重组人α2a干扰素的高效表达与纯化

构建了人α2a型干扰素的表达载体,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量平均为10~ IU/L菌液。还对其表达产物进行了纯化。经盐酸胍裂解菌体、硫酸铵沉淀、酸化处理,再经阴、阳离子交换层析和单克隆抗体亲和层析,使表达产物纯化了1072倍,比活性达1.2×IO~ IU/mg蛋白,达到序列纯,回收率达54％。表达产物N端21个氨基酸序列分析结果与IFN-α2a cDNA推导的序列相符合。     

重组人干扰素α2b的提取和纯化

为了提高重组人干扰素α2b的质量 ,增加产量 ,降低成本 ,通过破菌 ,包涵体提取 ,离子交换层析 ,凝胶过滤等纯化方法制备干扰素纯品。结果表明干扰素纯度可达 95%以上 ,比活达到 1.2× 10 8IU/mg以上。结果提示 ,采用本方法收率高 ,纯度好 ,工艺稳定 ,适合大规模生产     

重组人干扰素α2b阴道泡腾片的研制

目的:制备重组人干扰素α2b阴道泡腾片,并对其质量和局部用药安全性进行研究。方法:将重组人干扰素α2b经制粒干燥,用酸、碱分开制粒法制备重组人干扰素α2b阴道泡腾片,按照《中国药典》对其性状、重量差异、崩解时限、pH、干扰素效价、水份含量、稳定性以及局部刺激性进行了考察。结果:本品处方、工艺合理,制备过程对干扰素生物活性影响较小;制剂质量符合规定,在4℃低温条件下保存具有较好的稳定性;局部刺激试验对家兔阴道组织无明显的刺激性。结论:该制剂质量稳定、可控,具有良好的稳定性和安全性。     

注射用重组人干扰素α2b冻干制剂稳定性试验

本文通过对三批注射用重组人干扰素α２ｂ（ｒＩＦＮ－α２ｂ）冻干制剂在不同温度下,保存不同时间取样,对其外观、生物学活性、ｐＨ值、溶解状态及无菌试验等各项理化指标的观察试验,结果本品的冻干制剂在－２０℃和４－８℃的条件下保存４２个月,其上述各项检定指标无明显变化,均符合质检规程,即本文制品在此条件下稳定性良好,有效期可定为三年。同时说明该产品的生产工艺稳定。     

疏水相互作用层析分离重组人干扰素α2b

目的采用疏水相互作用层析分离重组人干扰素α2b,去除干扰素样品中的二聚体,得到高纯度的干扰素用于进一步的研究。方法首先采用阳离子交换层析纯化复性重组人干扰素α2b,去除了大部分的杂蛋白,然后采用疏水相互作用层析纯化重组人干扰素α2b,去除复性过程中产生的错误折叠体和二聚体,并考察盐浓度、pH值、流速和洗脱液中尿素对疏水相互作用层析纯化效果的影响。结果硫酸铵初始浓度1.2 mol/L、缓冲液pH值6.0、流速2.5 mL/min、洗脱液中添加尿素浓度为2 mol/L时疏水相互作用层析纯化效果最佳。最终得到的重组人干扰素α2b非还原型SDS-PAGE电泳均呈单一条带。结论确定了疏水层析纯化重组人干扰素α2b的最优条件,成功提取到具有高活性、高纯度的重组人干扰素α2b纯品。     

重组人干扰素α2b栓剂稳定性研究

将重组人干扰素α2b栓剂在不同温度下保存不同时间,检验干扰素生物活性、溶出度试验、融变时限、pH值和微生物限度及外观的稳定性。重组人干扰素α2b栓剂在4~8℃条件下放置48个月;在20~25℃条件下放置24个月IFN生物活性未见下降,37℃放置4个月IFN生物活性未见下降。重组人干扰素α2b栓剂的生物学活性及理化性质有较好的稳定性。     

重组人干扰素α2b栓剂稳定性研究

研究重组人干扰素α2b栓剂的稳定性。方法将重组人干扰素α2b栓在不同温度下保存不同时间,分别检验干扰素生物学活性、溶出度试验、融变时限、pH和微生物限度及外观的稳定性。结果重组人干扰素α2b栓在4~8℃条件下放置当时和放置48个月后的IFN生物学活性基本一致,未见下降;在20~25℃条件下放置24个月后IFN生物学活性未见下降,放置32个月后活性下降32%,36个月后IFN生物学活性下降55%;37℃条件下放置4个月后IFN生物学活性未见下降。结论重组人干扰素α2b栓剂的生物学活性及理化性质的稳定性好。     

重组人a2b型干扰素的纯化与鉴定

采用单克隆抗体亲和层析一步纯化法对大肠杆菌表达的重组人ａ２ｂ型干扰素进行了纯化,然后利用凝胶过滤高压液相层析、ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｎ端２５个氨基酸的序列测定等方法对纯化产品进行了鉴定。表明一步纯化的ＩＦＮ－ａ２ｂ达到９５％以上的统一计划,其比活性为２．５４×１０×８ｕ／ｍｇ．但重组ＩＦＮ－ａ２ｂ产品Ｎ端不均一,含有约３０％的去Ｍｅｔ分子和约７０％的带Ｍｅｔ分子。从蛋白质序列的水平上证实,本     

重组人干扰素α-2b滴鼻剂的研制

重组人干扰素α-2b(rIFNα-2b)滴鼻剂的试制及临床前工作研究.进行了理化和生物学性质试验、稳定性试验、鼻腔局部刺激性试验、急性毒性试验、长期毒性试验和动物体内抗病毒试验等.本品连续三批工艺稳定,检定合格,性质稳定,2～8℃保存24个月后生物学活性无明显下降,使用安全,无不良反应.其它各项试验均符合现行<中国药典>的要求.表明该制剂具有比较好的开发与应用前景.     

重组αⅠb干扰素软膏对豚鼠皮肤疱疹病毒感染的作用

报道了重组α1b干扰素软膏对豚鼠皮肤单纯疱疹病毒感染 的局部治疗的效果。目的是在疱疹病毒感染的动物模型上证实α1b干扰素软膏的治疗作用，为该药的临床应用提供临床前药效学资料。结果表明α1b干扰素软膏对疱疹病毒的 皮肤感染具有缩短病程，促进结痂及痊愈的效果，可作为一种外用抗疱疹病毒药物应用于临床。     

聚乙二醇修饰重组人干扰素α-2b的碘染色法

目的：建立检测聚乙二醇位点特异性修饰重组人干扰素α-2b反应的方法。方法：采用分子量20000的甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺修饰重组人干扰素α-2b,反应混合物样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后,碘染色法判断反应产物组成。结果：该修饰反应产物除含有单PEG化的干扰素α-2b外,还有不同修饰程度的多PEG化干扰素。结论：本方法方便快捷、分辨率高、特异性强,同时可用于其它聚乙二醇修饰蛋白质的分析研究。     

重组α_Ⅰb干扰素软膏对豚鼠皮肤疱疹病毒感染的作用

报道了重组α1b干扰素软膏对豚鼠皮肤单纯疱疹病毒感染的局部治疗的效果。目的是在疱疹病毒感染的动物模型上证实α1b干扰素软膏的治疗作用 ,为该药的临床应用提供临床前药效学资料。结果表明α1b干扰素软膏对疱疹病毒的皮肤感染具有缩短病程 ,促进结痂及痊愈的效果 ,可作为一种外用抗疱疹病毒药物应用于临床。     

人干扰素α-2b生产工艺的研究

人干扰素α-2b的简易、高效生产工艺研究,包括高效率、小型化的发酵技术．不用单克隆抗体亲和层析的纯化工序．以及大肠杆菌表达的人干扰索α-2b包涵体蛋白的天然构型复性等问题．从10L基因工程大肠杆菌发酵液所得l000g菌体中得人干扰素α-2b约500mg,效价为l×10³u／mg,设备投资少,生产成本低,产品表现了高纯度、高效价。适宜大量生产,为广大人民群众提供廉价高质量药品创造了条件。     

重组人干扰素α-2b注射液雾化吸入与重组人干扰素α-2b喷雾剂局部外用喷咽部治疗手足口病的疗效

目的:探讨重组人干扰素α-2b注射液雾化吸入与重组人干扰素α-2b喷雾剂局部外用喷咽部治疗手足口病的疗效。方法:选择2016年1月至2017年12月就诊于河北省儿童医院的160例手足口病患儿作为研究对象,通过随机数表法分为对照组和试验组,每组80例。2组均给予手足口病常规治疗措施,对照组在此常规治疗基础上给予重组人干扰素α-2b喷雾剂治疗,喷涂于咽喉部,每次1喷,3次/d,试验组在常规治疗基础上,给予重组人干扰素α-2b注射液10万U(kg·次)加入生理盐水2 m L中进行雾化吸入治疗,2次/d;2组疗程均为3～5d。比较2组临床疗效、临床症状改善时间、血清指标及不良反应。结果:治疗后,试验组和对照组临床疗效总有效率分别为91.25%(73/80)和76.25%(61/80),差异具有统计学意义(P0.05);试验组和对照组体温正常时间分别为(2.78±0.42)和(4.13±0.58)d,皮疹消退时间分别为(3.53±0.55)和(5.05±0.63)d,口腔溃疡愈合时间分别为(3.35±0.58)和(4.80±0.58)d,正常进食时间分别为(3.91±0.58)和(4.98±0.50)d,住院时间分别为(5.91±0.92)和(8.14±0.81)d,差异均具有统计学意义(P0.05);治疗后,试验组和对照组血清淀粉样蛋白A(SAA)分别为(133.43±25.74)和(178.53±26.96)mg·L~(-1),C反应蛋白(CRP)分别为(4.75±0.71)和(8.54±1.29)mg·L~(-1),差异均具有统计学意义(P0.05);治疗期间,对照组出现恶心呕吐5例,皮疹1例,试验组出现7例恶心呕吐,2例腹泻,2组不良反应总发生率分别为7.50(6/80)、11.25%(9/80),比较无显著差异(P0.05)。结论:在手足口病患儿中使用重组人干扰素α-2b注射液雾化吸入效果显著,可有效促进疾病缓解,且用药安全性高,值得应用推广。     

重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂预防治疗恒河猴感染SARS-CoV病毒的作用效果试验

[目的]评价重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂对预防治疗SARS-CoV病毒感染恒河猴的作用。[方法]10只恒河猴随机分为2组,每组5只。分别为试验组(重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂)和对照组(空白干扰素)。分别在攻毒前19h和1h,攻毒后7h、23h、31h、47h、55h、71h、95h和119h不同时间经鼻吸入受试物,0.4ml/只。按计划定时取咽拭子做real-timePCR检测和病毒分离;取静脉血做病毒分离检测、中和抗体、IgG、血常规、血生化和血凝指标。[结果]1.SARS感染对照组:全部动物咽拭子标本经real-timePCR均检出SARS-CoV病毒,持续时间从攻毒后2天至8天。攻毒后2天3只、5天1只、7天2只,其咽拭子标本中病毒分离阳性,进一步证实病毒在体内的复制。攻毒后,诱导产生高滴度的抗体和中和抗体,证实病毒感染。大体解剖全部动物肺脏为灰白色,有大面积出血,其中2只动物肺脏与胸壁有粘连,组织病理称典型SARS肺炎性病变。2.干扰素试验组:和对照组相同时间取的咽拭子等标本中,real-timePCR检测和病毒分离均未检出病毒。攻毒后病毒导致机体产生的中和抗体和IgG抗体的反应很弱。血常规、血生化和血凝指标结果表明干扰素试验组动物攻毒后各项指标较试验前比较没有显著性改变;大体解剖动物肺脏为灰粉色,4只动物肺脏有少量出血,其中1只动物肺脏与胸壁有粘连,组织病理未见典型SARS肺炎性病变。因而认为,重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂可以有效阻断SARS-CoV病毒对恒河猴的感染;;为预防人类感染SARS提供参考。     

人干扰素α—2b生产工艺的研究

人干扰素α-2b的简易、高效生产工艺研究,包括高效率、小型化的发酵技术,不用单克隆抗体亲和层析的纯化工序,以及大肠杆菌表达的人干扰素α-2b包涵体蛋白的天然构型复性等问题,从10L基因工程大肠杆菌发酵液所得1000g菌体中得人干扰素α-2b约500mg,效价为1×10~8u/mg,设备投资少,生产成本低,产品表现了高纯度、高效价。适宜大量生产,为广大人民群众提供廉价高质量药品创造了条件。     

聚乙二醇化重组人干扰素α-2b体外抗乙肝病毒作用的研究

研究聚乙二醇化重组人干扰素α-2b（PEG-IFN）和重组人干扰素α-2b（IFN）的体外抗乙型肝炎病毒作用。以HepG2.2.15为细胞模型,采用MTT法考察两种药物对细胞的毒性作用;分别以高、中、低剂量的PEG-IFN和IFN每隔一日反复作用细胞,连续8d,采用ELISA法测定细胞上清液中的HBsAg来考察两种药物对病毒的抑制作用;将相同剂量的PEG-IFN和IFN模拟临床给药频率作用细胞一周,即PEG-IFN给药1次,IFN给药3次,观察细胞HBsAg的分泌情况,评价药效。PEG-IFN和IFN的TC50均〉20000IU/mL,IC50分别为559.88、478.71IU/mL;反复给药时,高、中、低3个剂量组的PEG-IFN对病毒的抑制作用略低于同剂量的IFN;模拟临床给药一周后发现,PEG-IFN与IFN对病毒的抑制作用无明显差异。PEG-IFN和IFN在体外均可抑制HepG2.2.15细胞乙肝病毒的表达。     

α2a型基因工程干扰素发酵工艺的研究

对干扰素工程菌PBV320／7118－α2a型发酵工艺,由批式培养改为反馈式流加培养^[1]可显著提高工程菌PBV320／7188－α2a在40L发酵罐中的菌体产量及干扰素的表达水平。     

重组酵母产人IFN-α2a与LL-37融合蛋白的工艺优化

通过单因素试验探索重组酵母P.pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的最佳条件。结果显示,重组酵母菌产蛋白酶的最佳表达条件是利用BMMY为诱导培养基,以接种量OD600=5.5、温度26℃、p H6.0、诱导剂(甲醇)为每隔24 h添加1.0%、振荡速度为200 r/min条件下连续诱导144 h。在最佳培养条件下,发酵液中的LL-37最高抗菌活性达27.9 mm。与初始的发酵条件相比,人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的产量提高了32.29%。     

重组人α8型干扰素的纯化与鉴定

采用酵母表达载体进行重组人α８型干扰素（ＨｕＩＦＮα８）的表达,该表达菌株可将重组α８型干扰素分泌进入培养基中,回收培养基进行纯化,然后利用超滤浓缩,先过Ｓ．ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱,再进行ＤＥＡＥ-ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ层析和Ｇ-２５脱盐,最后用高效液相ＨＰＬＣ,ＳＤＳ-ＰＡＧＥ丙烯酰胺凝胶电泳及肽图等方法对纯化产品进行鉴定。采用以上两步纯化方法纯化酵母分泌表达的重组人α８型干扰素纯度可达９５％以上,其比活性为３.０×１０^８ｕ／ｍｇ。