表达Insulin-ras杂交基因的转基因小鼠胰腺β细胞变性具有性别二型现象

胰腺β细胞过度表达人类ras原癌蛋白质(oncoprotein)的转基因小鼠,90%多5～8月龄雄性鼠发生β细胞变性及糖尿病。相反,尽管雌性小鼠表达与雄性小鼠相当水平的原癌蛋白质,但大多数雌鼠β细胞可抵抗ras基因的作用,血糖也维持正常,直到超过2岁。这种性别的二型现象的产生可能有激素基础或者可能是     

固相化HEK细胞在无血清培养基中高效表达重组人活性蛋白C

研究固相化HEK工程细胞的培养和产生rhAPC的水平。先将HEK细胞由贴壁适应为无血清悬浮培养,再用海藻酸钙固定,并在无血清培养基中悬浮培养(最高约为27mg/L)。固相细胞动态培养的表达水平高于细胞静态悬浮培养的表达水平(最高约为50mg/L)。固相细胞动态培养可实现细胞的高密度培养,得到较高的表达水平。     

流体动力对HEK293细胞的细胞团形成及细胞生长和代谢的影响

利用HEK293细胞在悬浮培养中具有聚集成团的体外培养特性,在250mL的Bellco的搅拌培养体系中,以HEK293细胞团的粒径、细胞数、细胞活力、葡萄糖比消耗率(qglc)、乳酸比产率(qlac)和乳酸转化率(Ylacglc)为观察指标,考察HEK293细胞在搅拌速度分别设置为25、50、75和100rmin的培养条件下的细胞团形成、粒径分布以及细胞生长和代谢。HEK293细胞在搅拌速度为50rmin和75rmin培养条件下所形成细胞团的粒径大小适中、离散度小。培养7d后,HEK293细胞团的平均粒径分别为201μm和175μm,其中粒径≥225μm的细胞团所占比例均低于10%;在整个培养过程中,细胞团中的HEK293细胞活力维持在90%以上,qglc、qlac和Ylacglc等反映HEK293细胞代谢的参数保持相对恒定。实验结果提示:合适的搅拌速度所产生的流体动力既可使细胞团的粒径控制在合适的范围内,也可为细胞团中的HEK293细胞提供基本满足其正常生长和代谢需要的物质传递效率。     

过表达TRAF2降解外源性绿色荧光蛋白

TRAF2是机体免疫与炎症反应中具有重要作用的蛋白,有E3连接酶活性;GFP是一种受到激发光照射后可产生绿色荧光的蛋白,常用于蛋白质的细胞共定位研究,并显示与GFP融合表达靶蛋白在细胞中的位置．我们实验发现共转染表达质粒pCMV-myc-TRAF2与pEGFP-C3,可引起转染细胞绿色荧光减弱．Western印迹实验证明TRAF2可以降解GFP,并且这种降解是通过蛋白酶体途径进行的．为进一步确定这种降解的特异性,在HEK293细胞中共转pCMV-myc-TRAF2与pEGFP-C3-LNX后,发现随着TRAF2表达量增加,融合蛋白GFP-LNX减少;而共转质粒pCMV-myc-TRAF2与pCMV-myc-LNX后,未发现LNX蛋白表达减少,表明TRAF2对GFP的降解具有相对特异性．GFP是人类细胞中并不存在的蛋白,TRAF2能够将其降解可能意味着TRAF2参与了细胞抗病原体感染的过程．     

转录因子AP-2beta和p53蛋白相互作用的研究

转录因子p53与AP-2基因家族成员AP-2beta发生突变后,均会导致个体出现相应的疾病。本文首先利用两个重组质粒p CMV-HA-p53和p Myc-AP-2beta,转染永生化的胚胎肾细胞HEK293(野生型),在细胞中表达相应蛋白质。通过免疫共沉淀实验证明AP-2beta和p53蛋白在体内可以相互作用。并将梯度增加的p MycAP-2beta质粒及等量p CMV-HA-p53质粒转染到HEK293细胞,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验证明AP-2beta能正向调控p53蛋白的表达。为了进一步探讨AP-2beta与p53的作用机制,利用蛋白质合成抑制剂CHX(cycloheximide)处理转染了AP-2beta与p53表达质粒的细胞,实验结果说明,AP-2beta能增加p53蛋白的稳定性来调控p53的表达。     

基于逆转录病毒载体的外源基因表达系统的评价和应用

逆转录病毒表达系统是基因治疗研究和RNA干扰技术广泛采用的外源基因表达系统。文中以增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因的表达水平和稳定性为指标,比较逆转录病毒表达载体pQCXIN和pcDNA3.1(+) 表达质粒介导的外源基因在HEK293细胞和CHO-K1细胞的表达效率。病毒感染HEK293细胞和CHO-K1细胞的相对荧光强度 (Relative fluorescence intensity,RFI) 均约为对应的质粒转染细胞的2倍。多轮反复感染逆转录病毒表达载体能有效提高HEK293细胞表达EGFP的效率。HEK293细胞经4轮病毒感染后的RFI值较1次病毒感染HEK293细胞的RFI值约提高2倍。此外,逆转录病毒表达载体介导的外源基因表达的稳定性优于质粒转染的外源基因表达。采用携带人重组活性蛋白C (Recombinant human activated protein C,rhAPC) 基因的pQCXIN和HEK293细胞进一步验证了逆转录病毒载体介导的外源基因表达效率,构建了rhAPC表达水平为10~15 mg/(106 cells·d) 的HEK293细胞系。研究结果表明,逆转录病毒表达系统是有应用价值的介导外源基因在哺乳动物细胞高效表达的技术途径。     

无载体固定化培养模式下HEK293细胞的生长和代谢特征

利用HEK293细胞在悬浮培养体系中下具有聚集成团的体外培养特性,在250ml的spinner flask搅拌式细胞培养瓶中以悬浮细胞团的形式实施HEK293细胞的无载体固定化培养,以细胞密度、细胞活力、细胞团粒径分布和葡萄糖比消耗率 (qglc)、乳酸比产率 (qlac)、乳酸转化率 (Ylac/glc)、氨基酸消耗为观察指标,同时设置静止培养体系作为参照,考察无载体固定化培养模式下的HEK293细胞生长和代谢特征。观察结果表明,HEK293细胞在搅拌式细胞培养瓶中无载体固定化培养和在组织培养瓶中静止贴壁培养表现为基本相同的细胞生长和代谢特征,平均粒径小于300μm的细胞团中的物质传递能够满足HEK293细胞维持正常生长和代谢的基本需要。HEK293细胞的无载体固定化培养便于实施灌注操作、提高生物反应器单位体积的生产效率。     

siRNA介导多药耐药相关蛋白(MRP1)的表达沉默

利用pSIREN-RetroQ载体构建了3个沉默多药耐药相关蛋白（MRP1）基因表达质粒pSI REN-siRNAs.并通过限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序鉴定,将截断MRP和全长MRP1 cDNA分别克隆到真核表达载体pEGFP-N2和pcDNA3.1中,产生了pEGFP-MRP1T和pcDNA-MRP1表达质粒．质粒pEGFP-MRP1T分别与3个pSIREN-siRNAs共转染HEK293细胞沉默MRP1T-GFP靶基因,pSIREN-siRNA1作为阴性对照.荧光显微镜下显示结果表明,与pSIREN-siRNA1相比,pSIREN-siRNA2和pSIREN-siRNA3产生的siRNA能够有效沉默MRP1T-GFP融合蛋白的表达．为了沉默全长MRP1基因的表达,pcDNA-MRP1分别与3个pSIREN-siRNAs共转染HEK293细胞．Western印迹和MTT分析表明,pSIREN-siRNA2和pSIREN- siRNA3能有效抑制190 kD MRP1在HEK293细胞中的表达,而pSIREN-siRNA1则不能．pSIREN-siRNA2和pSIREN-siRNA3能逆转MRP1转染HEK293细胞产生的多药耐药性．RNA二级结构预测结果分析表明,siRNA1靶序列mRNA局部自由能热动力参数ΔG低于siRNA2和siRNA3靶序列mRNA局部自由能热动力参数,siRNA1的GC含量和Tm值高于siRNA2和siRNA3．这些数据提示,siRNA和局部靶结构可能影响siRNA对MRP1 mRNA表达的沉默作用．     

T型钙通道α1G亚单位在细胞增殖中的功能研究

利用稳定过表达人类T型钙通道α_(1G)亚单位的HEK-293细胞研究了T型钙通道在细胞增殖中的作用。RT-PCR和标准全细胞膜片钳记录分别从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白功能水平验证了α_(1G)单位的过表达的实现。生长曲线表明,T型钙通道α_(1G)亚单位的过表达能显著促进细胞增殖,HEKα_(1G)~+细胞的细胞群体倍增时间(13.7±0.3h)比对照HEK-293细胞的细胞群体倍增时间(22.1±1.1h)缩短了约8h;流式细胞分析结果也与此吻合,在稳定过表达了人类T型钙通道α_(1G)亚单位的细胞处于S期的细胞百分率比对照HEK-293细胞高,相反地处于G_0/G_1期的百分率比对照HEK-293细胞低,以上结果证明过表达T型钙通道α_(1G)亚单位能促进细胞增殖;T型钙通道特异性阻断剂mibefradil抑制HEKα_(1G)~+细胞增殖,IC_(50)为3.5/μmol/L,表明在HEK-293细胞过表达T型钙通道对细胞增殖的促进作用可以被T型钙通道特异性阻断剂mibefradil抑制,这就进一步证明了T型钙通道在促进细胞增殖方面的直接作用。Western杂交结果提示了T型钙通道α_(1G)亚单位的表达是通过某种信号途径提高了与细胞周期有关的蛋白质,cyclin A、cyclin E和CDK2的表达水平,从而刺激了细胞周期的进程。本研究有助于理解细胞增殖的机制并为开发治疗与细胞增殖异常有关疾病的新药提供了理论依据。     

p21在滋养细胞迁移和侵袭中的作用研究

目的探究p21基因在正常滋养细胞迁移和侵袭中的作用以及可能的机制。方法通过siRNA敲低滋养细胞HTR-8/SVneo中的p21基因。通过细胞增殖实验、划痕实验以及Transwell小室侵袭实验,来观察p21敲低的滋养细胞迁移和侵袭能力的变化。通过实时荧光定量PCR(qPCR)和免疫印记分析(Western Blot),在mRNA和蛋白质水平上检测p21敲低对ERK3和MMP2表达的影响。结果 p21敲低的滋养细胞迁移和侵袭能力显著减弱,但对细胞增殖无影响。ERK3及MMP2在mRNA和蛋白质水平上的表达都显著降低。结论以上结果说明p21基因能促进正常滋养细胞的运动能力,这种作用与调节ERK3和MMP2的表达有关。     

PNAS：细胞间存传递致癌蛋白“木马”

据美国物理学家组织网报道,北卡罗莱纳大学科学家的一项最新发现显示,细胞感染人类疱疹病毒（EBV）后,会产生小泡或被称为外体的液囊。从而改变细胞中所含的蛋白质和RNA（核糖核酸）。这种变质的外体一旦进入健康细胞,就能转变细胞的良性生长方式。使之变成不可控的致癌生长。这一发现刊登于美国《国家科学院院刊》网络版。     

早老素通过下调CDK4使HEK293T细胞周期阻滞

早老素（progerin）的累积导致儿童早老症（Hutchinson Gilford progeria syndrome, HGPS）的发生,并与正常衰老相关。早老素能使细胞内稳态失衡但分子机制仍有待深入研究。本研究旨在探讨早老素导入人胚胎肾293T细胞（human embryo kidney 293T cell, HEK293T）后细胞增殖、周期变化的分子机制。形态学观察发现过表达早老素的HEK293T细胞密度下降,(57±2.47)%细胞核形态皱缩。细胞增殖和周期实验证明早老素使细胞增殖减慢,发生G1/S期阻滞,G1细胞从 (42.3±1.31)%升至(47.2±1.26)%,而S期细胞从 (43.1±1.36)%降至 (38.5±1.42)%。Western印迹结果显示早老素的高表达引起p21蛋白表达上调（103.2±1.49）%,CDK4下调（63±1.52）%,而p53、ATM、CyclinE1以及p16等蛋白质水平均不变;HEK293T细胞中早老素的过表达导致γ H2AX水平下调（53±1.36）%,H2O2处理后变化趋势不变。我们的研究结果提示,早老素通过上调p21和下调CDK4使细胞发生周期阻滞,不能增加HEK293T细胞的损伤及衰老。     

人类癌症患者的改变的蛋白质

业已有一名患有慢性骨髓性白血病(一种常见的成人白血病)患者的细胞中检出一种正常细胞蛋白质的变异。洛杉矶加利福尼亚大学的Owen Witte说:“由于这种蛋白质及其生物化学活性的检出,很可能找到了确诊慢性骨髓性白血病生物化学标志”。这个发现还促进了对遗传改变如何诱发癌症的了解。它把引起动物癌症的病毒基因的研究和癌症与染色体异常的关系的临床研究结合在一起。科学家在研究一种引起小鼠白血病的病毒时发现,称为V-abl的关键基因会编码一种能够催化在蛋白质的某些位点(酪氨酸)上增加一个磷酸基的蛋白质。业已证明,这种磷酸化(或激酶)活性亦与其它癌症的恶性有关。病毒基因V-abl与细胞基因C-abl密     

腺病毒E1B-19K基因过表达对HEK293细胞生长和代谢的影响

细胞凋亡是动物细胞大规模培养中影响活细胞密度和目的产品质量的重要因素,过表达抗凋亡基因是目前常用的提高工程细胞凋亡抗性的一种策略。拟在HEK293细胞中过表达腺病毒E1B-19K基因,挑取了不同E1B-19K表达水平的单克隆细胞,考察在不同培养条件下细胞的凋亡水平和代谢情况。E1B-19K的过表达可显著增强细胞在低葡萄糖、低血清和无谷氨酰胺3种培养条件下的抗凋亡能力,使凋亡细胞比例降低60%~80%;E1B-19K的过表达可使批次培养HEK293细胞的衰退期延迟2天,而对细胞的葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺等的代谢无显著影响。结果表明,过表达E1B-19K是一种有效减缓HEK293细胞在培养过程中凋亡的策略。     

正常肝信息核糖核酸的翻译和对离体肝癌细胞的逆转分化作用

正常肝信息核糖核酸是从肝聚核蛋白体抽提RNA,通过寡聚(dT)纤维素亲和层析制备。分离的正常肝mRNA在麦胚蛋白合成系统和爪蟾卵翻译系统检定,能够翻译白蛋白,由此证明是有生物学活性的。用正常肝mRNA在离体情况下对肝癌细胞进行逆转分化研究,发现:(1)小鼠正常肝mRNA能抑制小鼠腹水肝癌细胞核酸和蛋白质的合成;初步见到人的正常肝mRNA能轻度抑制人体肝癌细胞(BEL-7404)的生长。(2)相应的正常肝mRNA分别在小鼠腹水肝癌和人肝癌细胞诱导了白蛋白合成;在人体肝癌细胞内核蛋白体聚成聚核蛋白体。(3)人体肝癌细胞受刀豆凝集素(Con A)凝集的能力减弱,这种凝集特性的改变,可以维持至3次细胞传代。这些实验结果显示肝癌细胞并非固定不可改变的,在正常肝mRNA作用下能够向正常逆转分化;讨论了mRNA转化机理,认为可能是通过肝mRNA翻译的蛋白质或mRNA本身直接调节基因转录来实现的。     

人体肝癌细胞急性低氧及低氧习服差异表达基因分析

本文分析了人体肝癌细胞(HepG2)急性低氧处理以及低氧习服处理后基因表达谱的改变。急性低氧处理为细胞在1％氧气中培养48h,低氧习服处理为细胞在1％氧气中培养24h,常氧培养24h,以此作为一个周期,重复6个周期。联合应用抑制消减杂交技术和cDNA芯片技术,筛选HepG2细胞经急性低氧处理与正常培养细胞相比差异表达的基因,以及经低氧习服处理细胞与正常培养细胞相比差异表达的基因。结果显示,HepG2细胞经急性低氧处理与在常氧条件下培养相比,差异表达的基因有37个,表达水平全部表现为下调,其中包括参与细胞周期、细胞应激、细胞信号转导、细胞骨架形成、转录相关蛋白及细胞代谢相关蛋白的基因,1个未知基因序列、4个EST序列、5个线粒体蛋白基因,另外有功能不明的蛋白质基因12个。低氧习服处理的细胞与常氧条件下培养的细胞相比,差异表达的基因有6个,其中包括两个线粒体蛋白基因、金属蛋白酶1基因、转铁蛋白基因、Thymosin ．beta-4和TPT1基因。其中线粒体蛋白ND4、转铁蛋白、Thymosin.beta-4和TPT1基因的表达呈上调,线粒体NDl及金属蛋白酶1基因的表达水平呈下调。经低氧习服处理后,细胞低氧耐受力提高,低氧习服处理细胞基因的表达与急性低氧处理细胞和正常培养细胞的基因表达不同,这种变化可能与低氧习服细胞低氧耐受力的增强有关。     

果蝇来源的GPCR Methuselah G蛋白偶联信号转导通路研究

Methuselah(MTH)是果蝇来源的GPCR中的一员,它的突变可延长果蝇平均寿命并提高果蝇对外界胁迫因素的耐受性。但目前对MTH在细胞水平的信号转导研究鲜有报道。该研究用稳定表达MTH的HEK293细胞株,对与该受体偶联的G蛋白选择性做了研究。首先,用免疫荧光染色、Western blot及钙流实验验证了MTH在HEK293/Myc-MTH细胞表面能稳定表达,且具有正常生物学活性;MTH受体被其配体N-stunted活化后所引起细胞内钙的上升不能被PTX预处理抑制,提示活化的MTH可能通过与Gq/11而非Gi/o蛋白相偶联;进一步研究发现,MTH激活后不显著改变细胞中的cAMP水平,表明MTH不与Gs和Gi/o相偶联;MTH被激活后可引起ERK磷酸化。这些结果提示:MTH可能是Gq/11蛋白的偶联受体,为进一步研究MTH的下游信号转导和生物学功能奠定了基础。     

肝癌亚细胞结构的蛋白质组分比较分析

运用亚细胞蛋白质组学的研究策略,分离纯化亚细胞结构,可以提高低丰度蛋白质在双向电泳中检出的数量。通过对比分析肝癌细胞与正常肝细胞线粒体、细胞核蛋白质组的差异表达情况,为肝癌发病机理的研究提供更多、更有价值的信息。以体外培养的人体肝癌细胞QGY-7703与正常肝细胞LO2为研究模型,通过超离心的方法分离细胞的线粒体和细胞核。双向电泳分离线粒体和细胞核的蛋白质,图像分析筛选差异表达蛋白斑点,MALDI-TOF-MS鉴定蛋白质。从线粒体、细胞核的蛋白质电泳图谱中筛选出54个候选差异表达的蛋白质斑点,质谱鉴定出22种差异表达蛋白质,其中17种在肝癌细胞中表达上调,5种在肝癌细胞中表达下调。筛选出的差异表达蛋白质涉及到细胞的能量代谢、蛋白质合成、细胞骨架与核骨架的改变、mRNA的加工成熟及凋亡调控等许多方面,表明癌变细胞的组织结构和代谢状态都发生了很大的变化。     

RKIP低表达与鼻咽癌侵袭转移和NF-κB信号通路活化相关

为筛选鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)发病相关的蛋白质,采用双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)和质谱(mass spectrometry,MS)技术比较NPC组织与癌旁正常鼻咽上皮组织(adjacent normal nasopharyngeal epithelial tissue,ANNET)蛋白质表达的差异,鉴定了21个差异蛋白,其中Raf 激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein,RKIP)等9个蛋白质在NPC组织中的表达水平低于ANNET．为探讨RKIP在NPC转移中的作用和机制,采用Western blot检测RKIP在不同转移潜能的5-8F和6-10B NPC细胞中的表达水平,采用免疫组化方法检查RKIP在石蜡包埋NPC组织、正常鼻咽上皮组织(normal nasopharyngeal epithelial tissue,NNET))及颈淋巴结转移NPC组织(lymphnode metastatic NPC,LMNPC)中的表达水平,采用脂质体转染方法将正义、反义RKIP表达质粒及其相应空白载体分别转染5-8F和6-10B细胞,建立相应的稳定转染细胞系,分析RKIP表达水平改变对NPC细胞体外侵袭能力和NF-κB信号通路活性的影响．结果显示：RKIP在高转移5-8F细胞中的表达水平低于非转移6-10B细胞、在NPC组织中的表达水平低于NNET、在转移癌中表达缺失．上调RKIP表达能抑制5-8F细胞的侵袭能力,而下调RKIP表达能增强6-10B细胞的侵袭能力;上调RKIP表达能降低5-8F细胞的p-IκB-α水平和NF-κB的转录活性,而下调RKIP表达能增加6-10B细胞的p-IκB-α水平和NF-κB的转录活性．研究结果提示,RKIP 可能是NPC的一个转移抑制蛋白,RKIP表达下调可能通过活化NF-κB信号通路促进NPC细胞侵袭和转移．     

多核酶表达系统在HEK293细胞中对多药耐药相关蛋白（MRP1）的表达抑制作用

为了研究多核酶表达系统在HEK293细胞中对多药耐药相关蛋白表达抑制的作用．我们构建了含有20个可以自身切割的顺式作用核酶和10个靶向MRP1基因特定位点的反式作用核酶的多核酶表达系统。利用RT—PCR、Westem blot和MTT分析了多核酶系统分别与MRP1靶基因质粒和MRP1 全长基因质粒共转染的HEK293细胞。结果显示．多核酶表达系统能够明显降低荧光融合蛋白在HEK293细胞中的表达。RT—PCR分析表明．懈用靶mRNA降低程度与多核酶表达系统所含的反式作用核酶数目有关。Westernblot分析显示了与RT—PCR相似的结果。Mrrr分析表明,多核酶表达系统能够逆转由MRP1基因转染HEK293细胞产生的多药耐药性。结果提示．含有多个核酶的表达系统对MRP1基因的抑制效应优于单核酶的表达系统。因此．该策略可能用于基因治疗肿瘤或其他疾病．