海南捕鸟蛛毒素—IV的化学合成与氧化复性

应用芴甲氧羰基 (Fmoc)固相方法化学合成了海南捕鸟蛛毒素 IV ,并通过反相HPLC对不同条件下的氧化复性结果进行监测 ,从而摸索出海南捕鸟蛛毒素 IV的最适氧化复性条件 :0 .1mol/LTris HCl和 0 .1mol/LNaCl缓冲液、pH 8.0、样品浓度为 0 .1g/L、5mmol/LGSH、0 .5mmol/LGSSG。复性产物经质谱测定为 3988.70 ;而与天然毒素混合进行HPLC分析时也得到了单一峰 ;膈神经 膈肌标本测活实验表明 ,合成毒素具有与天然毒素相同的生物学活性 ,从而可推断两者在结构和功能上具有一致性。     

用疏水色谱法复性并同时纯化重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

目的：建立一种简单、快速复性并同时纯化大肠杆菌表达的重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）的方法。方法：研究rhGM-CSF在疏水色谱（HIC）上的复性和纯化机理,并对固定相和流动相进行选择和优化,包括固定相配基、流动相中盐的种类、流动相pH值、流动相中还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比例,以及流动相中尿素的浓度。结果：优化后的固定相为PEG600,流动相中的盐为（NH4）2SO4,流动相pH值为7．0,流动相中添加2．0mol／L尿素、1．8mmol／LGSH和0-3mmol／LGSSG。在优化条件下,HIC可使rhGM-CSF在分离纯化的同时得到复性,比活达1．58×10^7U／mg,纯度为95．7％,质量回收率为56．8％。结论：建立的疏水色谱复性和纯化工艺可简化操作步骤,缩短生产周期。     

咖啡因和茶碱对大鼠皂素蜕膜心肌肌钙蛋白Ca~(2 )敏感性和肌浆网Ca~(2 )释放的影响

在低浓度皂素（50μg／ml）制备的浆膜蜕变（通透性增高）而肌浆网（SR）膜无损的蜕膜心肌标本上,以其收缩的幅度作为SRCa(2 )释放的半定量指标;高浓度皂素（500μg／ml）制备的浆膜和SR膜均蜕变的蜕膜心肌标本,以其张力-PCa关系曲线以及产生50％最大张力所需的Ch(2 )浓度（PCa50）分别作为肌钙蛋白（TN）Ca(2 )敏感性的定性和定量指标。结果观察到：（1）在低浓度皂素蜕膜心肌标本上,5和10mmol／L咖啡因分别引起约89．2±12．7和142．5±17mg（n＝4,P＜0．05）张力的强直收缩,而5mmol／L茶碱未能引起明显的强直收缩;（2）在高浓度皂素蜕膜心肌标本上,5和10mmol／L咖啡因及5mmol／L茶碱均使张力-pCa关系曲线左移;PCa50较对照分别增加了0．261,0．274和0．212PCa单位（P均小于0．001）。上述结果提示：咖啡因和茶碱均能增高TNCa(2 )敏感性;此外,咖啡因尚有促使SR释放Ca(2 )的作用。     

乳酸堆积和二氯乙酸钠对肝癌细胞凋亡及bax、bcl-2表达和caspase-3活性的影响

目的：探讨乳酸堆积和二氯乙酸钠（OCA）对肝癌细胞（HepG2）凋亡和bax、bcl-2表达及caspase-3活性的影响。方法：通过体外培养HepG2,建立稳定的体外培养模型,配制成终浓度分别为0mmol／L、1．0mmol／L、2．0mmol／L、4．0mmol／L、8．0mmol／L的乳酸培养液以及在不同浓度乳酸组中加入终浓度为10^-3mmol／LDCA培养液与HepG2共同培养,其中以0mmol／L乳酸组为对照组。采用MTT法检测乳酸对HepG2的抑制率,流式细胞仪检测乳酸和DCA对HepG2的凋亡百分率,用Real-time PCR法测定bax及bcl-2mRNA的表达,用免疫荧光法检测caspase-3的活性。结果：乳酸对HepG2的IC50值为13．6mol／L,与对照组比较,随着乳酸浓度的增加,HepG2凋亡率增加,baxmRNA表达升高,bcl-2mRNA的表达降低,caspase-3活性增加,其中1．0mmol／L乳酸组与对照组比较（P〉0．05）,2．0mmol／L,4．0mmol／L和8．0mmol／L乳酸组与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。加入DCA后．HepG2凋亡减少,2．0mmol／L乳酸＋DCA组、4．0mmol／L乳酸＋DCA组、8．0mmol／L乳酸＋DCA组与同浓度的乳酸组比较,baxmRNA表达减少（P〈0．05）,bcl-2mRNA表达增加（P〈0．05）,caspase-3活性减低（P〈0．05）。结论：乳酸可诱导HepG2凋亡,且随着乳酸浓度的增高,HepG2的凋亡率增加,其机制可能是通过对bcl-2及baxmRNA表达的改变以及激活caspase-3活性而实现,DCA可以降低HepG2凋亡,对乳酸堆积造成的HepG2凋亡有抑制作用。     

利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶

将来源于软化类芽孢杆菌（Paenibacillus macerans）的α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-CGT）基因插入含pelB信号肽的质粒pET-20b（＋）中,构建了表达载体pET-20b（＋）／cgt,并将其转化表达宿主E.coli BL21（DE3）。对重组菌E．coli BL21／pET-cgt进行摇瓶发酵条件的优化,确定了其胞外表达α-CGT酶的最适条件：葡萄糖8g/L,乳糖0．5g/L,蛋白胨12g/L,酵母膏24g/L,K2HPO472mmol／L,KH2PO417mmol／L,CaCl2 2．5mmol／L;初始pH为7．0,诱导温度为25℃。在该条件下培养90h后最终α-CGT酶的胞外比活达到22．1u／mL,与来源菌Pmacerans所产天然酶比活相比提高了42倍,实现了α-CGT酶的高效生产。将基因工程菌在上述条件下于3L发酵罐中发酵,90h后胞外酶比活达到22．6U／mL,证实了工业化放大的可能性。     

草甘膦对可食用蓝藻葛仙米生长和生理的影响

葛仙米（N．sphaeroides）的产量和产地面积逐年减少,这可能与当地广泛使用除草剂草甘膦有关。为此,本文测定了不同浓度（0．15、0．30、0．45、0．6mmol／L）的草甘膦处理的葛仙米的颗粒大小、干重、叶绿素荧光、叶绿素浓度。所有测量参数与浓度和时间显著相关：0．15mmol／L处理组的颗粒直径较对照组小15％（2d后）;叶绿素a浓度和最大量子产率（Fv／Fm）在最高浓度组（0．6mmol／L）4d后开始受到影响;第8天,相对生长速率（以干重计算,大于0．15mmol／L）、光合作用活性（大于0．3mm01／L）均受显著抑制,其中0．15mmol／L处理组相对生长下降60％,而更高浓度处理组出现负生长,0．6mm01／L组藻体漂白死亡。结合实验结果,文章讨论了草甘膦的毒性机理及其对葛仙米（N．sphaeroides）的潜在影响。     

高脂血症大鼠血小板活化功能分析

目的分析高脂血症大鼠血小板功能的变化。方法24只Wistar大鼠随机分为正常对照组、高脂血症模型组,4周后检测两组大鼠的血脂：总胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。应用流式细胞术检测血小板表面a-颗粒膜糖蛋白（CD62P）的表达、酶联免疫法测定血浆中α颗粒膜蛋白．140（GMP140）浓度。所有数据采用Excel软件建库,SPSS11．5统计软件进行分析。结果正常对照组与高脂血症组CHO、TG、LDL-C、HDL-C,CHO分别是1．846mmol／L VS 13．779mmol／L、0．999mmol／L vs 0．746mmol／L、0．164mmol／L vs 10．680mmol／L、0．583mmol／L vs 0．195mmol／L。CD62P、GMP140水平分别为10．089％ vs 25．169％、10．665ng/mL vs 27．045．g／mL。结论高脂血症能够促使血小板活化。     

化学合成ω-芋螺毒素MⅦA的复性与质谱分析

为了探讨质谱分析在合成多肽氧化复性和分离纯化研究中的应用,用固相多肽合成方法合成ω－芋螺毒素MⅦA,在含谷胱甘肽的缓冲体系中进行氧化复性后,经离子交换和RP－HPLC分离纯化。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI－TOF－MS）和电喷雾串联质谱（ESI－MS／MS）分析ω－芋螺毒素MⅦA氧化复性和分离纯化的效果,最后用电生理学实验测定复性ω－芋螺毒素MⅦA的生理活性。其结果表明,获得的ω－芋螺毒纱MⅦA纯化复性样品具有与天然ω－芋螺毒素MⅦ完全相同的空间构象和生理活性。     

ALA—PDT对正常人角质形成细胞生物效应的实验研究

目的：探讨ALA—PDT抑制角质形成细胞（KC）增殖的可行性和最佳效果。方法：新鲜包皮组织经两次酶消化法进行KC分离与培养,分设对照组、单纯ALA组、单纯照光组及0．1mmol／L、0．6mmol／L、1．2mmol／L、1．8mmol／L、3．6mmol／LALA五个浓度组,经0．5h、1h、3h、5h四个避光孵育时间后PDT。酶标仪检测PDT后KC存活率、FCM检测KC中PpⅨ荧光强度,确定ALA最佳药物浓度和最佳用药时间;吖啶橙染色和Annexin V／PI双染法检测KC凋亡率和生长周期的影响。结果：0．6mmoL／LALA（用药1h）-PDT组为最佳药物浓度和最佳用药孵育时间,显示Pp Ⅸ荧光强度表达与KC凋亡率最高,能明显抑制S期与G2期的细胞增殖,使细胞增殖指数降至最低。结论：0．6mmol／LALA（用药孵育1h）-PDT能明显抑制KC增殖,更有效地促进正常KC凋亡。     

益智ISSR-PCR反应体系建立与优化

目的：获得适合的益智ISSR-PCR扩增反应体系。方法：利用正交设计L46（4^5）和单因素试验对益智ISSR-PCR反应体系的5因素（Taq酶,Mg^2＋,模板DNA．dNTPs,引物）在4个水平上进行优化试验,将二者所得结果进行综合比较分析。结果：最终扶得益智ISSR-PCR反应的最优体系（20μl）为：模板DNA 100ng,Mg^2＋ 3．0mmol／L,引物0．8μmol／L,dNTPs0．25mmol／L,Taq DNA聚合酶1．0U。最后,对益智ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火,得到最佳退火温度为50℃。结论：这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术研究分析益智遗传多样性奠定基础。