以杆状病毒为载体在鸡原代骨骼肌细胞中表达IBDV VP2基因

摘要：【目的】本研究旨在构建在鸡原代骨骼肌细胞中表达IBDV病毒VP2基因的重组杆状病毒。【方法】从IBDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增VP2基因,将其克隆到自主构建的杆状病毒转移载体的CMV启动子之下,通过Bac-to-Bac系统获得VP2重组Bacmid,并将其转染Sf9昆虫 细胞,获得了VP2重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以50个MOI感染鸡原代骨骼肌细胞,接种72h后裂解细胞收获蛋白。【结果】蛋白样品经SDS-PAGE和Western blot证实VP2蛋白获得表达,分子量约48kDa,与预测蛋白大小一致,且能被IBDV阳性血清所识别。【结论】重组杆状病毒可以有效地将VP2基因导入鸡原代细胞,并在CMV的启动下表达具有抗原性的VP2蛋白,本研究为研制IBDV及其他重要禽类传染病的杆状病毒载体疫苗奠定了基础。     

利用杆状病毒表达幽门螺杆菌cagA基因

幽门螺杆菌cagA基因克隆到杆状病毒表达系统的pBlueBacHis2A转移载体中,将重组质粒pBlueBacHis2A-CagA与亲本病毒Bac-N-blue DNA共转染Sf9细胞,以空斑法纯化获得的重组杆状病毒.经PCR法鉴定后进行扩增培养,SDS-PAGE和Western bolt检测结果证实所表达的蛋白为CagA蛋白,间接ELISA分析表明,表达产物可与Hp感染者血清发生特异性的免疫反应.     

在昆虫细胞中表达能自聚成病毒样颗粒的兔出血症病毒衣壳蛋白

将兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBAC 4,获得重组转移载体pBLUEBAC4-VP60.在脂质体转染试剂介导下,将重组杆状病毒转移载体pBLUEBAC4-VP60 与线性化的野生型杆状病毒基因组DNA共转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,经过三轮蚀斑纯化后,获得了克隆化的重组杆状病毒pBLUEBAC4-VP60.以重组杆状病毒感染Sf9细胞后,收获细胞培养上清和细胞裂解液上清,SDS-PAGE电泳分析显示,重组病毒pBLUEBAC4-VP60表达一分子量各为60kD左右的特异性重组蛋白,并且该重组蛋白经Western blot检测,皆可被兔抗RHDV高免血清所识别,表明VP60蛋白基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中得到了表达,并且具有与天然VP60相似的抗原性.血凝试验表明,表达的重组蛋白具有血凝特性,可以凝集人"O"型红细胞,血凝价为213.同时,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制.经电镜观察,重组病毒表达的衣壳蛋白可以在没有其他任何成分存在的条件下,在昆虫细胞内也能自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(VLPs).在与兔抗RHDV高免血清37℃作用1h后,该病毒样颗粒于电镜下观察可出现凝集成团的现象,表明该VLPs与天然RHDV在抗原性上也极为相似.     

庚型肝炎病毒包膜糖蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达

用PCR扩增出HGV E2全基因,克隆进杆状病毒表达载体pFASTBACHTa中,构建成重组转座载体pFASTBAC-E2,转化DH10BAC大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性菌落,抽提大分子质粒DNA,获得含HGV E2基因的重组杆状病毒穿梭载体,转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞,出现细胞病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Sf9单层细胞及甜菜夜蛾幼虫,分别收集Sf9细胞和甜菜夜蛾幼虫体内的血淋巴细胞,进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见表达的融合蛋白带,经亲和层析进行蛋白纯化,用ELISA方法检测各类血清标本,初步研究HGV E2糖蛋白的抗原性.     

利用杆状病毒表达幽门螺杆菌cagA基因

幽门螺杆菌cagA基因克隆到杆状病毒表达系统的 pBlueBacHis2A转移载体中 ,将重组质粒 pBlueBacHis2A CagA与亲本病毒Bac N blueDNA共转染Sf9细胞 ,以空斑法纯化获得的重组杆状病毒。经PCR法鉴定后进行扩增培养 ,SDS PAGE和Westernbolt检测结果证实所表达的蛋白为CagA蛋白 ,间接ELISA分析表明 ,表达产物可与Hp感染者血清发生特异性的免疫反应     

水稻条纹病毒RNA聚合酶在昆虫细胞中的表达

[目的]利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)RNA聚合酶(RdRp)基因。[方法]RT-PCR扩增RdRp基因功能区片段,克隆于转移载体p Fast Bac HTb上,转化到大肠杆菌DH10Bac中,得到重组杆状病毒表达载体Bacmid-rp。提取Bacmid-rp DNA,转染Sf9细胞获得重组病毒v Ac-rp。将重组病毒v Ac-rp感染Sf9细胞使目的蛋白在细胞内表达,并利用亲和层析纯化,SDS-PAGE检测RdRp的表达情况。将纯化的RdRp蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot分析RdRp的免疫原性。[结果]RSV RdRp基因功能区能够在Sf9细胞中表达,蛋白分子量约为45k Da,与预测大小一致,且可与RdRp抗血清发生特异性反应。[结论]在真核细胞中成功表达了RSV RdRp,并得到了纯化的RdRp和其多克隆抗体。     

用杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达马立克病病毒pp38基因

鸡马立克病病毒(MDV)38kd磷蛋白(pp38)基因中包括起始密码子和终止密码子的完整编码序列被整合进杆状病毒AcNPV的转移载体质粒pVL1392,用所得的含pp38基因的重组转移载体质粒pVLpp38I与野生型杆状病毒AcNPV的DNA共转染昆虫传代细胞系Sf9细胞后,用荧光抗体法以抗MDV单克隆抗体H_(19)筛选到能表达MDVpp38的重组杆状病毒克隆BP38 I。免疫印迹试验表明,在重组病毒BP38 I感染的Sf9细胞溶解物中,可表现一条分子量约为35—36kd的为单克隆抗体H_(19)识别的MDV特异性蛋白带。     

杆状病毒用于哺乳动物细胞快速高效表达外源基因的研究

现已发现杆状病毒可进入某些培养的哺乳动物细胞,这提示可将杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。对杆状病毒转移载体的改造及对哺乳动物细胞的基因转移方式进行了进一步的研究。以绿色荧光蛋白基因为报告基因,利用Bac-to-Bac系统构建了分别含有正向和反向CMV启动子表达盒的两种重组杆状病毒。可观察到CMV启动子在Sf9细胞中可启动报告基因的表达,但表达效率较低。用重组杆状病毒感染后Sf9细胞的培养上清直接与HepG2细胞作用,以流式细胞术检测基因转移效率及荧光表达强度,发现这两种病毒在相同的感染复数下对HepG2细胞具有相似的基因转移及表达效率。同时,利用流式细胞术进一步研究了直接使用重组杆状病毒感染4d后Sf9细胞的培养上清对哺乳动物细胞进行基因转移的方法。通过对HepG2细胞的实验结果显示,将带毒Sf9细胞培养上清(1.2×10⁷PFU/mL)用哺乳动物细胞培养基1倍稀释后,37℃下孵育靶细胞12h(moi=50),可达到较高的基因转移及表达效率,同时不会对细胞造成明显损伤。将重组杆状病毒与脂质体和逆转录病毒这两种系统对HepG2及CV1细胞的基因转移效率进行了比较,结果发现在同样未经浓缩等特殊处理的条件下重组杆状病毒对这两种细胞的基因转移效率是最高的。因此可以认为,经过适当改造后的Bac-to-Bac重组杆状病毒系统可作为一种对哺乳动物细胞简便高效的基因转移表达载体。     

禽呼肠孤病毒σC基因在杆状病毒表达系统中的表达及其活性鉴定

本研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σC基因的杆状病毒,感染sf9细胞获得表达重组蛋白。首先,将ARVσC基因克隆至pFastBacHTA载体,构建重组供体载体pFσC,将其转化大肠杆菌DHl0Bac感受态细胞,使σC基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidσC。通过脂质体介导将其转染到sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rBacσC。通过Western Blot、间接免疫荧光试验(IFA)进行检测,结果显示:σC蛋白在重组杆状病毒rBacσC感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达,分子质量约为37kD,表达的σC蛋白具有良好的反应活性。     

甲型H1N1流感病毒HA基因在昆虫细胞中的截短表达

目的:利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System表达重组HA蛋白,Western blot及IFA方法鉴定其表达。方法:采用PCR方法扩增A/California/04/2009(H1N1)HA基因,将其克隆到pFastBacHT A载体上,重组质粒pFastBacHT-HA经双酶切及测序鉴定正确后,转化阳性重组载体进入E.coli DH10Bac感受态细胞中,通过Bluo-gal蓝白斑筛选、PCR鉴定获得重组转座子rBacmid-HA。从重组转座子中提取rBacmid-HA质粒DNA转染sf 9昆虫细胞,制备重组杆状病毒。重组杆状病毒感染sf 9细胞表达重组蛋白,Western blot及IFA鉴定重组蛋白表达情况。结论:成功构建了甲型H1N1流感病毒HA基因的昆虫杆状病毒表达载体,该表达载体转染昆虫细胞后制备的重组杆状病毒病毒滴度较高,重组杆状病毒表达的重组蛋白经Western blot 及IFA 鉴定后具有良好的免疫反应原性。     

昆虫杆状病毒系统表达口蹄疫病毒3ABC基因

以O型口蹄疫病毒为研究对象,经过RTPCP扩增得到非结构蛋白3ABC基因,克隆到转移载体pFastbacHT,将其转入含穿梭载体Bacmid的DH10Bac,与Bacmid发生位点特异性转座作用,得到3ABC的重组穿梭载体Bacmid3ABC,再将其转染昆虫细胞HiFive。PCR鉴定证实3ABC基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,经过SDSPAGE和Westernblot检测,3ABC基因在昆虫细胞中表达了大小约为50kDa的蛋白条带,3ABC基因在BactoBac系统中的成功表达为建立以基因工程产品为抗原、鉴别诊断自然感染和免疫动物的方法提供了技术条件。     

以杆状病毒为载体表达可溶性55kD人肿瘤坏死因子受体

从培养的HeLa细胞中提取总RNA,通过反转录PCR技术, 从该总RNA中扩增了约530 bp的shTNFR55基因的cDNA,将cDNA克隆至转移载体pAcGp67B的多角 体蛋白基因启动子的下游与转移载体构建成重组转移质粒pAcTNFR。pAcTNFR与杆状病毒AcNP V的DNA共转染昆虫细胞sf9,通过同源重组形成含有shTNFR55基因的重组病毒。经空斑分析 和DNA斑点杂交获得了纯化的重组病毒AcNPVTNFR。采用肿瘤坏死因子(TNF)敏感的L929细 胞检测表达产物的生物学活性。结果表明表达产物可以中和TNF对L929的细胞毒性。蛋白配 基印迹(Ligand blot)分析表明表达产物分子量约在20～25kD之间,有三条带。     

新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用

用RT-PCR方法扩增出新城疫病毒标准强毒株F48E8的F基因,并将其克隆到pGEM-T载体,命名为pGEM-NDF。鉴定正确后,以BamHI和XbaI双酶切将F基因从pGEM-NDF中释放出来,并插入到pFastBacI载体中,得到重组转移载体pFast-NDF。然后将该重组质粒转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中,通过转座作用获得重组穿梭质粒reBacmid-NDF。再用reBacmid-NDF转染Sf9昆虫细胞,获得含有新城疫病毒F48E8株F基因的重组杆状病毒。间接免疫荧光和Western-blot分析结果表明F蛋白在昆虫细胞中获得表达,而且主要表达于细胞膜上,并使感染重组杆状病毒的昆虫细胞在96h发生融合作用。动物试验表明,表达的F蛋白能够产生中和抗体。本文的研究结果为F蛋白的进一步开发奠定了基础。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在昆虫细胞中的表达、鉴定及免疫原性分析

目的:利用昆虫-杆状表达系统建立表达和纯化分泌形式的水痘-带状疱疹病毒(varicellazoster virus,VZV)糖蛋白gE的方法,并鉴定其理化性质及免疫原性。方法:利用Gibson assembly同源重组试剂盒快速构建重组质粒pFastbac-VZV gE。在sf9昆虫细胞中鉴定序列优化前后表达量的差异,并在High FiveTM细胞中大量表达。通过Ni-NTA亲和层析方法得到高纯度gE蛋白,之后通过酶联免疫吸附试验等验证了其理化性质,并进行小鼠免疫分析其免疫原性。结果:构建了pFastbac-VZV g E1/2重组质粒,经过PCR及双酶切鉴定后均为阳性克隆。使用BAC/PAC试剂盒提取Bacmid转染sf9细胞制备杆状病毒,经Western blot检测,sf9细胞开始表达gE蛋白且随着病毒代次升高g E蛋白表达量增加。序列优化后表达量明显增加,但是大部分以胞内形式存在。通过Ni-NTA一步亲和层析获得纯度较高的gE蛋白,并与VZV单抗9C8具有较好的反应性。通过免疫小鼠产生高滴度抗体,且免疫荧光结果显示其血清可以与天然病毒上的gE抗原结合。结论:成功获得了杆状表达系统表达的gE蛋白并且纯化和鉴定了蛋白质的性质及免疫原性,为进一步研发具有自主产权的VZV亚单位疫苗研究奠定了基础。     

J亚群禽白血病病毒跨膜蛋白gp37基因克隆与表达

禽白血病病毒(ALV)跨膜蛋白(TM)在病毒-细胞融合过程中起关键作用,其蛋白内部存在的许多高度保守序列有可能成为抗病毒的重要靶点。对TM结构和功能的深入研究将为抗禽白血病病毒乃至其它反转录病毒相关制剂的研制提供科学的理论基础。本研究通过PCR从本实验室分离的ALV-J山东汶上毒株获得表达TM的gp37基因,克隆连接pMD18-T载体并测序,从已构建的质粒pMD18-T-gp37中酶切回收gp37基因,构建重组转移载体pFastBacHTb-gp37。利用昆虫杆状病毒表达系统对gp37基因进行表达,通过间接免疫荧光和Western blot检测gp37基因表达产物,间接免疫荧光显示,重组杆状病毒感染的sf9细胞呈现明显的强阳性反应;Western blot分析,重组病毒感染的sf9细胞蛋白显示出约21kD的阳性条带。结果表明,gp37基因在sf9细胞内表达成功。     

GII型诺如病毒VP2蛋白在昆虫细胞中的表达与定位研究

【目的】利用杆状病毒表达系统表达诺如病毒(GenegroupⅡ)VP2蛋白,分析其亚细胞定位,为深入研究VP2蛋白的功能奠定基础。【方法】设计可扩增完整ORF3基因片段的引物P1和P2,在下游引物中引入6×His标签的编码序列,从质粒pMD-ORF3中克隆了含有6×His编码序列的ORF3基因,与pFastBac1载体连接,构建重组质粒pFB-ORF3,转化DH10Bac感受态细胞获得重组杆状病毒基因组Bac-ORF3,脂质体介导转染sf9昆虫细胞获得表达VP2蛋白的重组杆状病毒Ac-VP2,感染sf9细胞后,收集病变细胞,采用抗6×His标签的单克隆抗体作为一抗进行Western blot与间接免疫荧光实验鉴定。【结果】Western blot实验证实Ac-VP2感染的sf9细胞在约29 kD处出现特异性条带;间接免疫荧光实验证实Ac-VP2感染的sf9细胞出现特异性绿色荧光,并且VP2主要定位于sf9的细胞核与细胞膜。【结论】诺如病毒VP2蛋白在Ac-VP2感染的sf9细胞中获得成功表达,并且主要定位于sf9细胞的细胞核与细胞膜。     

口蹄疫病毒NSP 3ABC基因在昆虫细胞中的分泌表达及其活性检测

用设计的特异引物,扩增得到了N-端带有6×His编码序列的口蹄疫病毒完整3ABC基因序列,并将其亚克隆入带有蜂毒溶血肽序列的穿梭质粒pMelBac-B中,构建了重组质粒pMel-3ABC。将该重组质粒与杆状病毒骨架DNABac-N-BlueTM共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒。重组病毒感染Sf9昆虫细胞,采用通过SDS-PAGE和Western blot检测,证明目的基因在昆虫细胞中得到了正确的表达,表达产物分泌至细胞培养上清中,并具有良好的生物活性。表达的目的蛋白经过镍柱亲和层析法纯化后,用间接ELISA方法检测与口蹄疫病毒感染动物血清的反应性,证明表达目的蛋白与感染动物血清有很好的反应性而与正常动物以及免疫动物血清不发生反应。该研究为建立一种更加敏感和特异的口蹄疫病毒感染动物与疫苗免疫动物的鉴别诊断方法奠定了基础。     

口蹄疫病毒NSP 3ABC基因在昆虫细胞中的分泌表达及其活性检测

用设计的特异引物,扩增得到了N-端带有6×His编码序列的口蹄疫病毒完整3ABC基因序列,并将其亚克隆入带有蜂毒溶血肽序列的穿梭质粒pMelBac-B中,构建了重组质粒pMel-3ABC。将该重组质粒与杆状病毒骨架DNA Bac-N-Blue^TM共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒。重组病毒感染Sf9昆虫细胞,采用通过SDS-PAGE和Western blot检测,证明目的基因在昆虫细胞中得到了正确的表达,表达产物分泌至细胞培养上清中,并具有良好的生物活性。表达的目的蛋白经过镍柱亲和层析法纯化后,用间接ELISA方法检测与口蹄疫病毒感染动物血清的反应性,证明表达目的蛋白与感染动物血清有很好的反应性而与正常动物以及免疫动物血清不发生反应。该研究为建立一种更加敏感和特异的口蹄疫病毒感染动物与疫苗免疫动物的鉴别诊断方法奠定了基础。