apoA-Ⅰ的α螺旋在胆固醇流出中的作用

血浆载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)的水平与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)性心血管疾病的风险呈负相关.ApoA-Ⅰ经载脂形成高密度脂蛋白(HDL),HDL通过促进胆固醇逆向转运(RCT),使细胞内的多余胆固醇流出.α螺旋是apoA-Ⅰ载脂的主要结构,在apoA-Ⅰ参与的胆固醇流出中具有重要作用.模拟α螺旋建立的apoA-Ⅰ模拟肽能通过不同方式发挥抗AS的作用.本文就α螺旋在胆固醇流出中的作用作一综述,以便进一步探索apoA-Ⅰ的结构对胆固醇流出的影响,为以apoA-Ⅰ为靶点防治AS提供理论基础.     

人载脂蛋白A-Ⅰ半胱氨酸突变体的二级结构和脂质结合能力的比较

为探讨人载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ,apolipoproteinA-Ⅰ)α螺旋不同位点的半胱氨酸突变后,对蛋白二级结构和脂质结合能力的影响,利用定点诱变技术构建apoA-Ⅰ的天然半胱氨酸突变体apoA-ⅠMilano(R173C),及其它α螺旋片段上的半胱氨酸突变体,分别为apoA-Ⅰ(S52C),apoA-Ⅰ(N74C),apoA-Ⅰ(L107C),apoA-Ⅰ(K129C),和apoA-Ⅰ(L195C).观察比较各种野生型及突变apoA-Ⅰ单体蛋白的α螺旋含量和二级结构稳定性及其脂质结合能力.结果显示,野生型apoA-Ⅰ,apoA-Ⅰ(S52C),apoA-Ⅰ(N74C),apoA-Ⅰ(L107C),apoA-Ⅰ(K129C),apoA-ⅠMilano和apoA-Ⅰ(L195C)的α螺旋含量分别为54±4%,49±4%,50±2%,51±6%,56±4%,52±3%,和54±1%,各种蛋白的α螺旋含量无显著性差异(P>0.05).野生型apoA-Ⅰ的变性标准自由能(ΔG0D)为10.5kJ/mol;apoA-Ⅰ(S52C)和apoA-ⅠMilano的ΔG0D比野生型低2.1kJ/mol;而apoA-Ⅰ(K129C)的ΔG0D比野生型apoA-Ⅰ高1.6kJ/mol.与野生型apoA-Ⅰ相比,apoA-Ⅰ(K129C)和apoA-Ⅰ(L195C)两个突变体与脂质结合能力明显下降(P<0.05),而其它半胱氨酸突变体(包括apoA-ⅠMilano)在脂质结合动力学方面与野生型apoA-Ⅰ无明显差异.以上结果提示,不同位点发生的半胱氨酸突变对apoA-Ⅰ单体蛋白的α螺旋含量无明显影响,但对蛋白的二级结构稳定性和脂质结合能力影响不尽相同.     

综述: 载脂蛋白A-Ⅰ在高密度脂蛋白生物合成中的作用研究进展

高密度脂蛋白(HDL)生物合成是一个有多种膜蛋白和胞质蛋白参与的复杂过程,载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)是HDL中最主要的结构和功能蛋白,它能活化卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶(LCAT),贫脂apoA-Ⅰ也是巨噬细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)介导的胆固醇流出的重要接受体．因此,apoA-Ⅰ在HDL及胆固醇代谢中的作用至关重要,它赋予了HDL多种抗动脉粥样硬化活性．本文主要就HDL生物合成及apoA-Ⅰ在其中的作用作一综述,以期为揭示HDL的代谢机制提供新思路．     

人血清高密度脂蛋白主要载脂蛋白的分离纯化及其多态现象

本文报道人血清高密度脂蛋白(HDL)的主要载脂蛋白(apoHDL)的分离纯化和其多态型(Polymorphism,Isoform)的初步研究。首先用硫酸右旋糖酐沉淀,结合角度头密度梯度超速离心的方法,从人血清中提取高密度脂蛋白。分离纯化的高密度脂蛋白在0.5％琼脂糖和3.75％聚丙烯酰胺电泳中显示一条带,经0.1％SDS-10％聚丙烯酰胺电泳鉴定未发现有血清白蛋白的污染。纯的HDL在低温下用醇醚混合液脱脂获得载脂蛋白(apoHDL)。经过Sephadex G-200凝胶过滤柱,apoHDL被分为五个蛋白峰。0.1％SDS-10％聚丙烯酰胺凝胶电泳的鉴定表明峰Ⅰ、峰Ⅱ为载脂蛋白聚集体,主要含apoA-Ⅰ和apoE;峰Ⅲ为纯的apoA-Ⅰ;峰Ⅳ含有apoA-Ⅱ、apoC和apoA-Ⅰ;峰V主要为apoC。令人感兴趣的是,经聚丙烯酰胺等电聚焦电泳鉴定apoA-Ⅰ有八种多态型。这些结果对于深入研究载脂蛋白的结构、功能和代谢,对于研究高密度脂蛋白的亚类及其抗动脉粥样硬化的机理都是有益的。     

黑曲霉纤维素酶系中内切β-葡聚糖酶的分离纯化

使用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤色谱及DEAE-Sephadex A-25(A-50)离子交换色谱等分离技术,从黑曲霉(Aspergillus niger)培养液中分离到7种内切β-葡聚糖酶组分,分别称为Ⅰ-2a、Ⅰ-2b、Ⅰ-2c、Ⅰ-2d,Ⅱa、Ⅱb和Ⅲa。经凝胶电泳鉴定均为单一带。     

发现动脉疾病的遗传关系

波士顿市哈佛医学院和儿童医院医学中心的研究人员在两个过早发生的动脉粥样硬化病例中发现遗传缺陷。有问题的基因是指使生成脱辅基脂蛋白A-1(apoA-1)的基因。apo A-1是携带胆固醇通过血液的一种化合物高密度脂蚤白(HDL)的主要蛋白成分。HDL是“有益的”脂蛋白。已查明它与延年益寿和降低心脏病发病率有关。 Sotirios K.Karathanasis和同事们在患过早发生动脉粥样硬化症的两姐妹(一个29岁,另一个31岁)的apo A-1基因中发现额外的脱氧核糖核酸(DNA)片段。她们各有两个缺陷基因,而她们家庭中没有患此     

北京鸭血清HDL主要载脂蛋白的高效液相层析分离及其理化性质

用高效液相层析(HPLC)对北京鸭血清高密度脂蛋白(HDL)的所有载脂蛋白(apo)分离纯化,得五个主要apo峰,经SDS-PAGE鉴定,均为单一带;并做了IEF、糖基含量分析;对其中含量高的四个apo峰样进行了氨基酸组成测定和N-端部分氨基酸序列分析;从所做理化性质的研究,发现北京鸭血清HDL中的主要apo为:A-Ⅰ、C-Ⅲ_o、apoC-Ⅲ_s(s=1,2)、apoC's及可能的A-Ⅲ,几乎不含E和A-Ⅱ_o北京鸭HDL中apo的上述组成特点明显不同于易患动脉粥样硬化(As)的人及兔等动物,在一定程度上决定了北京鸭HDL的形成与代谢具有其特点,该特点与北京鸭不易形成As密切相关。     

昆虫杆状病毒表达系统表达人载脂蛋白A-Ⅰ

载脂蛋白apoA-Ⅰ是高密度脂蛋白中最主要的蛋白,在胆固醇代谢及动脉粥样硬化等疾病的发生和控制中有重要作用。为了建立大量生产和制备该蛋白的方法,昆虫杆状病毒表达系统被用来高效表达了两种形式的人apoA-Ⅰ。不带有信号肽序列的proapoA-Ⅰ蛋白表达后主要在细胞内,但在感染的晚期也有相当量的重组蛋白进入细胞培养液中。用蛇磷脂酶A2抑制因子α亚基信号肽序列引导表达的apoA-Ⅰ蛋白在感染早期可以被分泌到培养液中。在此基础上,通过Phenyl Sepharose疏水柱层析,从感染细胞的培养液中初步分离纯化了成熟的apoA-Ⅰ蛋白。这一结果为apoA-Ⅰ的进一步研究和应用奠定了基础。     

花椰菜花叶病毒的酶联免疫吸附分析

我们用酶联免疫吸附分析(ELISA)的双抗体夹心法,研究了花椰菜花叶病毒(CaMV)的定量测定。以提纯的CaMV免疫家兔,得到教价为1：2000的抗血清。经硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素(DE-32)离子交换层析纯化了IgG抗体。用于标记的酶为辣根过氧化物酶。该酶经硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素(DE一32)离子交换层析、刀豆球蛋白A-琼脂糖4B(ConcanavalinA-Sepharose 4B)亲和层析纯化,使RZ值达2.6。标记抗体制备用过碘酸盐氧化法。     

免疫电镜定位酶的探针——蛋白A胶体金复合物(PA-Au Complexes)的制备和检验

我们以HAuCl_4为原料,用柠檬酸三钠还原方法能制备所需直径大小的金胶体溶液,并成功地制备蛋白A-胶体金复合物(PA-Au Com-plexes),经检验PA-Au复合物具合格性和使用价值,可作为免疫电镜在分子水平上定位酶的探针。用作者自制的纯的CF_1的抗体(AbCF_1)以及我们引进和建立整套制备PA-Au复合物和以PA-Au作为探针的免疫电镜技术,现已开始应用于研究偶联因子(CF_1)在叶绿体类囊体膜上分布,获初步结果;为研究叶绿体类囊体膜上关键酶系的精确分布创造了必要的条件。     

C18硅胶制备荔枝果皮原花青素低聚体的组成分析及单体分离

为更快速地从荔枝果皮中分离制备纯度更高的A-型原花青素低聚体,本研究在传统大孔树脂富集纯化的基础上,利用C18硅胶填料对制备方法进行了优化。通过组分分析和HPLC、LC-MS鉴定可知,新法制得的荔枝果皮原花青素低聚体(Litchi pericarp oligomeric procyanidins,LPOPC)总酚含量高达940±123 mg/g,且主要为(-)-表儿茶素、A-型原花青素二聚体和三聚体,相对含量分别占44.86%、36.02%和9.86%,平均聚合度约为1.62。因此,当再次通过Toyopearl HW-40s凝胶对提取物进行柱层析分级时,可得到纯度较高的已知A-型原花青素二聚体和三聚体。等辐射分析法(Isobologram)研究显示,该A-型二聚体和三聚体均可清除自由基,并呈现出协同抗氧化性。     

胃癌血清蛋白标记物的筛选及鉴定

为探究胃癌患者血清中可能存在的特异性蛋白标记物,本研究选取贵州省骨科医院的80名胃癌组患者和80名对照组人员(40名健康志愿者,40名慢性萎缩性胃炎患者)作为研究对象,采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)法筛选血清蛋白标记物,然后用HPLC法筛选和分离不同表达的蛋白峰,经酶解后进行液相色谱质谱/质谱联用(LC-MS/MS)分析,再用Bio Work 3.2进行数据分析,采用免疫印迹检测胃癌组和对照组血清蛋白标记物的表达。结果显示,在胃癌组患者血清中发现三个表达不同的蛋白峰,分别为m/z 5 905.6、m/z 6 638.5和m/z 8 710.3。相比对照组,胃癌组的m/z 5905.6峰表达信号增强(胃癌组为(7.95±3.32),对照组为(0.77±0.21)),而m/z 6 638.5蜂(胃癌组为(5.78±2.55),对照组为(16.45±4.32))和m/z 8 710.3峰(胃癌组(0.94±0.19),对照组为(2.23±0.87))的表达信号减弱。利用m/z 5 905.6、m/z 6 638.5和m/z 8 710.3三个峰的表达信号差别,可确定胃癌患者血清中的特异性的蛋白标记物,并利用这3种特异性的蛋白标记物对胃癌进行检测,其中胃癌组和对照组的检出率分别为93.3%和95%。蛋白鉴定结果显示,m/z 5905.6、m/z 6 638.5和m/z 8 710.3三个蜂分别是纤维蛋白原α链(fibrinogen alpha chain,FGA),载脂蛋白A-Ⅱ(apolipoprotein A-Ⅱ,Apo A-Ⅱ)和载脂蛋白C-Ⅰ(apolipoprotein C-Ⅰ,Apo C-Ⅰ);Western blotting结果显示胃癌患者血清FGA表达显著升高(p0.05),Apo A-Ⅰ和Apo C-Ⅰ的表达显著降低(p0.05)。研究数据表明,FGA、Apo A-Ⅱ和Apo C-Ⅰ这3种血清蛋白标记物在胃癌中的表达程度与胃癌进展程度有关,临床应用上具有潜在的诊断价值。     

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007抗菌蛋白的分离纯化

对拮抗细菌吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007菌株抗菌蛋白进行了初步研究。研究发现,JK-SH007菌株的抗菌粗蛋白对热和蛋白酶K不敏感,碱性环境不利于抑菌蛋白活性的发挥。JK-SH007菌株的无菌发酵滤液经硫酸铵沉淀、透析(3.5kD)、冷丙酮沉淀(-20℃)、Sephadex G-50葡聚糖凝胶分子筛层析及DEAE-Sephadex A-25离子交换层析分离纯化,得到了蛋白组分A-Ⅱ-2,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不是单一组分,该复合组分具有明显抑制3种杨树溃疡病病原真菌金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma)、拟茎点霉(Phomopsis macrospore)、七叶树壳梭孢(Fusicoccum aesculi)生长的作用。     

牛皮菜叶中三种不同光化学活性的PS Ⅱ反应中心复合物的纯化和特性

悬浮于3种不同缓冲介质中的牛皮菜(莙荙菜)PSⅡ颗粒经不同浓度的 Triton X—100处理后,用 DEAE—Toyopearl 650S离子交换柱层析分离.可分别得到3种具有不同光化学活性的PSⅡ反应中心复合物:即放氧的PSⅡ反应中心复合物(Ⅰ)、具DCIP光还原活性的PSⅡ反应中心复合物(Ⅱ)和仅发生Pheo~-光累积的 PSⅡ反应中心复合物(Ⅲ)。(Ⅰ)的多肽组分为 47、43、33、32、30、9 kD和4kD;(Ⅱ)的多肽组分为 47、32、30、9 kD和 4kD;(Ⅲ)的多肽组分为 32、30、9 kD和 4 kD。这3种PSⅡ反应中心复合物的吸收光谱和荧光光谱特性;及其主要化学成分的相对含量,与从菠菜等制备出来的相应3种PSⅡ反应中心复合物基本相同。     

人apoA-Ⅰ基因启动子转录上调剂筛选系统的建立与应用

PCR扩增含有apoA-Ⅰ基因的转录调控序列的启动子片断（376 bp）,克隆入含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,构成受apoA-Ⅰ启动子调控的重组报告基因质粒pGL3B-neo：：apo,稳定转染人肝癌细胞株HepG2。通过细胞有限稀释法筛选稳定表达荧光素酶活性的细胞株SAPOA-Ⅰ。经apoA-Ⅰ转录调控因子PPARα激动剂的鉴定和细胞接种密度、溶剂使用浓度等条件的优化,成功建立了靶向apoA-Ⅰ基因启动子转录活性的报告基因筛选体系。应用该体系对400多种降脂中药提取物进行筛选,泽泻、罗布麻叶、山楂等提取物显示出较好的上调活性,与文献报道采用动物模型研究的结果一致。     

1株产生洛伐他汀杂色曲霉的筛选、鉴定和发酵优化条件

从不同生境收集的自然发酵样品中分离纯化获86株曲霉纯菌株;用薄层层析法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)测定曲霉各菌株发酵液中洛伐他汀(Lovastatin)含量进行筛选;获1株较高产Lovastatin的编号为A-8曲霉菌株,产量为58 g/L。根据形态特征和ITS基因序列,鉴定A-8菌株为杂色曲霉。单因素实验初步优化了A-8曲霉菌株发酵条件和培养基配方,结果表明A-8菌株产生Lovastatin较适宜的发酵条件为:温度28℃、初始pH 5.2、摇床转速180 r/min、接种量为10%;培养基配方为:乳糖为碳源、含量为100 g/L,蛋白胨为氮源、含量为12 g/L,碳源/氮源为15∶1.5;在该条件下A-8曲霉菌株发酵产生Lovastatin的水平最高,可达130.04μg/mL,比优化前提高了约2.24倍。A-8曲霉菌株是较有潜力的工业菌株。     

马氏钳蝎的哺乳动物神经毒素的分离和纯化

用CM-Sephadex C-50柱层析法将马氏钳蝎(Buthus martensi Karsch)粗毒分成13个蛋白组分。其中Ⅺ峰对哺乳动物(小鼠)、甲壳动物(潮虫科鼠妇属甲壳虫)和昆虫(丽蝇幼虫)都有较强毒性;Ⅻ峰对前两类动物有较强毒性;Ⅷ峰对后两类动物有较强毒性。Ⅺ峰通过DEAE-Sephadex A-50柱层析被分成Ⅺ-1和Ⅺ-2两个组分。Ⅺ-1峰与Ⅻ峰再分别经过Sephadex G-50柱层析被纯化后,经聚丙烯酰胺碱性不连续圆盘电泳和等电聚焦圆盘电泳鉴定均为单一区带。它们都是神经毒素,分别被命名为马氏钳蝎神经毒素Ⅰ和Ⅱ。经小鼠腹腔注射,测定粗毒、神经毒素Ⅰ和Ⅱ的LD_(60)分别为2.4mg/kg、0.48 mg/kg和0.63mg/kg。毒素Ⅰ有较好的耐热性。工作中还测定了神经毒素Ⅰ和Ⅱ的氨基酸组成,它们分别由67和63个氨基酸残基组成,最小分子量分别为7567和7181。     

早孕因子单克隆抗体对黑色素瘤细胞A-375增殖、凋亡的影响

目的:研究早孕因子单克隆抗体(EPF-McAb)对黑色素瘤细胞A-375增殖、凋亡的影响。方法:体外培养黑色素瘤细胞A-375,通过CCK-8实验检测EPF-McAb对A-375细胞增殖的影响;通过流式细胞术检测EPF-McAb对A-375细胞凋亡的影响;Western Blot检测EPF-McAb对A-375细胞EPF蛋白表达的影响。结果:CCK-8结果显示EPF-McAb可以抑制黑色素瘤细胞A-375的增殖,且随着作用时间延长和药物浓度的增加,对A-375细胞增殖的抑制作用也增强;流式细胞术实验结果显示EPF-McAb可以促进黑色素瘤细胞A-375的凋亡,且调亡率随着药物浓度的增加而升高,0.2、0.4、0.8 mg/m L的EPF单抗作用于A-375细胞24 h后,细胞调亡率分别为:14.68%(P0.01)、19.81%(P0.01)、23.97%(P0.01);Western Blot实验结果显示EPF-McAb可以降低黑色素瘤细胞A-375 EPF蛋白的表达。结论:早孕因子单克隆抗体可以抑制黑色素瘤细胞A-375的增殖,并促进其凋亡。     

小鼠肝脏金属硫蛋白Metallothioneins的分离纯化与鉴定

由健康小鼠通过皮下注射一定量的氯化镉,取肝脏匀浆,离心,经SephadexG-50和DEAE-Sephadex A-50柱层析分离,即可获得MT-Ⅰ和MT-Ⅱ两种金属硫蛋白。经鉴定:两个分子各含18个巯基,结合4个Cd原子和3个Zn原子,无金属蛋白质Thionein的分子量约为6kD,半胱氨酸含量约占氨基酸总量的28％,所提取到的MT-Ⅰ和MT-Ⅱ经氨基酸组成,HPLC和PAGE分析皆证明为高度均一的,且与有关文献报道基本相符。其中MT-Ⅱ已获得晶体。     

苹果多酚氧化酶的纯化与表征

运用丙酮浸漬干燥、磷酸盐缓冲液提取、低温离心、硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex(A-50)、Sephadex(G-75) 和DEAE-celluse(DE-52)层析等方法从苹果中分离获得一种新的含铜酶蛋白,该酶被命名为多酚氧化酶Ⅱ(polyphenol oxidase Ⅱ, PPOⅡ),纯化倍数是215,纯化收率是23%.PAGE、SDS-PAGE和MALDI-TOF 等技术用于测定所获的酶的纯度和分子量.在PAGE和SDS-PAGE 均显示一条带,表明PPOⅡ只由一个亚基组成,且已达到单一组分(MALDI-TOF的结果更证实了这一点).SDS-PAGE 和 MALDI-TOF 的结果都表明PPO的分子量为 38204 Da.pH值对酶活性和稳定性研究的结果显示,从pH值4.0～7.0随着pH值的增加,酶活性也不断增加;从pH值 7.0～11.0, 酶活性不断降低.PPOⅡ的最适pH值为6.6最适温度为30℃.