毕赤嗜甲醇酵母工程菌高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的研究

目的:对毕赤嗜甲醇酵母工程菌inu-26高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的条件进行优化,找出最佳的外源蛋白表达条件。方法:在摇瓶优化培养的基础上进行发酵罐高密度培养,优化最佳产酶条件。结果:以葡萄糖为碳源、微量元素添加量100～200mL/L、甲醇浓度1g/L、pH6.0～7.0、诱导时间96h时酶的表达量最高;摇瓶模拟高密度培养表明影响酵母生长的最主要因素葡萄糖和硫酸铵的最佳浓度分别为20～45和11.5g/L;利用培养基F1进行高密度培养优于其他培养基,工程菌生长符合指数生长曲线,细胞生长延迟期为1.36h,比生长速率μ为0.4846h-1。结论:以葡萄糖为碳源,采用葡萄糖-甲醇混合诱导和100%甲醇单一诱导相结合,在菌体鲜重约为280g/L时连续诱导96h,菌体生长良好,不会出现自溶,且酶的表达量最高,为摇瓶培养的3倍多,酶活最高可达540 U/mL。     

黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因在甲醇毕赤酵母中的表达

将编码黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶(lip)的cDNA克隆到酵母整合型质粒pMETA上,电转化Ade缺陷型甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)PMAD16,通过MD平板及PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDSPAGE分析和木质素过氧化物酶活力测定等方法鉴定,表明带自身信号肽的黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因(lip)在甲醇毕赤酵母中得到表达。优化其发酵培养条件,以藜芦醇为底物进行酶活测定,其酶活可达932U/L。相应发酵指数为12.94U/h·L。比出发菌株提高了24.18%。     

重组毕赤酵母产植酸酶发酵条件的优化

为研究优化毕赤酵母工程菌H311产植酸酶的发酵条件,采用单因素试验和L18(37)正交试验考察不同工艺条件对产酶活性的影响。结果表明:影响重组毕赤酵母产植酸酶的因素重要性从大到小依次为诱导时间、甲醇添加量、装液量、初始诱导p H、生长时间、接种量和初始生长p H,产酶最佳条件为接种量3%(体积分数)、装液量20 m L(250 m L摇瓶)、生长时间20 h,诱导时间120 h、甲醇添加量1.5%(体积分数)、生长p H 6.0、诱导p H 5.0,在此条件下进行诱导表达,植酸酶的比酶活可达334 U/m L。     

多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵

目的:构建高效表达白地霉脂肪酶的毕赤酵母重组菌株,并对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵条件优化和分批补料高密度发酵工艺研究。方法:将诱导型表达载体pPIC9K-gcl电转化至毕赤酵母GS115。通过橄榄油-罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组菌株,运用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR 法确定其拷贝数,并对菌株进行摇瓶发酵条件优化。在此基础上,研究重组菌在3L 发酵罐中的高密度发酵工艺。结果:筛选得到一株具有3 个白地霉脂肪酶基因拷贝的菌株GS115/pPIC9K-gcl 78#,初始酶活力为220 U/ml。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96 h,每24 h甲醇添加量1 %,接种量2 %,培养基初始pH 7.0,500 ml摇瓶装液量50 ml,甲醇诱导温度25℃ 时酶活力达735 U/ml。3L 发酵罐高密度发酵176.5 h,酶活力达到3360 U/ml,总蛋白含量达到4.30 g/L,且发酵过程中细胞活性一直保持在96 % 以上。结论:基因拷贝数与重组菌株的产酶水平呈正相关,摇瓶优化可显著提高重组菌株的产酶能力,为白地霉脂肪酶的工业化生产奠定了技术基础。     

碱性果胶酶在重组毕赤酵母中高效表达的关键因素研究

为提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的产量和生产强度, 在摇瓶条件下优化了重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的关键因素。结果表明, 以下条件：初始甘油浓度40 g/L、初始甲醇浓度3.1 g甲醇/g DCW、每24 h添加0.51 g甲醇/g DCW、诱导表达周期72 h、250 mL三角瓶诱导培养基装液量30 mL、初始pH 6.0, 最适于菌体生长与产物表达。在此基础上, 7 L罐上通过恒速流加甘油进一步提高细胞密度, 诱导阶段甲醇采取前期恒速流加和后期DO-stat, 发酵结束菌体干重达80 g/L, 酶活为217 U/mL, 比摇瓶结果提高了66.2%。     

重组大肠杆菌高效分泌表达β-木糖苷酶发酵条件的优化

[目的]嗜热拟青霉β-木糖苷酶基因在大肠杆菌中高效分泌表述重组β-木糖哥酶摇瓶发酵条件优化,及5 L发酵罐放大培养.[方法]通过单因素试验对诱导剂种类及其添加量、诱导起始 OD600、培养温度、培养时间进行优化研究.[结果]摇瓶优化结果表明:2％乳糖为诱导剂、培养温度为33℃C、OD600控制在0.8-0.9时诱导为最佳产酶条件,在此条件下培养48 h后胞外酶活达到103.9 U/mL,胞外分泌的比例高达99％以上.进行5L发酵罐放大培养,发酵48 h胞外酶活达到最高值392.5 U/mL,蛋白含量为10.1 g/L.[结论]该重组大肠杆菌高效分泌β-木糖苷酶,具有较好的工业化生产前景.     

GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究*

为了提高GABAA受体a1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基、接种量、温度、摇床转速、pH、诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3％接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG 32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h,最高目标蛋白表达量达到136mg/L.     

GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究

为了提高GABAA受体α1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基,接种量,温度,摇床转速,pH,诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3%接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h。最高目标蛋白表达量达到136mg/L。     

产紫青霉中β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导表达

针对产紫青霉(Penicillium purpurogenum)Li-3发酵生产β-葡萄糖醛酸苷酶存在的碳代谢阻遏现象,研究β-葡萄糖醛酸苷酶的高效诱导表达策略。在发酵条件优化的基础上,建立了新的产酶诱导工艺:葡萄糖的初始质量浓度5 g/L,在葡萄糖耗尽时加入20%诱导剂(10 g/L GL+1.2%Tween80)进行诱导,每24 h添加1次诱导剂,诱导72 h后立即转到40℃摇床发酵48 h。采用该工艺进行发酵,菌体出现了"二次生长"现象,比酶活从647.99 U/mL提高至2 356 U/mL,提高了近3倍。     

高产木质素酶荧光假单胞杆菌L-520的筛选及其发酵工艺优化

利用苯胺蓝鉴别培养基及产酶培养基进行菌种筛选,从甘肃兴隆山分离得到的10株菌株中筛选到一株高产木质素酶活力的菌株L-520,对该菌株进行16S rDNA鉴定,确定该菌为荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)。分别考察了接种量、装液量,初始pH对L-520发酵产酶的影响,以及碳源、氮源对木质素酶活力的影响。结果得到最佳培养基为:蔗糖1%,NH_4Cl 0.2%,KH_2PO_4 0.1%,MgSO_4?7H_2O 0.05%。优化后的发酵条件为:初始pH 5,接种量3%,装液量50%。经发酵工艺优化后,漆酶(Lac)、木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)三种酶活分别为16.43 U/L,106.32 U/L,95.89U/L,与初始酶活相比分别提高了8.7、14.74、11.09倍。本研究筛选得到的荧光假单胞杆菌有助于染料废水中偶氮染料的降解。     

植物基因工程中人工启动子的研究进展

启动子是调控基因转录的一段DNA,也是构建基因工程表达载体的重要元件。天然启动子在表达强度和特异性等方面存在一定的局限性。采用人工构建的方法,有望得到诱导因子广、本底活性低、表达强度高、启动表达快等特点的启动子。本文综述了人工启动子在诱导表达、组织特异性表达、高效表达等方面的研究进展。     

山羊β—酪蛋白基因启动子指导人血清白蛋白基因在小鼠组织中的特异性表达

对本所构建的pcDNA3.1-β6.7hALBm表达载体行尾静脉注射直接转染哺乳期母鼠的活体组织。通过RT－PCR检测hALBm基因在小鼠几种组织中的表达来研究该构建体的组织特异性。结果：构建体在受试鼠组织中的表达显示了较好的乳腺组织特异性。说明构建具有较长5'端上游乳蛋白调控区的乳腺特异性表达载体对组织特异性表达是必需的。     

Expression of glucose transporters in cancers

It has been known for 80 years that cancer cell growth in an energy-related process supported by an increased glucose metabolism. This phenomenon suggests a need for a corresponding increased uptake of glucose across the plasma membrane through an enhancement in the glucose transporter proteins, SGLT proteins as well as GLUT proteins. The results of many studies have demonstrated that the expression of glucose transporters, especially GLUT1, is increased in a variety of malignancies. GLUT1 overexpression has been found to be associated with tumor progression. It was found that GLUT1 overexpression is associated with poor overall survival in various malignant tumors.     

血管生成抑制因子arresten基因的克隆表达

构建血管生成抑制因子arresten基因的原核表达重组体 ,并进行初步表达。从人胎盘组织中提取总RNA ,经反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)扩增出arresten基因 ;采用T A克隆法 ,将arresten基因克隆入pGEM T载体中 ,经DNA测序确认后 ,构建原核表达重组体pRSET Arr,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,用IPTG诱导表达。所获得的arresten基因经测序正确 ,并表达重组蛋白 ,经SDS PAGE分析 ,相对分子量为 2 6ku。构建的原核表达重组体pRSET Arr能高效表达重组arresten蛋白。     

信号肽及其在蛋白质表达中的应用

分子生物学研究已进入后基因组时代,其中心任务是更多地关注基因组表达的蛋白质的结构和功能。由于基因功能最终通过其表达产物——蛋白质来实现,因此,要了解基因组全部功能活动,最终也必须回到蛋白质上。另外,在菌株、培养和发酵等逐渐成熟的条件下,构建高效的表达载体以提高外源蛋白质的表达量是降低工业化生产成本的关键。随着研究的深入,发现信号肽对蛋白质的定位有着非常重要的作用,使得信号肽的研究不仅具有重要的理论意义,而且也具有潜在的应用价值。就信号肽的结构和功能,信号肽的捕获方法及其在原核表达系统和真核表达系统中表达外源蛋白质的应用做一些介绍。     

提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展

巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统 ,与现有的其它表达系统相比 ,巴斯德毕赤酵母在表达产物的糖基化修饰、折叠、加工、外分泌及表达量等方面有明显的优势。外源基因在该系统中表达时 ,由于受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的 pH值等诸多因素的影响 ,一些外源蛋白的表达也存在着表达不够稳定、表达量较低 ,甚至不表达的情况。对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析 ,结合具体实践经验 ,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了综述。     

2个表达单元间相互位置和转录方向对表达的影响

目的:研究质粒表达载体中2个表达单元间相互位置和转录方向关系对表达的影响,找出利于2个表达单元表达的优化的相互关系。方法:以全抗体为研究对象,构建了轻重链方向不同的2种相互关系的单质粒表达载体pIRESdhfrA和pIRESdhfrB,转染CHO-dhfr-细胞后,对瞬时表达水平进行了比较。以pIRESdhfrA和pIRESdhfrB为基础,构建了瞬时表达载体pIRESdhfrA-sv40ori和pIRESdhfrB-sv40ori,在COS-7细胞中进行了瞬时表达水平的比较。构建了基于CHO定点细胞系的稳定表达细胞株,对pIRESdhfrA和pIRESdhfrB进行稳定表达水平的比较。结果:在CHO-dhfr-的瞬时表达水平比较中,pIRESdhfrB转染的细胞表达水平是pIRESdhfrA转染细胞的2.18倍。与pIRESdhfrA-sv40ori在COS-7细胞的瞬时表达水平相比,pIRESdhfrB-sv40ori是其表达水平的2.3倍。pIRESdhfrB-FRT构建的CHO定点细胞平均表达水平是pIRESdhfrA-FRT构建的CHO定点细胞的11.6倍。结论:在构建的真核细胞质粒表达载体pIRESdhfr中,2个表达盒的启动子头-头转录方向关系比头-尾方向关系更利于重组蛋白的表达。     

pQE32-FOXP4ORF质粒的构建及其表达的研究

利用已建立的GenBank数据库提供的已知序列,初步克隆了一个新的人类基因,经国际基因命名委员会批准命名为FOXP4(forkheadboxP4).FOXP4的开放阅读框ORF长4186bp,包含有17个外显子,可以编码一个667个氨基酸的多肽链,蛋白质相对分子质量大小为73.4kDa.为了研究FOXP4基因编码产物在细胞内的作用,构建表达型质粒(pQE32)与FOXP4基因的穿梭表达载体pQE32-FOXP4ORF.利用异丙基硫代-βD-半乳糖苷(isopropyl-βD-t-hiogalactoside,IPTG)对蛋白质的表达进行诱导,在适合的温度和浓度下,经过一定的时间,使细胞大量表达外源蛋白.用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测,得出诱导的最佳的浓度和温度,再进行大量诱导,通过电泳分离,将外源蛋白提取出来,从而对基因的功能进行进一步的研究.     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分泌、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势,现已广泛用于外源蛋白的表达。该文综述了其自身的优点,表达载体和宿主菌的特点,以及高水平表达外源基因的策略。     

Activity of β-glucuronidase in Root Tips of Different Types of Transgenic Sugar Beet Plants

Expression of the -glucuronidase (GUS) reporter gene driven by the CaMV 35S, rolC, nos and mas promoters was assessed in the tips of 12 independent clones of transgenic sugar beet (Beta vulgaris) roots. Three questions were addressed: 1) expression pattern specific for a given promoter, 2) expression pattern variability, and 3) relationship between gene expression and cell differentiation. Characteristic patterns of tissue-specific expression were distinguished for each promoter. Striking differences, however, were found between some clones, bearing the same construct. Statistical analysis of the pattern variability proved that the variability is significantly lower within the construct than between constructs. rolC-GUS clones exhibited the lowest and CaMV 35S clones the highest pattern variability. Comparisons between the four promoters showed consistent GUS activity in areas playing a key role in tissue determination (the elongation zone) where cells switch from frequent mitosis and mostly isodiametrical growth, typical for the promeristem, to rapid elongation and differentiation. All of the clones were highly GUS-positive in the elongation zone of stele. Activity was commonly localised in the stele of the maturation zone for CaMV 35S, rolC and mas-GUS clones. CaMV 35S-GUS clones were highly active in the promeristem.