组分析显示II型和I型VDPV的基因组结构分别为S2/S3和S1/S2/S1/S3,后者的重组次数高达3次,显示了重组的普遍性和复杂性,也表明了病毒在人体内复制和传播的持久性与重组的多样性成正相关。因此,从分子水平分析VDPV的特性,可掌握病毒的变异动态,为制定科学可行的VDPV控制策略提供理论依据。     

Asia1型口蹄疫病毒第V群猪源和牛源毒株全基因组比较分析

为了查明Asia1型FMDV第Ⅴ群猪源和牛源毒株的序列差异, 采用RT-PCR方法, 对Asia1型FMDV第Ⅴ群猪源分离毒株Asia1/HN/06的基因组全序列进行了扩增和测序, 并与第Ⅴ群牛源和猪源参考毒株基因组进行比较分析。结果表明, Asia1/HN/06毒株全基因组序列长约8236 nt [含38个A的poly(A)尾], 其中5'NCR长1116 nt, 前导蛋白(L)编码区长603 nt, 结构蛋白与非结构蛋白编码区的核苷酸序列为6990 nt, 3'NCR长93 nt, 3￠端是至少含有38个A的poly(A)尾巴。猪源毒株和牛源毒株的全基因比较分析表明, 属于第Ⅴ群, 全基因编码区核苷酸和氨基酸的同源性均为98.0%, 主要差别是猪源毒株Asia1/HN/06在细胞受体结合位点变为RDD和155位置的N变为S或D, 该群毒株3A更具有猪源毒株特征, 有4个特异性氨基酸变异。明确了Asia1型FMDV第Ⅴ群猪源和牛源毒株的序列差异, 为进一步利用反向遗传技术研究猪源和牛源毒株差异位点或基因在病毒表型变异中的作用奠定基础。