t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达

应用ＰＣＲ方法,在ｔ－ＰＡ ｃＤＮＡ５＇端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建表达质粒ｐＳＴＥ－Ｙ,利用ＬｉＣｌ转化法转化酵母菌ＹＳ１０８,在ＭＭ和ＭＤ平板上筛选表型,ＰＣＲ筛选ｔ－ＰＡ ｃＤＮＡ与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证明表达产物的分子量为６ｋＤａ左右,用酪蛋白板溶圈法测定ｔ－ＰＡ的活性。Ｍｕｔ＾ｓ表型菌表     

人Mn-SOD cDNA的克隆及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

以人肝细胞株(L02)总RNA为模板,用RT-PCR扩增出人锰超氧化物歧化酶(hMn-SOD)cDNA,将其插入含有AOX1基因启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组质粒pPIC9k-MnSOD,转化毕赤酵母GS115,筛选出整合了多拷贝hMn-SOD基因的Mut^ 表型菌株,摇瓶培养,0．5％甲醇诱导表达。SDS-PAGE分析显示,诱导4d的培养上清中hMn-SOD的表达量约为上清总蛋白的32％,酶比活可达247、7u／mg。hMn-SOD在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌性表达。     

glyA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已知的序列设计引物,以大肠杆菌XL10-Gold总DNA为模板进行梯度PCR,并进行DNA序列测定,其序列与已经报道的glyA基因完全一致。将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905C上,获得表达质粒pHBM1001.该质粒转化毕赤酵母GS115所得重组子经PCR验证后成功进行了诱导表达,并初步测定了酶活力。     

TIMP-2在毕赤酵母中的克隆与表达

为了克隆人基质金属蛋白酶组织抑制剂-2（TIMP-2）基因,并在Pichia pastoris中表达,根据GenBank上的TIMP-2的氨基酸序列和毕赤酵母偏爱密码子,通过化学合成和PCR相结合的方法获得了人的TIMP-2基因全长序列,构建了pPIC9-T2表达载体,电击转化到毕赤酵母,通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌,并对表达产物进行了分离纯化和生物学活性分析。     

纳豆激酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

纳豆激酶纳是从日本传统食品纳豆中发现的一类具有溶栓效果的蛋白酶,由于其具有安全,高效,作用时间长,易吸收,廉价等优点,现在正成为一个开发治疗血栓类疾病药物的研究热点。从本实验室保存的一株高溶栓的纳豆杆菌N07出发,提取总基因组DNA,利用PCR手段扩增获得了纳豆激酶长为825bp的成熟肽基因片段。构建重组表达质粒pPICZaA-NK,经EcoR I、Xba I双酶切、PCR、测序验证得出重组表达质粒上的外源基因即为825bp的目的片段;将重组质粒pPICZaA-NK用内切酶Sac I线性化后电击导入毕赤酵母X33,通过含Zeocin的YPDS平板筛选获得重组酵母。重组酵母在BMMY培养基中发酵培养,用1%甲醇诱导目的蛋白表达。用纤维蛋白平板法检测发现发酵上清具有纤溶活性,经硫酸铵盐析、透析、Sephadex-G50过柱等步骤分离得到纳豆激酶蛋白,进行SDS-PAGE鉴定表明,表达的纳豆激酶蛋白分子量为27KD。以尿激酶为标准,实验所得纳豆激酶发酵上清液溶栓活性约为195U/mL。成功的将纳豆激酶成熟肽基因在毕赤酵母X33中表达,为纳豆激酶基因工程进一步研究奠定基础。     

狐狸生长激素基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

为制备重组狐狸生长激素(fGH),采用RT-PCR方法,从银狐垂体中扩增fGHcDNA基因,利用SnaBI和NotI位点将fGH基因插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信号肽的下游,构建成fGH基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K/fGH,载体经SalI酶切线性化后,通过电转移将线性化的pPIC9K/fGH转化到组氨酸缺陷型酵母宿主菌GS115中。然后利用不含氨基酸的以葡萄糖为碳源的培养基(MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His+型和甲醇利用正型(Mut+)酵母重组体,再经G418加压筛选出高拷贝fGH基因的重组酵母,经摇瓶发酵培养和甲醇诱导使fGH进行分泌表达。结果表明本实验扩增的fGH基因序列与GenBank发表的序列基本一致,发酵液经SDS-PAGE和Western blotting检测证明构建的重组酵母能够分泌表达fGH,表达的fGH占发酵液总蛋白的34%,表达量达119mg/L发酵液。     

米曲霉木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建米曲霉木聚糖酶基因的真核表达载体,并转化巴斯德毕赤酵母,进行分泌表达。方法:以米曲霉总RNA为模板,根据已知的米曲霉木聚糖酶基因序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆木聚糖酶基因cDNA序列,将其与pPIC9K质粒连接构建表达载体后转化毕赤酵母,经MM/MD快慢斑筛选,得到Muts型重组子,进行甲醇诱导表达。结果:克隆得到的cDNA序列全长666 bp,连续编码221个氨基酸;阳性克隆子在诱导培养数天后,将菌液点于RBB-木聚糖平板上,产生了明显的透明圈,表明重组木聚糖酶在毕赤酵母中获得表达。结论:木聚糖酶基因的真核表达载体构建成功,并能够在毕赤酵母中表达。     

酸性木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

运用“鸟枪法”克隆构建了环境微生物的基因组文库,并从中筛选得到一个酸性木聚糖酶基因,命名为xyl3,其在GenBank中的登录号为gb：AY300805。BLAST分析表明,该基因的序列同源性很低,其中仅存在很短的木聚糖酶基因的同源片段,其编码的木聚糖酶属于Glycosyl hydrolases family 10,与来源于Geobacillus stearothermophilus的intra—cellular xylanase在氨基酸水平具77％同源性。该基因经T4 DNA polymerase处理后,克隆至经限制性内切酶CpoⅠ和NotⅠ双酶切后的毕赤酵母表达载体pHBM905,获得重组质粒pHBM706。此重组质粒转化毕赤酵母GS115,经含有交联木聚糖的选择性培养平板和PCR扩增鉴定筛选得到重组毕赤酵母GS115（pHBM706）。以0．5％甲醇于28℃诱导产酶,测得重组毕赤酵母GS115（pHBM706）在诱导的第36h产酶达最高值,所产粗酶液酶活为0．177IU／mL。该酶的最适反应pH为5．5,最适反应温度为50℃。     

耐碱性甘露聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

通过功能平板从土壤中筛选得到含甘露聚糖酶基因的耐碱菌株。构建其基因组文库,从中筛选到甘露聚糖酶基因TM1并测序分析,用BLAST分析表明,TM1的氨基酸序列与其他在GenBank发表的甘露聚糖酶的氨基酸序列的同源性均低于60%,故确定其为一个新的甘露聚糖酶基因(GenBank登录号为AY623903)。将此基因去除信号肽后的编码序列克隆到表达载体pHBM905C上,得到重组质粒pHBM1201。经SalⅠ酶切后分别转化毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71、GS115、SMD1168,得到分泌表达的重组毕赤酵母。挑选相对表达量最高的重组毕赤酵母SMD1168-3在摇瓶中诱导产酶,对该酶的粗酶进行酶学性质分析表明,其最适反应温度为55℃,最适PH值为7.5,以魔芋粉为底物所测得的最高酶活为41.8U,半衰期为1h,在80℃保温5min其酶活由最初酶活的77%下降到11%,温度下降到55℃后活性可恢复到最初酶活的60%以上。     

mMR-1基因的克隆和在毕赤酵母中分泌表达

hMR-1为本实验室首次克隆发现的一个人类新基因 ,是一种和三种肌肉收缩蛋白及多种细胞信号蛋白具有相互作用的膜蛋白。经与鼠基因组数据库进行同源分析后设计合成引物 ,利用RT-PCR技术从小鼠C57BL 6J脾脏T淋巴细胞总RNA中反转录得到鼠源MR-1基因 (mMR-1) ,提交GenBank ,收录号 (AY2 99972 )。序列分析证明其与人源MR-1基因 (hMR-1)同源性为 90.1%。构建表达载体pPIC9 mMR-1电转化PichiapastorisGS115 ,筛选得到整合分泌表达mMR-1蛋白的重组酵母菌株。表达目的蛋白分子量 25kD ,诱导 5d时产量达到 50mg/L ,通过Westernblot验证了表达产物的正确性。本研究为进一步研究新基因MR-1的生物学功能奠定了基础。     

抗菌肽Magainin基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达

用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽magainin基因片段 ,合成片段拼接后 ,与pUC19重组 ,获得magainin基因 .Magainin基因与酵母表达载体pPIC3重组 ,构建胞内表达载体pPIC3 Mag ,电击法转化GS115宿主菌 ,经表型筛选和PCR鉴定证实了目的基因已稳定整合入Pichiapastoris酵母基因组中 .阳性克隆用甲醇诱导表达 ,用免疫印迹法确定了产物的正确性 .利用琼脂孔穴扩散法和液相测定法证明了重组magainin具有抗菌活性     

血管生成抑制因子K4K5 Cdna基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

应用PCR方法,扩增人纤溶酶原cDNA基因中K4K5 cDNA片段,与酵母表达载体pPIC9K重组,获得表达质凿p9kkk-18。该质粒转化毕赤酵母菌GS115,用G418－YPD筛选高拷贝表型,PCR筛选K4K5 cDNA与酵母染色体整全形成的阳性克隆,阳性克隆用甲醇诱导表达。表达产物r-K4K5分子量约21.5kD,占分泌总蛋白80％以上,产物浓度为150－250mg/L。初步纯化产物抑制牛毛细血管内皮（BCE）细胞增殖与鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成。     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分泌、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势,现已广泛用于外源蛋白的表达。该文综述了其自身的优点,表达载体和宿主菌的特点,以及高水平表达外源基因的策略。     

地鳖虫纤溶活性蛋白cDNA序列克隆与毕赤酵母表达

依据已报道的地鳖虫成熟肽cDNA序列设计引物,通过RT-PCR法从地鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker)中克隆得到675 bp地鳖虫纤溶活性蛋白 (fibrinolytic protein,EFP)成熟肽编码序列.将此片段克隆到表达载体pPICZα-A中,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达得到重组表达蛋白,经SDS-PAGE电泳和活性鉴定,表明重组EFP在毕赤酵母中均获得表达,重组表达蛋白相对分子质量为28.2 kD,表达产物分子质量与理论分子质量相符.重组蛋白在毕赤酵母中以分泌形式表达,具有纤溶活性.     

PTD-NPY融合基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

应用重叠延伸PCR方法扩增HIV-1 TAT蛋白转导结构域(PTD)与鼠源神经肽Y(NPY)的融合基因,克隆目的片段并插入酵母表达载体pPICZαA,构建成重组表达质粒pPICZα-PTD-NPY.PCR和酶切鉴定及测序正确后,经限制性内切酶Sac Ⅰ线性化重组表达质粒并通过电转化整合到巴斯德毕赤酵母菌GS115的染色体基因组中.阳性重组酵母菌用含1%甲醇的培养基诱导其分泌表达.经过120 h的诱导,取上清浓缩除盐后进行SDS-PAGE电泳,表明该系统成功表达了PTD-NPY融合蛋白,Western blotting实验证实表达产物具有特异性.获得真核表达的PTD-NPY融合蛋白,为下一步的应用研究提供了物质基础.     

人Leptin基因的cDNA的克隆和表达

克隆人Leptin基因的cDNA并获取表达的Leptin蛋白,为进一步研究新的Leptin相关蛋白打下基础。以人基因组DNA为模板,用引物悬挂延伸PCR法,克隆与6个组氨酸（6×His）密码子相连的人Leptin基因的cDNA,并将其克隆到体外表达载体pIVEX23MCS上,通过体外快速翻译系统(Roche公司的RTS500环状模板试剂盒和RTS500 ProteoMaster仪器)在体外表达了带有6×His的Leptin融合蛋白。经SDSPAGE及Western blot方法鉴定,融合蛋白大小正确,有172个氨基酸,分子量为1946kD,具有特异的抗原性,且主要以可溶形式存在于反应液上清中。     

草鱼生长激素基因在毕赤酵母中的表达

将草鱼生长激素基因（cGH）的cDNA亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,经电击转化导入毕赤巴斯德酵母GS115菌株,获得转化子。菌落PCR技术筛选证实cGH已经整合到了酵母染色体上。对重组酵母进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹分析,结果表明cGH的毕赤巴斯德酵母GS115菌株中获得了高效表达。