来源于Aspergillus candidus的乳糖酶基因的克隆及序列分析

从一株产乳糖酶的亮白曲霉（Aspergillus candidus)中克隆到了乳糖酶基因组DNA及cDNA序列（EMBL AC－CESSION No.AJ431643),序列分析表明,乳糖酶基因组DNA序列长3458bp,其中含有8个内含子,cDNA编码区长3015bp,共编码1005个氨基酸,前19个氨基酸为信号肽序列,氨基酸序列中共含有11个潜在的糖基化位点。将此基因在不同来源的乳糖酶基因序列进行比较发现,该基因与绝大多数乳糖酶基因同源性较低。虽与米曲霉ATCC20423的乳糖酶序列同源性较高,但其在酶学性质上更优于后者,亮白曲霉的乳糖酶基因可能是一个具有更广阔的生产应用前景的新基因。     

青花菜雄性不育相关基因BoDHAR的克隆与表达分析

以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段的序列为信息探针,通过在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索,经人工拼接、RT-PCR、PCR 克隆与序列分析,获得了青花菜脱氢抗坏血酸还原酶DHAR dehydroascorbate reductase 基因的 cDNA 与 DNA 全长序列,命名为BoDHAR。并利用双链接头介导 PCR 的染色体步行技术（genome walking）克隆了其上游 644bp 的5′端序列。所获的BoDHAR基因全长 1486bp,存在两个内含子,DNA 编码区序列633bp,编码210个氨基酸;序列分析表明：BoDHAR与同源基因AT1G195701cDNA 序列有 82.3% 的一致性,推导的氨基酸序列有 79.6% 的一致性;编码的水溶性蛋白存在多个磷酸化位点;5′端上游区存在明显的转录调控序列。半定量RT-PCR结果表明：BoDHAR 在可育系花蕾中的表达量明显高于不育系花蕾,在花药中的表达明显高于其它部位。     

鳜鱼胰蛋白酶和淀粉酶与胃蛋白酶原基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR及RACE法,克隆得到鳜鱼(Siniperca chuatsi)肝胰脏胰蛋白酶(trypsin, Try)、淀粉酶(amylase, Amy)基因 cDNA全序列.结果表明,鳜鱼Try基因cDNA全长为896 bp,其中开放阅读框 (open reading frame,ORF)为744 bp,编码247个氨基酸. 序列同源性分析发现,鳜鱼Try与 斑马鱼(Danio rerio)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、 小鼠Try和人TRY氨基酸序列同源性分别为81.4%、75.3%、74.5%和71.4%.鳜鱼Amy 基因cDNA全长为1 647 bp,其中ORF为1 539 bp,编码512个氨基酸.鳜鱼Amy与斑马鱼 、非洲爪蟾、小鼠Amy和人AMY氨基酸序列同源性分别为79.7%、75.4%、71.9%和70.9%. 同时对鳜鱼基因组进行PCR,获得鳜鱼Try、Amy与胃蛋白酶原(pepsinogen, Pep)全基因组DNA序列.序列分析表明,鳜鱼Try基因由4个内含子和5个外显子组成,全长1 362 bp;鳜鱼Amy基因由8个内含子和9个外显子组成,全长4 267 bp;鳜鱼Pep基因由8个内含子和9个外显子组成,全长 4 032 bp,与其它脊椎动物基因结构相似.应用Genome walker方法在鳜鱼克隆得到长度分别为1 189 bp、413 bp和527 bp的Try、Amy和Pep基因的5′侧翼区序列以及1段长为704 bp的Pep 基因3′侧翼区序列,并利用相关软件预测其中具有多个可调节其表达的调控元件.鳜鱼Try、Am y和Pep基因组全序列的克隆及其序列、结构分析和分子系统进化等的研究,为鱼类消化代谢相关基因的生理功能及表达调控机理进一步研究提供依据.     

在胡杨NHX基因内发现细菌转座子IS10 L的存在

采用RTPCR扩增的方法,从新疆不同地区的野生植物胡杨中分别克隆获得1kb和2.3kb的cDNA片段,测序和序列分析表明这两个基因片段均包含NHX基因的部分读码框架,分别命名为PtNHX和PwNHX。PtNHX序列同源性分析结果显示胡杨NHX基因与滨藜NHX基因同源性高达98%,与碱蓬同源性达到86%,与拟南芥同源性为84%,与水稻同源性为80%,表明它是植物中高度保守的一种基因,同时说明野生植物胡杨中也存在与拟南芥相似的植物耐盐相关基因。PwNHX序列分析表明,该基因内部含有一种转座酶的读码框,大小约1350bp,与已发表的Shigella flexneri.转座子Tn10基因序列(AF162223)同源性为99%。NHX基因的蛋白产物在植物的耐盐性方面起着重要的作用。推测PwNHX由于插入转座酶读码框可能会导致该基因的功能丧失。胡杨生存于盐碱地,其体内可能存在另一些机制使胡杨具有抗盐碱的能力。对于这些机制的研究可能有助于进一步了解植物的抗盐机制。利用PwNHX基因内的转座子作基因标签,可进一步研究胡杨的其它基因,从而有可能揭示胡杨叶子发育的变态过程、耐盐碱等性状。     

单引物方法克隆盐角草orf25基因

采用单引物RTPCR扩增的方法,从新疆野生植物盐角草（Salicornia europaea）中克隆获得了1.7kb的cDNA片段,经过测序和序列分析,发现基因片段包含了orf25基因完整的读码框架。采用序列同源性分析方法,结果显示新疆盐角草orf25基因与甜菜线粒体同源性高达98%,与烟草线粒体同源性达到95%,与小麦同源性为92%,与玉米同源性为88%,表明orf25 基因在植物中是高度保守的一种基因, 同时说明野生植物盐角草中也存在与农作物相似的雄性不育相关基因,orf25 基因编码的功能性蛋白可能在影响植物雄性不育改良作物品种方面具有重要的意义。     

水稻Rac家族新成员osRACB基因的克隆及结构分析

Rac基因是植物中惟一的一类分布广泛的信号GTP结合蛋白, 它在整个植物生长发育过程中起着极为重要的作用. 应用本实验室已有的水稻光周期育性转换相关基因osRACD为探针, 在低严谨杂交条件下, 筛选农垦58N-LD雌雄蕊形成期(第Ⅳ期)幼穗cDNA文库, 获得一水稻Rac家族新基因. 经同源性比较和序列分析显示, 该基因与玉米Rac家族成员RACB基因具有93%的核苷酸同源性, 且两者氨基酸序列长度相等, 仅存在一个氨基酸残基差异, 故命名新基因为osRACD. 进一步应用PCR技术, 以农垦58N基因组DNA为模板扩增得到长度为2930 bp的osRACB基因转录区核苷酸序列, 其结构包含7个外显子和6个内含子, 同时, 通过基因组文库筛选获得osRACB基因的启动区序列. Southern杂交分析表明osRACB基因同其他Rac基因相似, 是低拷贝基因. RT-PCR检测显示osRACB基因在水稻根、茎、叶中均有一定的表达, 但在茎中表达量最高. 此外, 还以人Rac1蛋白为模板, 利用InsightII软件包下的Homology, Discover等模块对osRACB蛋白进行了三级结构预测.     

芒果生长素反应因子类蛋白的cDNA克隆和表达

通过SSH法获得了一个与不定根形成相关的差异表达的cDNA片段,其推导的氨基酸序列与拟南芥的生长素反应因子(ARF)类蛋白具有较大的同源性,因此将它命名为MiARF。用所设计的基因特异引物进行3′RACE扩增获得包含完整读码框架(ORF)的MiARF1（GenBank登录号为AY255705）和MiARF2（GenBank登录号为AY300808）。MiARF1全长为3272bp,其中,ORF含2523bp,5′非翻译区（5′UTR）含285bp, 3′非翻译区(3′UTR)含464bp。由该序列所推导的氨基酸序列与拟南芥ARF2（BAB10162）的ID值为64%, E值为0,在DNA结合区域（DBD）、III和IV区域的同源性更高,ID值均大于80%。MiARF2cDNA全长为1474bp,其中ORF含981bp,5′非翻译区含285bp, 3′非翻译区含208bp,由该序列所推导的氨基酸序列与拟南芥ARF2（BAB10162）的ID值为84%,E值为e-151。 MiARF2仅具有DBD保守区并与MiARF1的基本相同,但缺乏III和IV区域。Virtural Northern 杂交表明：MiARF2在生根的组织中表达水平高, 而在非生根的组织中未见表达;MiARF1在生根及非生根的组织中均有表达。     

人SBK1 cDNA的克隆及其相互作用蛋白的筛选

首次克隆到人的SBK1（homo sapiens SH3-binding domain kinase 1,SBK1）的cDNA序列,并通过生物信息学的手段,电子克隆到人SBK1的基因组DNA序列.人的SBK1是鼠SBK1的直系同源物,两者基因组DNA结构相似,均含有4个外显子.人的sbk1基因ORF长1 275 bp,编码424个氨基酸,而鼠的ORF长1 254 bp,编码417个氨基酸.两者编码区的核苷酸序列同源性达87.7%,而氨基酸序列同源性达95.7%,在羧基端均有一个PV富集区,推测其能与含有SH3结构域的蛋白质结合.将RT－PCR所获得的长度为1 610 bp的sbk1cDNA序列搜索EST数据库,进行电子延伸,最终获得了约5 kb的人sbk1全长mRNA序列,它与鼠的sbk1全长mRNA大小一致;通过比较基因组学发现UniGene族Hs.97837实际上代表了sbk1基因UniGene族Hs.460471的3′UTR区域,而不是代表了一个新的UniGene族.采用酵母双杂交技术,以SBK1为“诱饵”,获得了与之相互结合的蛋白表皮生长因子受体EGFR和核孤儿受体蛋白NR4A1,它们之间的具体功能关系有待进一步研究.     

Ralstonia eutropha CH34酯酶基因的克隆和序列分析

采用含α 乙酸萘酯和固兰RR的表面琼脂法从RalstoniaeutrophaCH34的基因文库中筛选酯酶基因estA ,对含有estA的 1 7kbDNA片段的核甘酸序列分析表明 ,该基因全长82 5bp,编码由 2 75个氨基酸组成的EstA蛋白 ,分子量为 30 785D。经推导氨基酸序列的同源性分析 ,发现EstA与参与芳香化合物代谢中间位裂解途径的水解酶有很高的同源性。     

天祝白牦牛IGF-2基因的cDNA克隆

旨在克隆天祝白牦牛胰岛素样生长因子2(IGF-2)基因编码区全长cDNA序列,为研究该基因的生理功能奠定基础。运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列。扩增获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列为1 060 bp(GenBank登录号:KF682139),ORF长540 bp,编码179个氨基酸。其编码的氨基酸与已报道哺乳动物IGF-2氨基酸序列同源性在80%-92%之间。天祝白牦牛IGF-2基因的成功克隆为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

水母雪莲Myb转录调控因子SmP基因的克隆及序列分析

采用TDPCR(Touch down PCR)法从水母雪莲(Saussurea medusa Maxim)红色系愈伤组织cDNA文库中筛选并克隆了雪莲Myb转录调控因子SmP (S.medusa Maxim Mybrelated P gene)基因。序列分析表明该基因全长969bp,包括一个771bp的完整开放阅读框架（ORF）,编码一个256氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列的同源性分析表明在N-端具有两个典型的R2R3-Myb-DNA结合结构域。C-端富含亲水的丝氨酸S(18.38%),且以寡聚体的形式存在,具有转录调控因子激活结构域常见的特征。     

鲤鱼生长激素基因的PCR扩增、克隆及其序列比较

从鲤鱼(Cyprinus carpio)脑垂体中分离其总RNA,经反转录成为第一条链cDNA。以第一条链cDNA为模板,以合成的两段29个寡聚核苷酸为引物,再经过PCR扩增,合成了鲤鱼的生长激素基因,并把其克隆到大肠杆菌表达载体(P^{blue-ocripx Ks+/-})上。序列分析和限制酶切图谱表明所克隆的鲤鱼生长激素基因的开放读框含有630bp,编码210个氨基酸,其中含有22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟GH序列。我们所克隆的鲤鱼GH基因与Koren发表的鲤鱼GHcDNA的序列在编码区完全一致,但是与chao发表的鲤鱼GHcDNA比较,在编码区核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为95．6％和96．7％。     

湖北海棠MhPR1a基因的克隆与表达特性分析

以水杨酸诱导的湖北海棠[ Malus hupehensis (Pamp.) Rehd.]全长cDNA文库和基因组DNA为模板,克隆其PR1a基因(MhPR1a)的全编码区序列,并对该序列进行生物信息学分析;在此基础上利用荧光定量RT-PCR技术对湖北海棠根、茎和叶中该基因的表达特性及经过10μmol·L-1ABA、4℃低温处理及苹果蚜虫(Aphis citricola van der Goot)侵染后叶中该基因的表达特性进行了测定.结果表明:克隆获得的MhPR1a基因全长518 bp,最大开放阅读框为492 bp,编码162个氨基酸残基;编码的蛋白质为酸性蛋白,其相对分子质量为16 960,等电点pI 5.46;其基因组DNA序列与cDNA序列完全一致,说明MhPR1a基因内部没有内含子.湖北海棠MhPR1a基因与苹果(M.domestic Borkh.)和沙梨[Pyrus pyrifolia( Burm.f.)Nakai] PR1基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列同源性均较高,其中cDNA序列的同源性均为97％,氨基酸序列的同源性分别为95％和97％;系统树也显示MhPR1a基因编码的氨基酸序列与苹果和沙梨的亲缘关系最近,聚为一类.MhPR1a基因编码的氨基酸序列具有SCP保守结构域,含有1个信号肽和6个保守的半胱氨酸残基.在湖北海棠的叶、茎和根中MhPR1a基因均能表达,在根中的表达量最高.10 μmol·L-1ABA和4℃低温处理48 h后均可诱导MhPR1a基因的表达,且相对表达量明显高于对照(处理0h);苹果蚜虫也可诱导MhPR1a基因的表达,说明MhPR1a基因在湖北海棠抵抗植食昆虫和低温胁迫的过程中可能发挥着重要作用.     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因——sanH和sanI的研究

通过反向遗传学方法克隆到圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因簇中约7.0kb的DNA片段。该片段除含有尼可霉素生物合成基因sanF外,对sanF上游约22kb的BglⅡDNA片段进行序列测定及分析表明,还含有两个完整的开放阅读框(ORF)。ORF1由1233个核苷酸组成,ORF2由195个核苷酸组成,它们分别编码由410个氨基酸残基和64个氨基酸残基组成的蛋白质,依次命名为sanH和sanI。蛋白序列数据库比较结果表明,SanH和SanI与浅灰链霉菌(\%Streptomyces griseolus)\%中共转录的细胞色素P450(cytochrome P450)和铁氧还蛋白(ferredoxin)有较高的同源性,一致性分别为46%和56%,相似性分别为62%和70%。基因功能研究表明,sanH基因的破坏虽不影响圈卷产色链霉菌产生的尼可霉素的生物活性,但该基因可能参与了尼可霉素羟基化反应的生物合成。     

禾谷缢管蚜体内的病毒结合蛋白基因的克隆与原核表达

利用一对特异性引物,用PCR的方法从禾谷缢管蚜体内扩增出了病毒结合蛋白基因,序列测定结果表明其长度 为1647 bp,编码548个氨基酸,与GenBank中的禾谷缢管蚜美国生物型Buchnera groELNT核苷酸序列同源性为97%,氨基酸同源性为97.4%。构建了2个原核表达载体并进行表达得到了69kD融合蛋白和63kD的非融合蛋白。     

草鱼与鲢鱼肥胖基因克隆与序列分析

肥胖基因产物leptin是调节哺乳动物摄食、能量代谢等生命活动的重要细胞因子。 应用RT-PCR和RACE法获得了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix) leptin基因的全长cDNA序列分别为1 096 bp和1 176 bp,编码173和172个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,草鱼和鲢鱼的leptin序列与其它鲤科鱼类leptin的同源性较高,而与其他鱼类的leptin同源性很低,但所有鱼类的leptin均含有用于形成二硫键的高度保守的半胱氨酸。系统进化树分析显示,草鱼和鲢鱼leptin与其他鱼类leptin聚于一进化分支。应用PCR和Genome Walker方法,进一步获得了草鱼和鲢鱼leptin基因的内含子和5′侧翼区序列。结果表明,获得的草鱼和鲢鱼leptin基因长度分别为2 129 bp和2 192 bp,含有与其他脊椎动物leptin相似的基因结构（含三个外显子和两个内含子）。本研究为深入研究鱼类肥胖基因结构功能关系与鱼类抗肥胖品系定向遗传选育奠定了良好的基础。     

镰形扇头蜱两个组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶新基因的克隆与序列分析

蜱是动物常见的外寄生虫,并且传播多种人和动物的疾病,严重危害畜牧业发展和人类健康。为了寻找基因工程疫苗候选抗原基因,根据半胱氨酸蛋白酶的保守性氨基酸序列及镰形扇头蜱氨基酸密码子偏好设计引物,PCR扩增、测序并分析得到2个镰形扇头蜱的半胱氨酸蛋白酶基因片段cysA和cysB,再通过RACE的方法得到全长基因序列。cysA全长168bp,编码332个氨基酸;cysB全长1153bp,编码335个氨基酸。经过分析, CysA和CysB均与其他蜱种或物种的组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶有高度同源性,两者均含有半胱氨酸蛋白酶活性位点处的保守性氨基酸序列, 因此cysA, cysB均为镰形扇头蜱两个新的组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶基因。RT-PCR分析表明,CysA和CysB在镰形扇头蜱的不同发育阶段表达情况不一。     

豌豆核基质结合区的分离及其在转基因烟草中的功能分析

从豌豆基因组中分离出一段具有核基质结合区(matrix attachment region,MAR)特征的DNA序列,与已知序列相比,获得的序列中部缺失了115bp的重复序列.重复序列上、下游两段序列与已知序列相对应的序列有较高的同源性,并具有A-box,T-box和TATAAA等典型的MAR序列特征.为验证此DNA序列的功能,以β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因(uidA)作报导基因构建了植物表达载体,通过农杆菌介导转化了烟草.GUS定量检测表明,由于此DNA序列的存在,uidA基因的平均表达水平提高了2倍,最高的单株可达6倍.上述结果表明,该DNA具有MAR序列的特征序列,并且具有增加转基因表达的功能.     

球毛壳菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆及特性分析

用粗糙脉孢菌(Neurospora crassa,XP_327967)和菜豆炭疽病菌(Colletotrichum lindemuthianu,P35143)的甘油醛_3_磷酸脱氢酶基因(Glyceraldehyde 3_phosphatedehydrogenase,GAPDH)氨基酸序列对球毛壳菌(Chaetomium globosum)菌丝ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了球毛壳菌GAPDH全长cDNA序列。该序列长1240bp,开放阅读框1014bp,编码337个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为36.1kD。用PCR方法克隆了该基因的DNA序列,序列长为1556bp,由2个内含子和3个外显子组成。BlastP同源性分析表明该基因与鹅掌柄孢壳(Podosporaanserine)同源性最高为95%;与米曲霉(Aspergillusoryzae)同源性最低为87%。GAPDH酵母转化子生物功能分析表明转化子对Na2CO3和高温有高的耐受性,证明GAPDH为抗胁迫基因。该基因的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY522719,AY593253,AAS01412)。     

菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析

以耐盐的菠菜mRNA为横板．经反转录合成甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因第一链cDNA。在人工合成的两端引物引导下,通过多聚酶链式反应(PCR)。扩增获得双链cDNA。把重组有BADH基因的pucl9转化至E．Coli DH5a菌株,亚克隆后测定了基因的全序列。所得到的BADH基因全长序列为1491bp,编码497个氨基酸。与文献报道的相比较,核苷酸序列同源性99．8％．氨基酸序列同源性达99．6％。在此基础上,构建了BADH基因的高等植物表达载体．