以ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列为标记的肺孢子菌分子系统发育研究

为了阐明肺孢子菌的系统发育及种内分类状况, 本实验对源于大鼠、长爪沙鼠和人的肺孢子菌5.8S核糖体RNA(rRNA)基因和rRNA内转录间隔区(the internal transcribed spacer, ITS)序列进行了扩增、克隆和序列测定. 分析了6种肺孢子菌的属内进化距离并与外囊菌属和酵母菌属比较. 研究结果表明, 肺孢子菌属含有包括长爪沙鼠源肺孢子菌在内的多个菌种. 构建的系统发育树也表明, 人和猴来源的肺孢子菌聚成1组, 4种鼠源肺孢子菌聚成另1组, 而4种鼠源肺孢子菌中, 大鼠源肺孢子菌Pneumocystis wakefieldiae与小鼠源肺孢子菌P. murina及另一大鼠源肺孢子菌P. carinii亲缘关系最近, 与长爪沙鼠源肺孢子菌关系最远.     

特比萘芬治愈儿童鼻翼孢子丝菌病1例

目的报道1例发生在4岁儿童鼻翼的孢子丝菌病。方法刮取病变组织接种到沙堡弱培养基培养,并对培养出的病原菌进行形态学鉴定和ITS区序列分析。结果病变组织在沙堡弱培养基25℃培养长出黑褐色菌落,25℃小培养后光镜及扫描电镜下见菌丝细长,分枝分隔,合轴式产孢形成的成簇和沿菌丝两侧排列,分生孢子卵圆形。提取真菌总DNA用PCR方法扩增ITS序列,测序后登录GeneBank进行比对,该菌与申克孢子丝菌菌株KMU3360ITS区碱基序列一致性达99%,鉴定为申克孢子丝菌。内服联合局部应用特比萘芬治疗6个月后皮损完全消退。结论确诊1例儿童鼻翼的孢子丝菌病,内服联合局部应用特比萘芬治疗儿童孢子丝菌病疗效良好。     

阴道分离因肯毛孢子菌的分子鉴定和种内分型

分别采用rRNA基因内转录间隔区(ITS)和基因间隔区(IGS1)测序,ITS和IGS1区PCR限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和基因组DNA的随机扩增多态性DNA(RAPD)等方法,对三株因肯毛孢子菌Trichosporon inkin进行分子特征及种内分型研究。结果显示,不同菌株的rRNA基因ITS区和IGS1区的序列相似性均高达100%,RFLP酶切图谱具有较理想的种内一致性,而不同菌株的RAPD图谱不尽相同。研究表明:rRNA基因IGS1区测序及RFLP酶切可考虑用于因肯毛孢子菌的菌种分子鉴定,而基因组DNA的RAPD则较适合于菌种的种内分型。     

稷酸米汁中新耐碱酵母Trichosporon asahii var.asahii XJU-1的分离鉴定

目的:从山西偏关县地方饮食稷米汁中分到一株酵母,命名为XJU-1,并进行分类学鉴定及pH耐受检测。方法:XJU-1的形态学观察、生理学测试及脂肪酸分析、测定基因的ITS区、26S大亚基D1/D2区以及IGS区,测序序列用邻近法建树推算XJU-1的归属。结果:XJU-1生长谱为pH 2.0～13.0,最适为8.0。仅检测到8种脂肪酸,3种优势脂肪酸总量为91.24%。基因ITS区和26S大亚基D1/D2区显示与Trichosporon asahii(Strain 2479T)最为相近,分别仅有1bp差异。基因IGS区表明该菌是T.asahii的一个变种T.asahii var.asahii。结论:已知的T.asahii无耐碱性报道,XJU-1(=CGMCC AS 2.3199=CCTCC AF207026)pH生长谱宽泛,是一株新的兼性耐碱菌株。     

临床相关毛孢子菌的鉴定及体外药物敏感性研究

目的探讨临床相关毛孢子菌的鉴定方法及对常见抗真菌药物的体外敏感性。方法对48株临床分离的毛孢子菌分别通过形态学、API20C AUX、Vitek 2 Compact及核糖体rDNA ITS序列分析等方法鉴定到种;采用浓度梯度法（E-test）测定氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B及卡泊芬净对48株毛孢子菌的最低抑菌浓度。结果形态学和API20C AUX、Vitek 2 Compact不能准确区分不同种的毛孢子菌,以核糖体rDNA ITS序列分析将48株毛孢子菌鉴定为8个种：阿萨希毛孢子菌,星型毛孢子菌,皮瘤毛孢子菌,真皮毛孢子菌,皮肤毛孢子菌,赖巴克毛孢子菌,T.domesticum,T.jirovecii。体外药敏结果显示：卡泊芬净对毛孢子菌无体外活性,MIC〉32μg/mL;氟康唑和两性霉素B对毛孢子菌活性差,体外活性最好的药物是伏立康唑和伊曲康唑。结论常规方法不易将毛孢子菌准确鉴定到种的水平,ITS序列分析准确快速,可以辅助临床区分难鉴定毛孢子菌。毛孢子菌药敏谱不同于临床常见其他酵母菌,氟康唑和两性霉素B对其活性差,伏立康唑具有良好的体外抗菌活性。     

金针菇rDNA序列结构特征分析

rDNA序列中的ITS作为DNA barcoding广泛应用于真菌的系统发育与物种辅助鉴定,IGS被认为可以用于种内水平不同菌株的鉴别。食用菌中还没有完整的rDNA序列的报道。本研究采用二代和三代测序技术分别对金针菇单核菌株“6-3”进行测序,用二代测序的数据对三代测序组装得到的基因组序列进行修正,得到一个在基因完整性、连续性和准确性均较好的基因组序列,对比Fibroporia vaillantii rDNA序列,获得金针菇完整的rDNA序列。金针菇rDNA序列结构分析表明,它有8个rDNA转录单元,长度均为5 903bp,有9个基因间隔区,其长度有较大差异,3 909-4 566bp。rDNA转录单元中,各元件的序列长度分别为：18S rDNA 1 796bp、ITS1 234bp、5.8S rDNA 173bp、ITS2 291bp、28S rDNA 3 410bp。基因间间隔区中,IGS1 1 351-1 399bp、5S rDNA 124bp、IGS2 2 435-3 092bp。金针菇的5S、5.8S、18S、28S rDNA序列准确性得到转录组数据的验证,也得到系统发育分析结果的支持。多序列比对发现,不同拷贝的基因间间隔区序列（IGS1和IGS2）存在丰富的多态性,多态性来源于SNP、InDel和TRS（串联重复序列）,而TRS来源于重复单元的类型和数量。9个基因间间隔区之间,IGS1只有少量的SNP和InDel,IGS2不仅有SNP和InDel,还有TRS。本研究结果提示,在应用IGS进行种内水平不同菌株之间的鉴别时,需要选取不同拷贝之间的保守IGS序列。     

儿童孢子丝菌病的临床分析及致病菌的基因型检测

目的 对吉林省扶余县35例儿童孢子丝菌病进行临床分析并对部分菌株进行基因测定,了解该地区孢子丝菌病的致病菌菌株基因是否发生变异而致致病力增强及发病率增高.方法 收集2011年1月1日～4月30日来自扶余县就诊于我科并确诊为孢子丝菌病的患儿35例,进行临床分析;从中选取8株菌,对其核糖体保守区及内转录间隔区(ITS)、非转录间隔区(NTS)区进行基因测定,了解基因水平上的异同.结果 8株孢子丝菌菌株中5株NTS区可见较大范围的碱基缺失.结论 吉林省扶余县孢子丝菌菌株可能由于NTS区碱基较大范围缺失而致致病力增强,导致该地区短时间内发病率增高.     

1株致体股癣的颗粒型红色毛癣菌变种的形态学观察与基因鉴定

目的：探讨1株致体股癣的颗粒型红色毛癣菌变种的形态学特点及核糖体基因序列变化。方法1例体股癣患者皮损中分离出1株红色毛癣菌,观察形态学特点,并用PCR测定核糖体转录间区（ITS）、D1/D2区、非转录区基因序列（NTS区）内串联重复亚单位（TRS）。结果该菌株可产生鹿角形菌丝,大分生孢子有中空现象及单侧出芽产孢特征,可在42℃生长;ITS和D1/D2区基因测序鉴定为红色毛癣菌,但TRS-1和TRS-2基因序列分别有2个、1个碱基差异。结论该菌株可能是颗粒型红色毛癣菌的1个变种。     

一株产虾青素酵母菌株的鉴定

从市售海水鱼内脏中分离得到一株产虾青素的酵母,编号为NZ- 01.采用传统形态学鉴定方法及rDNA序列分析法分别对从NZ- 01进行鉴定.形态学鉴定结果表明该菌为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa),分别用特异性引物对rDNA 序列的18S rDNA D1/D2区、26S rDNA D1/D2区和ITS区进行扩增,PCR产物测序,将测序结果登录GenBank进行BLAST分析,结果均与形态学观察结果一致,NZ- 01为胶红酵母.     

毛木耳rDNA序列结构及IGS鉴别菌种初探

rDNA序列中的ITS作为DNA barcode广泛应用于真菌的系统发育与物种辅助鉴定,IGS被认为可以用于种内水平不同菌株的鉴别。有关食用菌rDNA序列的报道较少。本研究对毛木耳Auricularia cornea单核菌株B02进行三代测序与组装,然后用二代测序数据进行校正,得到一个组装效果较好的基因组序列。比对Fibroporia vaillantiir的rDNA序列获得毛木耳rDNA重复单元的完整序列,每个重复单元包含ETS、18S rDNA、ITS1、5.8S rDNA、ITS2、28S rDNA、IGS1、5S rDNA和IGS2,长度分别为398bp、1 790bp、156bp、156bp、206bp、3 432bp、2 247bp、121bp和2 135bp,总长度10 641bp,毛木耳rDNA有310个串联重复单元,转录组和系统发育分析均支持这一结果。与其他已报道的食用菌不同,毛木耳的IGS1、IGS2序列高度保守,其中IGS1的1 400-2 200bp区域在各拷贝之间没有多态性、而在品种之间有较高频率的SNP,这一片段序列有望用于品种鉴别研究。     

紫芝基因组rDNA序列特征及ITS2二级结构比较

紫芝栽培品种‘紫芝S2’(武芝2号)的ITS序列与NCBI数据库中5个紫芝菌株/分离株相似度高达99.79%-100%,在系统进化树上相聚成一类。本研究预测‘紫芝S2’基因组与参考基因组中的rRNA基因簇,分析rDNA结构及各构件序列间的多态性。从高质量‘紫芝S2’基因组中挖掘得到完整rDNA,序列全长40.377 kb,由4组串联重复的(18S、5.8S、28S、5S) rRNA基因簇组成,并含有完整的基因内间隔区(ITS1、ITS2)和基因间间隔区(IGS1、IGS2)。在紫芝S2的rDNA中,高度保守的28S rRNA基因间出现3个SNP和2个插入(1 bp,10 bp)位点;虽然第4条ITS2中有1个SNP位点,但紫芝S2的4条ITS2在二级结构上的分子形态高度一致,与ITS2数据库中其他紫芝菌株仅存在螺旋区间夹角的微小差异。由‘紫芝S2’基因组rDNA的ITS2生成的DNA条形码与二维码,可以作为该栽培品种鉴定与同源物种其他菌株鉴别的分子标记。     

从ITS序列探讨猪苓与其伴生菌的亲缘关系

对猪苓菌丝、野生猪苓子实体、野生猪苓菌核和其伴生菌的 5.8SrDNA及其两侧的ITS 1区和ITS2区进行了序列分析。发现猪苓与其伴生菌的ITS序列同源性达 99.36% ,说明猪苓与其伴生菌有着极高的分子亲缘关系。     

植物核基因组核糖体基因间隔区序列的结构特点及其在系统发育研究中的应用

目前,在植物系统发育研究中应用较多的核基因组的核糖体DNA基因间隔区序列主要有5S rDNA基因间隔区、内转录间隔区ITS和基因间间隔区IGS.虽然这些间隔区序列在长度、结构等方面各不相同,但都具有进化速率较快的特点,在植物属及属下分类水平的系统发育关系研究中非常有用.本文重点就核基因组的5S rDNA基因间隔区以及IGS在植物中的特点以及各自在植物系统发育研究中的应用进行了综述.     

中国南海硇洲岛潮间带产胞外蛋白酶的可培养海洋真菌多样性

【目的】研究中国南海硇洲岛潮间带产胞外蛋白酶的可培养海洋真菌多样性。【方法】从中国南海硇洲岛潮间带采集海水和沉积物样品,采用分离培养、蛋白酶生产菌平板检测法和基于内转录间隔区1-5.8S rRNA基因内转录间隔区2(ITS1-5.8S-ITS2)序列的系统进化分析法,研究产胞外蛋白酶真菌的多样性。【结果】采用50%海水配制的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养板从所采集的样品中分离、纯化并收集了198株真菌分离株,并采用ITS1-5.8S-ITS2序列PCR扩增、测序、BLAST和系统进化分析的方法成功鉴定了其中的178株。其中,有10株的ITS1-5.8S-ITS2序列与其在NCBI数据库中最匹配的ITS1-5.8S-ITS2序列的一致性<97,表明它们有可能是新的物种;其余168株的ITS1-5.8S-ITS2序列与NCBI数据库中已存在的相关ITS1-5.8S-ITS2序列的一致性均≥98%。这178株真菌归属为66个种,分布在子囊菌门和担子菌门的6纲,16个目,27个科的45个属中。其中的主要属为青霉菌属,占28.70%;其次为曲霉属,占11.24%。有83株真菌在加在脱脂奶粉的PDA固体培养板上的菌落周围有一透明圈,表明其可产生分泌胞外蛋白酶。【结论】从中国南海硇洲岛潮间带共分离、鉴定和收集了178株真菌,其中10株可能是新的物种,83株为胞外蛋白酶生产菌。     

阿萨希毛孢子菌的溶血活性及生物膜形成能力与其基因型关系研究

目的 分析临床分离自尿路感染患者的阿萨希毛孢子菌的体外溶血活性及生物膜形成能力与其基因型的关系,为临床诊治提供依据.方法 玻璃珠法提取总DNA,并采用PCR技术利用IGS1区特异性引物确定其基因型别;同时,平板法和XTT还原比色法分别检测阿萨希毛孢子菌的溶血活性及生物膜形成能力,并分析其与基因型的关系.结果 10株分离自尿路感染的阿萨希毛孢子菌基因型分别属于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ,其中以Ⅳ型为主;所分离菌株均具有不同程度的溶血活性;除1例分离株外,其余各分离株均具有在聚苯乙烯表面形成生物膜的能力;基因型Ⅲ型菌株具有较强的溶血活性和生物膜形成能力.结论 分离自尿路感染患者的10株阿萨希毛孢子菌以Ⅳ型为主,而其中Ⅲ型菌株表现出较强的溶血活性和生物膜形成能力.     

ITS/CHS1靶位序列分析结合SRAP分子标记技术鉴定Nannizzia incurvata临床分离株

以转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）和几丁质合成酶1（chitinase synthase 1,CHS1）为鉴定靶位,结合种系进化分析将2007年至2016年分离自头癣或面癣患儿的12株石膏样小孢子菌复合体成员（现被归入Nannizzia菌属）鉴定到种水平,其中5株为Nannizzia gypsea（Microsporum gypseum）,另7株为Nannizzia incurvata（Microsporum incurvatum）。在此基础上,通过序列相关扩增多态性（SRAP）分子标记进一步证实二者在DNA多位点存在扩增多态性。本研究证实在我国湖北地区存在Nannizzia incurvata,为我国开展Nannizzia菌属的分子流行病学研究提供了实验室依据和支持。     

绒泡菌目黏菌的ITS1-5.8S-ITS2二级结构的比较分析

为探讨核糖体DNA转录间隔区(r DNA ITS)的RNA二级结构在黏菌系统发育研究中的作用,以黏菌ITS通用引物PHYS4和PHYS5对绒泡菌目5属8种黏菌的r DNA ITS进行扩增和测序,利用RNA structure构建了ITS区的RNA二级结构模型。结果表明:ITS1在绒泡菌目黏菌中不能形成一个紧实的结构,但大部分物种都具有一段稳定的螺旋结构,可能对r RNA的成熟具有作用;5.8S r RNA的二级结构相似,由4个螺旋组成,主要为两种类型;基于5.8S r RNA和28S r RNA相互作用构建的ITS2的二级结构模型显示,它由一个封闭的多分支环和至少4个主要的螺旋组成,其中螺旋IV结构相对比较保守。由于ITS区的二级结构相比核苷酸序列更加保守,因此深入地分析其二级结构有助于认识其结构与进化的关系。     

青海地区萝卜黑心病病原

2018-2021年自青海西宁及其周边地区采集萝卜黑心病样品66份,采用组织分离法对样品进行分离并纯化,获得80株轮枝菌属菌株,编号为VL1-VL80。供试菌株在PDA上生长十分缓慢,培养后产生微菌核和轮枝状分生孢子梗。微菌核不规则形,53.91-164.42×8.91-29.81 μm,平均长宽比大于2。分生孢子透明且较长,5.35-9.31×2.12-4.78 μm,不产生厚垣孢子和休眠菌丝。ITS和ACT序列测定分析表明,供试菌株均属于长孢轮枝菌A1/D1株系。测定4株代表性菌株的ITS、ACT、EF、GPD、OX和TS的片段序列,分别构建ITS片段和多基因系统发育树,ITS发育树表明供试菌株与长孢轮枝菌位于同一个分支,多基因系统发育分析表明供试菌株与长孢轮枝菌A1和D1株系位于同一个分支。致病性测定结果表明,可侵染萝卜引起黑心病症状。以上研究结果表明,青海地区萝卜黑心病菌病原为长孢轮枝菌A1/D1株系,这是我国首次报道长孢轮枝菌A1/D1株系。     

26S rDNA-RFLP分析在非酿酒酵母菌分类研究中的应用

使用26S rDNA-RFLP分析,分析了分离自甘肃莫高葡萄酒厂的29株非酿酒酵母菌,被测菌株被分为10个类型。通过26S rDNA D1/D2区序列分析验证,证明此方法在葡萄酿酒酵母菌种多样性研究中良好的应用价值。     

ITS 假基因对栎属系统学研究的影响及其对分子系统学研究的启示*

核糖体rDNA ITS 是被子植物系统发育研究中应用最广泛的分子标记之一。以前人们认为同一物种
中的ITS 序列因致同进化而使不同拷贝高度一致, 在分子系统学研究中常以ITS1- 518S- ITS2 序列作为构建
系统进化树的基础。近年来, 在对一些被子植物的研究中发现这段序列在同一物种中具有多态性, 有些拷
贝中的518S 区不具编码功能, 人们把含有不具编码功能518S 区的ITS1-51 8S- ITS2 序列定义为ITS 假基因序
列, 它对同源基因致同进化的假设形成了新的挑战。在诸多应用ITS 序列重建系统进化关系的研究中, 栎
属系统学研究因ITS 假基因的发现而倍受关注。本文以栎属为例回顾了ITS 假基因的发现过程, 分析了其
对该属系统学研究的影响, 为分子生物学在植物系统进化研究中的应用提供一些新的参考。