絮凝活性产紫青霉EL-02的分离鉴定及其絮凝活性初探

【目的】分离鉴定有絮凝活性真菌,同时对其絮凝活性进行初步研究。【方法】采用梯度稀释、平板划线、18SrDNA检测等方法分离鉴定絮凝活性菌株。通过高速离心、超声破碎、乙醇沉淀、定性试验等方法确定絮凝活性物质性质。【结果】从渤海湾海岸土壤样品中分离筛选出一株有较高絮凝活性的真菌,经鉴定为产紫青霉(Penicillium purpurogenum),命名为产紫青霉EL-02(P.purpurogenum EL-02)。超声破碎试验证实其絮凝活性主要存在于发酵上清液。根据絮凝活性曲线,确定4d为积累絮凝活性产物的最佳发酵时间。乙醇沉淀法获得该菌株絮凝活性物质。经鉴定该菌株所产絮凝活性物质为糖类,且其活性在pH2-11,温度-70℃-100℃范围内保持稳定。【结论】分离筛选到一株有絮凝活性的产紫青霉EL-02,经鉴定其产生糖类絮凝活性物质。     

碳源对产紫青霉产菊粉酶的影响

试验不同碳源对产紫青霉菊粉酶生产情况的影响。结果表明,果糖、菊糖、菊芋浸汁作为碳源是菊粉酶生产较理想的诱导因子,但过量的果糖会产生阻遏。经菊糖作为主要碳源和唯一碳源筛选的菌株产酶能力可提高6－7倍。同时在发酵前期加入易利用的碳源培养菌体,后期利用菊糖诱导酶的产生,可使酶产量提高2倍。     

致病疫霉拮抗菌株YR-7 的分离鉴定及其活性物质

【目的】从黄河边的农田土壤中分离筛选拮抗致病疫霉的粘细菌,鉴定目标菌株,分析其发酵上清液的稳定性及对马铃薯晚疫病菌的抑制效果,为活性物质分离鉴定及抗马铃薯晚疫病菌生物农药的研发奠定基础。【方法】采用兔粪诱导法分离菌株,通过平板对峙法筛选对马铃薯晚疫病菌有拮抗作用的粘细菌,通过形态特征、生理生化特征以及16S r RNA基因序列分析对菌株进行鉴定。采用称重法测定菌株生长曲线,通过平皿法测定菌株不同生长时期发酵上清液对致病疫霉的菌丝生长抑制率和浓缩发酵上清液的稳定性。通过马铃薯离体叶片涂布浓缩发酵上清液和接种病原菌孢子悬浮液法,测定该菌株对马铃薯晚疫病的防病作用。【结果】从土壤样品中共分离获得7株粘细菌,其中4株拮抗致病疫霉,拮抗效果最强的为YR-7菌株,菌丝的生长抑制率为96%,该菌株被鉴定为Myxococcus xanthus。培养7 d后,菌株发酵上清液对致病疫霉的抑制活性趋于稳定。浓缩发酵上清液经30-50°C处理后,对致病疫霉菌丝的生长抑制率可达50.90%,高于50°C时抑菌活性逐渐下降,90°C处理后菌丝的生长抑制率仍可达25.45%。浓缩发酵上清液在p H 4.0-9.0条件下比较稳定,保持40.21%以上菌丝的生长抑制率,当p H4.0或p H9.0时,抗菌活性显著降低。活性物质不能被蛋白酶降解,其抗菌活性不受紫外线、自然光照射的影响。对马铃薯离体叶片的生防效果检测表明,YR-7的浓缩发酵上清液处理组叶片相对病斑面积仅为0.35%,对照组的相对病斑面积高达68.19%。【结论】粘细菌菌株YR-7可以产生抗马铃薯晚疫病菌的次生代谢产物,抗菌活性物质具有较好的稳定性,可以有效抑制致病疫霉侵染马铃薯叶片,具有开发成抗马铃薯晚疫病生物农药的潜在价值。     

海绵共生真菌产黄青霉LS16抗菌活性物质的分离及结构鉴定

海洋真菌能够产生大量活性独特的次级代谢产物。为了探明海绵共生真菌产黄青霉LS16发酵液中抗副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的活性物质,本实验对副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的抑菌活性进行跟踪,采用VLC（vacuum liquid chromatography）、Sephadex LH-20柱层析、薄层层析和高效液相色谱等技术,从海绵共生真菌LS16乙酸乙酯发酵液中分离纯化得到5个化合物。进一步实验证明,化合物2具有抗副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus活性。根据该化合物的波谱数据（¹H NMR、¹³C NMR）对其化学结构进行鉴定,确定其分子式为C₁₅H₁₅NO₃,为生物碱类化合物。     

产紫青霉中β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导表达

针对产紫青霉(Penicillium purpurogenum)Li-3发酵生产β-葡萄糖醛酸苷酶存在的碳代谢阻遏现象,研究β-葡萄糖醛酸苷酶的高效诱导表达策略。在发酵条件优化的基础上,建立了新的产酶诱导工艺:葡萄糖的初始质量浓度5 g/L,在葡萄糖耗尽时加入20%诱导剂(10 g/L GL+1.2%Tween80)进行诱导,每24 h添加1次诱导剂,诱导72 h后立即转到40℃摇床发酵48 h。采用该工艺进行发酵,菌体出现了"二次生长"现象,比酶活从647.99 U/mL提高至2 356 U/mL,提高了近3倍。     

白木香内生真菌的分离鉴定及其抑菌活性

从白木香Aquilaria sinensis（Lour．）Gilg木质部的树脂形成部位和健康部位中共分离获得42株内生真菌,经初步鉴定,产孢的33株分属于3目4科7属,其余未产孢的9株暂归为无孢菌群。采用杯碟法和MTT法分别测定了各菌株的发酵上清液对3种病原菌的体外抑菌活性和2种肿瘤细胞的体外细胞毒活性。结果表明,白木香木质部健康部位内生真菌以枝顶孢霉属为优势属,而树脂形成部位的内生真菌种类比健康部位要多,且以青霉属为优势属。其中26株至少能抑制一种指示菌,占总数的61．9％;7株对指示瘤株具有细胞毒活性,占总数的16．7％。抑菌活性菌株主要分布在枝顶孢霉属和青霉属。枝顶孢霉属菌株抑菌活性较强,其抗菌活性成分值得进一步研究。     

南方红豆杉内生真菌的分离鉴定及其细胞毒活性研究

采用平板培养法对采自广东省的南方红豆杉进行内生真菌的分离,并通过形态学和分子生物学方法进行分类鉴定;共分离鉴定内生真菌22株,主要为刺盘孢属(Colletotrichum)、球座菌属(Guignardia)、座腔菌属(Botryosphaeria)、节菱孢属(Arthrinium)、炭角菌属(Xylaria)、毛壳菌属(Chaetomium)、交链孢属(Alternaria)、拟茎点霉属(Phomopsis)、长蠕孢属(Helminthosporium)等属。还采用MTT法测定了这些内生真菌发酵粗提物的细胞毒活性,活性研究发现有6个菌株的粗提物在作用浓度为100μg/mL时,对至少1种受试肿瘤细胞株的抑制率在50%以上,其中菌株A223和A240对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制率在90%以上。表明南方红豆杉内生真菌多样性丰富,有些菌株具有良好的细胞毒活性,值得进一步深入研究。     

远志内生真菌分离鉴定及活性筛选

从两个不同生长时期野生远志中分离内生真菌菌株88株,隶属于28个属,研究了各菌株对3种指示菌的拮抗作用。结果表明,远志不同生长时期不同部位的内生真菌数量、分布、种群存在差异,其优势属为Alternaria Nees。茎中内生真菌种类较多。88株内生真菌中有73株菌至少能拮抗1种指示菌,占总菌数的83.0%。4株抗性较强的菌株分别隶属于Trichothecium Link、Cephalosporium Corda、Alternaria Nees、Dactuliophora C.L.等。     

异孢耳霉的分离和鉴定

本文报道了1987年冬季在南平地区分离的一个腐生耳霉新纪录——异孢耳霉(Conidiobolus incongruus),分生孢子梗无色,不分叉,6—10×50—130μm,分生孢子无色,多数球形,少数亚球形至椭圆形,13—33×16—35μm,易萌发,多数形成菌丝体,少数可形成次生分生孢子或三生分生孢子,弹射在水琼脂上的分生孢子常能迅速产生小分生孢子。接合孢子球形,淡黄色,光滑,直径18—29μm,壁厚2.5—5μm。     

吸水链霉菌BS-112产生的抗真菌活性物质的分离纯化与结构鉴别

【目的】分离纯化吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)BS-112产生的抗真菌活性物质,究明各活性组分的结构,测定其对黄曲霉的抑制作用,为该菌株及其产生的抗真菌活性物质的应用提供依据。【方法】通过大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析及制备HPLC等方法,对该菌株产生的抗真菌活性物质进行分离纯化;利用质谱(MS)和核磁共振谱(NMR)解析各活性组分的结构;采用微量液体稀释法测定各活性组分对黄曲霉的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)。【结果】从BS-112菌株发酵液中分离获得4个抗真菌活性组分,利用波谱技术确定其结构分别为Tetrins A和B、Tetramycins A和B。96孔板法测得这4个化合物对黄曲霉的MIC分别为3.13μg/mL、12.56μg/mL、1.56μg/mL、6.25μg/mL,MFC分别为6.25μg/mL、25.0μg/mL、3.13μg/mL、12.56μg/mL。【结论】BS-112菌株产生的抗真菌活性物质由Tetrins A和B、Ttramycins A和B 4个化合物组成,它们对黄曲霉均具有良好的抑制作用。     

土壤样品中粘细菌的分离鉴定及其生物活性检测

【目的】从土壤样品中分离粘细菌,对其进行纯化、归类与鉴定,以丰富粘细菌菌种资源;对纯化得到的粘细菌进行抑菌、杀虫及抗肿瘤生物活性的分析,为粘细菌次级代谢产物的开发奠定基础。【方法】采用灭活大肠杆菌和滤纸片诱导子实体法从土样中分离粘细菌,结合形态观察、生理生化特征和16S r DNA基因序列同源性分析,对分离到的各菌株进行鉴定并归类。通过平板扩散法、昆虫口服毒性测试、肿瘤细胞毒性实验等方法,检测粘细菌代谢产物生物活性。【结果】共分离得到35株粘细菌,初步分类为:粘球菌属(Myxococcus)9株;珊瑚球菌属(Corallococcus)9株;侏囊菌属(Nannocystis)11株;堆囊菌属(Sorangium)6株。从其中纯化得到8株粘细菌,对其进行了鉴定并命名。发现了具有高效且广谱的肿瘤细胞毒性效应菌株S22,S51和S55也具同样的细胞毒性;另外,还发现具有肿瘤细胞毒性的菌株S20和S22对枯草芽胞杆菌和白色念珠菌也具有较好的抑菌活性。【结论】土壤中存在丰富的粘细菌资源,发现了具有肿瘤细胞毒性的弱小珊瑚球菌与具有抑菌和强抗肿瘤活性的大孢珊瑚球菌,粘细菌是活性天然产物与新药开发的重要资源。     

K-Extraction from Muscovite by the Isolated Fungi

The aim of this work was to isolate and identify the muscovite-solubilizing microorganisms, and then to exploit the mechanism of K-extraction by the isolated microorganisms. Ten strains of microorganisms were isolated from soil sample in K-bearing mineral area (Anhui province, China) using Aleksandov agar medium, which had different degrees of muscovite-solubilizing in the K-extraction experiments. After 15-day incubation, the K-extraction ability was evaluated through dissolved structural element of muscovite in aqueous medium (K, Al, Si) by Inductively Coupled Plasma. Four best muscovite-solubilizing microorganisms were identified by 18S rDNA analysis as Penicillium purpurogenum, Talaromyces radicus, Aspergillus fumigatus and Aureobasidium pullulans, respectively. Furthermore, organic acids in the medium were determined by high performance liquid chromatography, and the surface morphology and composition of original and leached muscovite were evaluated using scanning electron microscopy and energy dispersive spectroscopy. According to these analytical results, it was deducted that the interactions between fungi and muscovite, along with excreted organic acids and K-adsorption by the fungal hyphae contribute to muscovite weathering and K-release.     

五味子根内生真菌的分离及其抑菌活性的研究

采用组织块分离方法对五味子根内生真菌进行分离鉴定,并以人参疫病病菌[Phytophthora cactorum(Leb.et Coh.)Schroet.]、人参黑斑病病菌(Alternaria panax Whetz.)为供试病原菌对分离的内生真菌进行了抑菌活性筛选。试验共分离得到74株内生真菌,根据形态特征鉴定出33株,分别隶属于半知菌亚门丛梗孢科的轮枝孢属(Verticillium)、柱隔孢属(Ramularia)和瘤座孢科的镰刀菌属(Fusarium)。通过抑菌试验筛选出5个内生真菌有抑制作用,其中3个内生真菌的发酵产物、乙醇提取液对2种病原菌均有一定的抑菌活性。     

痤疮丙酸杆菌的分离鉴定及其对瘤胃微生物发酵的影响

摘要：【目的】奶牛围产期能量代谢的特点是能量负平衡,瘤胃发酵产生的丙酸是奶牛糖异生供能的主要底物,对预防奶牛能量负平衡具有重要的意义。本研究旨在从健康奶牛瘤胃液中分离、筛选出以产丙酸为主的痤疮丙酸杆菌,研究其瘤胃发酵特性。【方法】无菌采取装有瘤胃瘘奶牛的瘤胃液,按照厌氧菌分离步骤,通过丙酸生成菌株的特异性培养基SLB进行筛选,提取分离菌的基因组DNA,克隆其16S rRNA基因,进行序列测定,分离出一株痤疮丙酸杆菌。通过体内外发酵试验研究痤疮丙酸杆菌对瘤胃液pH、挥发性脂肪酸和乳酸的影响。【结果】通过形态学观察、生化反应和序列分析证实所分离的一株产丙酸的杆菌为痤疮丙酸杆菌。该菌株在体外发酵过程中,瘤胃液pH先下降,在12h时降至最低,随后上升;乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸先升高,于12h时升至最高,随后又降低;乳酸浓度和乙酸/丙酸总体上一直下降;在体内发酵过程中,pH总体上下降;乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸总体上升。【结论】在国内首次从健康牛瘤胃液中成功分离出一株痤疮丙酸杆菌,为今后研发预防奶牛能量负平衡的微生态制剂奠定基础。     

水质净化酵母菌的分离筛选及鉴定

摘要:【目的】针对目前水产养殖专用优良菌种资源缺乏的现状,从养殖环境和养殖生物体中分离筛选具有水质净化功能的酵母菌,并对优良菌株进行鉴定。【方法】在低温和常温条件下从皮皮虾、南美白对虾肠道及养殖池底质活性污泥中分离具有水质净化功能的酵母菌,在模拟水体中对分离菌株的水质净化能力进行筛选,并对优良菌株采用形态、生理生化实验及5.8S rDNA ITS序列分析进行鉴定。【结果】从3种介质中共分离到酵母菌37株,其中常温分离16株,低温分离21株。水质净化实验结果表明,常温分离的16株酵母菌中有5株,低温分离的21株酵母菌中有6株对模拟水体中亚硝态氮和氨氮有显著的去除效果;其中低温分离的DN9和常温分离的CN6 48h能将10.64mg/L的亚硝态氮彻底转化,96h对630mg/L CODcr的去除率分别达52%和67%。DN9和CN6均产红色色素,经形态特征、生理生化特性及5.8S rDNA基因序列分析,鉴定菌株CN6为沼泽生红冬胞酵母(Rhodosporidium paludigenum),DN9为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。【结论】红酵母DN9和CN6能有效去除养殖水体中的有机污染物和亚硝态氮,有望开发成水产养殖水质净化高效微生态制剂。     

一株金黄色葡萄球菌小菌落突变株的分离鉴定

摘要：【目的】由于金黄色葡萄球菌（金葡菌）小菌落突变株（small colony variants,简称SCVs ）可引起持续复发性感染,且对氨基糖苷类有抗药性,在临床诊断和治疗上造成很大的困扰。我国国内尚无金葡菌SCVs的报道,本研究旨在分离鉴定出金葡菌SCVs菌株,为国内进行SCVs的相关研究提供生物学材料。【方法】通过细菌的形态鉴定、种特异性基因（nuc）的PCR扩增鉴定以及系列生化实验,从人源、动物源及环境源共104株金葡菌分离株中筛选得到金葡菌SCVs,并通过甲萘醌、硫胺素、胸腺嘧啶和血红素等补     

野生抚育山参内生真菌分离鉴定

采用组织块法对野生抚育山参(Panax ginseng)根中内生真菌进行分离,共分离出16株内生真菌,根据形态鉴定出10株,分别隶属于头孢属(Cephalosporium)、青霉属(Penicillium)、柱孢属(Cylindrocarpon)、轮枝孢属(Verticillium)、单端孢属(Trichothecium)。以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、白色念珠菌(Candida albicans)为指示菌对内生真菌进行抑菌活性筛选,共筛选出2株内生菌,这2株内生菌对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用。     

一株高效异养硝化菌的选育、鉴定及其硝化条件

【目的】针对现阶段异养硝化菌硝化速率较低的问题,选育更高效的异养硝化菌,进而鉴定该菌株的种属,了解其硝化特性和硝化条件。【方法】分别从污水处理厂活性污泥、化肥厂土壤以及农田土壤中取样,以柠檬酸钠为碳源,NH4Cl为氮源,采用污泥驯化、驯化过程中驯化液连续梯度稀释、平板划线分离及颜色指示剂快速硝化效果检测等步骤,筛得一株高效的异养硝化菌。经生理生化和16SrDNA序列的系统发育分析鉴定其种属;将该菌接入人工氨氮废水,定时检测水中含氮化合物的变化,了解其硝化特性;通过改变培养基碳源、溶氧量、C/N比、温度和pH考察其硝化条件。【结果】获得的高效异养硝化菌为革兰氏阴性杆菌,不利用葡萄糖发酵,氧化酶、接触酶阳性,不产吲哚,能由有机酸盐产碱;其与产碱菌属菌株Alcaligenessp.ES-SDK-3的16SrDNA同源性高达99.7%。用该菌株处理初始氨氮浓度为182.30mg/L的废水,30h后氨氮去除率为99.8%,指数期平均氨氮去除速率为9.61mg-N/L/h,其在硝化过程中几乎没有亚硝酸盐氮和硝酸盐氮产生;最佳碳源为柠檬酸钠;高的溶氧量和高的C/N比有利于其降解氨氮,当C/N比为12时即可达到较好的效果;该菌株在温度为30℃-35℃,pH为5.0-9.0范围内均能较彻底地降解氨氮。【结论】该菌株为产碱菌属,命名为Alcaligenessp.HN-S;其在硝化速率与处理的氨氮浓度方面均高于目前国内外筛出的大多数异养硝化菌;通过考察其硝化条件,为其走向实际污水脱氮工艺提供了依据。