有机相脂肪酶催化酮基布洛芬的立体选择性酯化*

从５种脂肪酸中筛选出了具有较高催化活性和对映体选择性的脂肪酶Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５。进一步探讨了酶浓度、底物结构、底物浓度等因素对脂肪酶拆分酮基布洛芬（Ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）的影响。结果表明,以１０ｍＬ除水环己烷为反应介质,酶浓度为 ５ｍｇ／ ｍＬ, Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５催化 ６．７ｍｍｏｌ／ Ｌ Ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ与２６．８ｍｍｏｌ／ Ｌ丙醇进行酯化反应,反应 ３０ｈ,转化率为 ６８％时,Ｓ－酮基布洛芬对映作过剩值可达 ９２％。     

微环境对脂肪酶催化酮基布洛芬立体选择性酯化的影响*

系统研究了反应介质、助溶剂、水活度、温度、ｐＨ等因素对脂肪酶Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５催化酮基布洛芬动力学拆分的影响。以环己烷为反应介质,酶表现出较高的催化活性和对映体选择性;在环己烷中添加苯,可大幅度提高Ｅ值;适宜的反应温度为３０℃;最适反应初始水活度为０．０９;在所研究的ｐＨ６～８范围内,ｐＨ对酶活及酶的体选择性影响不大。     

拆分获得(S)-酮基布洛芬脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆与表达

【目的】筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因,构建其表达分泌型工程菌,并进一步提高该脂肪酶的立体选择性。【方法】以自筛选出的一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的菌株NK13为材料,通过构建其基因组文库,筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因。通过构建该脂肪酶基因的分泌型诱导表达载体pHY300-plk-sacR-gene,将其转入枯草芽孢杆菌WB600,获得基因重组菌WB600(pHY300-plk-sacR-gene)。用SDS-PAGE检测其表达和转化情况,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法纯化脂肪酶;并利用TLC和HPLC检测该酶的立体选择专一性。【结果】得到了具有专一性拆分获得(S)-酮基布洛芬能力、长度为633bp的脂肪酶基因(GenBank登录号为:EU381317)。该脂肪酶在枯草芽孢杆菌WB600中得到了分泌表达。TLC和HPLC检测结果显示,纯化的脂肪酶对底物转化40h时转化率为30%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达60.02%,与未加Tween-80的枯草芽孢杆菌转化子体系相同。而在含Tween-80的环境下,枯草芽孢杆菌表达重组菌对底物转化36h时转化率约为45%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达93.64%,是野生菌NK13的16倍。【结论】从NK13号菌株中筛选得到的新的脂肪酶具有很高的不对称拆分获得(S)-酮基布洛芬的能力,实现了NK13菌中633bp脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,研究证明Tween-80能提高该脂肪酶的拆分专一性。     

混合溶剂系统对脂肪酶酯化活性和选择性的影响

目前非水介质中的酶促反应主要局限于单一有机溶剂系统。为使非水相酶反应顺利进行,所用反应介质一般必须满足２个条件：（１）具有较高的疏水性（ＬｏｇＰ值）［１］;（２）易于溶解底物。然而对于一些２芳基丙酸（如酮基布洛芬,以下简称酮洛芬）的酶促酯化反应［２...     

酮基布洛芬拆分用酯酶产生菌的筛选及其催化特性

从土壤中筛选获得一株可以高对映选择性水解酮基布洛芬乙酯的酵母KET4,经鉴定为芸苔丝孢酵母（Trichosporon brassicae）。研究了该菌的生长和产酶过程,考察了其静息细胞对酮基布洛芬乙酯水解的催化特性。用该菌催化酯水解时,转化率为41%时,产物的对映体过量值为91%,对映选择率达到45。     

酮基布洛芬拆分用酯酶产生菌的筛选及其催化特性*

从土攘中筛选获得一株可以高对映选择性水解酮基布洛芬乙酯的酵母KET4,经鉴定为芸苔丝孢酵母（Trichosporon　brassicae）。研究了该菌的生长和产酶过程,考察了其静息细胞对酮基布洛芬乙酯水解的催化特性。用该菌催化酯水解时,转化率为41％时,产物的对映体过量值为91％,对映选择率达到45。     

(S)-酮基布洛芬拆分用脂肪酶基因的克隆及表达

本实验室筛选出一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯的菌株NK13为材料,经鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。通过构建其基因文库,从中筛选得到阳性克隆重组子pUC-NK1。测序分析表明,该重组子质粒中包含一长度为633bp的脂肪酶基因的完整开放阅读框,核苷酸同源性对比证明该脂肪酶基因属首次发现(GenBank Accession No.EU381317),将此基因克隆到原核表达载体pET21b(+)中构建重组表达质粒pET-NKest1,转化Escherichia coli BL21,经Isopropyl-β-D-Thiogalactoside(IPTG)诱导在宿主菌中得到表达,经SDS-PAGE电泳检测证明该脂肪酶成熟蛋白分子量约为20kDa。薄层层析与HPLC检测结果显示,表达菌株转化外消旋酮基布洛芬氯乙酯得到(S)-酮基布洛芬过量(e.e.%),由野生菌NK13的5.84%提高到75.28%,提高约15倍,说明该脂肪酶具有优先拆分得到(S)-酮基布洛芬的特性。     

非水介质中脂肪酶催化的手性拆分研究进展

脂肪酶催化的外消旋体动力学拆分是不对称催化领域中极具吸引力且发展非常迅速的重要技术。对这一领域的最新研究进展进行了调研,并将注意力集中于脂肪酶在非水溶剂中的应用。引用最近五年中的一些文献案例,说明了脂肪酶作为立体选择性生物催化剂在外消旋体拆分中的多样化功能和应用。     

非水相脂肪酶催化有机硅醇的酯化反应

非水相酶催化是酶工程研究热点之一。本文介绍了来自Ｃ．ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ的脂肪酶催化有机硅醇和脂肪酸的酯化反应。该酶可催化有机硅醇与脂肪酸的酯化反应,并对不同链长的脂肪酸底物、有机溶剂极性及水含量等进行了初步研究。     

微水相脂肪酶催化乙酸甲基苯甲酯立体选择性氨解反应

从4种不同来源的脂肪酶,2种不同来源的蛋白酶中筛选出了具有较高活性和对映体选择性的能催化乙酸甲基苯甲酯氨解反应的脂肪酶Novozym 435。进一步探讨了氨源、酶浓度、底物等因素对该酶反应的影响。结果表明,在优化条件下,氨解反应6h,转化率为51.6%,残留底物中（－）－乙酸甲基苯甲酯对映体过剩值可达99％以上。     

Kinetic resolution of ketoprofen ester catalyzed by lipase from a mutant of CBS 5791

A biotransformation process was developed for the production of (S)-ketoprofen by enantioseletive hydrolysis of racemic ketoprofen ester using the mutant Trichosporon laibacchii strain CBS 5791. A satisfactory result was obtained, in which the E was 82.5, with an ee of 0.94 and a conversion of 0.47 under the optimum hydrolysis conditions [E is enantiomeric ratio, E=ln[1–X(1+ee)]/ln[1–X(1–ee)]; ee is enantiomeric excess, ee=(C_S–C_R)/(C_S+C_R): temperature of hydrolysis was 23°C]. The medium used in biotransformation was a mixture of growth broth and biotransformation broth at a ratio of 1:9, the concentration of Tween 80 was 15 g/l, the time of hydrolysis, 72 h. These results are promising for further scale-up. Tween 80 significantly improved lipase enantioselectivity and activity at the optimum concentration.     

脂肪酶催化有机硅化合物的生物转化

C.cylindracea脂肪酶可催化有机介质中有机硅醇与脂肪酸的酯化反应。微水有机介质比水-水不溶有机介质更有利于酶的反应,有机硅醇是比其碳结构类似物更好的酰基受体。对不同有机硅醇底物,当其空间障碍大时,不利于酶催化酯化反应,对不同脂肪酸底物,有机硅醇未影响该脂肪酶的脂肪酸底物特异性。