木瓜蛋白酶的研究 Ⅰ.对不同底物水解作用的比较

(一)氢离子浓度对木瓜蛋白酶水解不同合成底物的影响均属于非竞争性类型,即对不同底物的米氏常数皆与pH无关,pH仅影响最大反应速度。因此很可能木瓜蛋白酶的米氏常数即等于其与底物结合的解离常数。(二)甲醇对木瓜蛋白酶水解Bz-精-NH_2及Cbz-谷NH_2-NH_2有抑制作用,但对Cbz-白-NH_2及Cbz-甘-NH_2的水解却有显著的促进作用。(三)甘氨酸乙酯对Bz-精-NH_2及Cbz-甘-NH_2的水解亦有促进作用,但活力提高的程度各不相同。(四)根据以上结果对木瓜蛋白酶的作用机制作了简短的讨论。     

牦牛骨蛋白的酶解条件研究

以蛋白质水解度为评价指标,辅以固形物溶出率,比较了中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶对牦牛骨蛋白的水解效果,研究了酶用量、料液比(底物浓度)、酶解时间对水解度的影响,采用正交试验对酶解条件进行了优化。结果显示,木瓜蛋白酶是牦牛骨蛋白水解的适宜催化剂。在一定条件下,样品水解度随酶用量和酶解时间的增加而增大,底物浓度过低或过高均不利于原料中蛋白质的酶解。木瓜蛋白酶水解牦牛骨蛋白最佳条件为:酶解温度60℃,酶解时间8 h,酶用量3500 U/g蛋白质,料液比1:25(g:m l)。     

酶解法制备草鱼抗氧化多肽工艺的建立

目的:筛选优化合适的可用于水解草鱼蛋白制备活性多肽的蛋白酶制剂及其工艺.方法:选取不同特性来源的商品化蛋白酶制剂与实验室分离的枯草蛋白酶BPN,对比分析它们在水解草鱼蛋白过程中的水解度变化,及其酶解产物的抗氧化活性.结果:大多数蛋白酶在水解反应最初的60min内,水解度迅速增加,之后2h内曲线变化不大.其中细菌来源的水解蛋白酶水解能力最强,其2h水解产物水解度可达15.17％;木瓜蛋白酶水解产物的抗氧化活性较强,经测定其DPPH清除能力为96.24％.结论:不同特性的蛋白酶水解草鱼蛋白的水解速度和产物的活性成分具有明显差异,总的来说,木瓜蛋白酶在草鱼蛋白加工中制备活性多肽是一个比较理想的选择.     

胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解核桃蛋白工艺研究

以核桃粕为原料,以水解度为考察指标,研究胃蛋白酶和木瓜蛋白酶对核桃蛋白的水解作用.结果表明：木瓜蛋白酶为酶解核桃蛋白最佳酶,其最佳酶解条件为底物浓度4％、酶质量分数5％、酶解 pH 值为7．0、酶解温度50℃、酶解时间4 h;在该条件下,木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白水解度可高于25．76％.     

双酶法制备螺旋藻多肽的工艺研究

选用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶结合的双酶法对螺旋藻蛋白进行水解。其中,对木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白的工艺进行优化。以水解度为指标,研究了酶解时间、酶与底物比、pH和酶解温度4种因素对酶解反应的影响。在此基础上设计了3因素(加酶量、酶解温度和pH)3水平的响应面试验。结果表明碱性蛋白酶水解螺旋藻蛋白的最佳酶解条件为:加酶量4300 U/g,pH 7.0,酶解温度55℃,酶解时间160 min;木瓜蛋白酶的最佳酶解条件为:酶底比为4.5%,酶解温度60℃,pH 6.5,酶解时间210 min。利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶结合的双酶法制得的多肽水解度可达32.90%,与单酶法相比,水解度明显提高。     

木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶的研究——ⅥⅠ.无花果蛋白酶对不同底物的作用

观察无花果蛋白酶对一些合成底物作用的结果,说明酶的专一性和木瓜蛋白酶相似。它的特点是在pH7.4对白-NH_2的作用速度此对Bz-精-NH_2水解速度还快,并且在一定条件下只有白-NH_2的聚合反应而无供体的水解。酶作用于白-NH_2及Bz-精-NH_2共同存在时的反应速度也和木瓜蛋白酶相似,为在相同条件下分别作用于二者的速度之和。但从对氯汞苯甲酸和溴代乙酸的抑制看来,这两种活力是由同一酶所催化,可能酶对于二种反应的活性中心不完全相同。     

米糠蛋白抗氧化活性肽的制备

以水解度(DH％)和对DPPH自由基清除率为指标,筛选出制备米糠蛋白抗氧化活性肽的最适蛋白酶.研究最适蛋白酶的酶解条件,探讨底物浓度、蛋白酶的加入量、pH值、酶解时间等因素对水解度(DH％)和DPPH自由基清除率的影响;在单因素基础上采用Box-Behnken响应曲面中心组合设计法,对酶解米糠蛋白的工艺进行优化.试验结果表明,在加酶量13970.82 U/g,时间3.05h,底物浓度4.97％的水解条件下,米糠蛋白的水解度能够达到23.67％,活性肽对DPPH自由基清除率达到64.26％.     

木瓜蛋白酶酶解鱼鳞提取胶原蛋白的工艺研究

用木瓜蛋白酶水解鱼鳞提取胶原蛋白,对影响酶解过程的的主要因素(酶量、温度、底物浓度)分别作为单因素进行了实验。并通过正交实验得到鱼鳞胶原蛋白提取条件的优化组合,同时对提取物进行了分析检测。结果表明,木瓜蛋白酶对鱼鳞有较好的水解效果,酶用量宜采用4g/L,最佳温度为60℃,底物浓度宜选择20%。     

乙二醇对木瓜蛋白酶催化活性的影响

对不同浓度乙二醇水溶液影响木瓜蛋白酶水解酪蛋白的催化活性及构象的改变进行研究。结果表明,木瓜蛋白酶在乙二醇水溶液中水解酪蛋白的活性显著下降。动力学测定表明,木瓜蛋白酶在乙二醇水溶液中最大反应速度明显下降;差示光谱显示,在乙二醇水溶液中木瓜蛋白酶的二级结构发生了变化;荧光发射光谱显示,木瓜蛋白酶在乙二醇水溶液中发射峰位几乎没移动,但发射强度明显增高。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅱ.转酰基作用

本文提供以茚三酮法测受体α-氨基减少的方法以测定转肽反应。木瓜蛋白酶于50%甲醇,pH7.4左右条件下以CbZ-甘-NH_2,Cbz-白-NH_2及Cbz-丝-NH_2为供体,以甘-OEt为受体几乎只进行转肽作用而无供体本身的水解,但在30%丙酮溶液中却以水解反应为主。半胱氨酸、谷胱甘肽、氰化物、亚硫酸盐、[2,3]-二巯基丙醇及巯基乙酸皆可促进木瓜蛋白酶的转肽作用,但高浓度的[2,3]-二巯基丙醇及巯基乙酸与其他还原剂不同对转肽有抑制作用。转肽与水解的专一性不完全相同,如以Cbz-甘-NH_2,Cbz-丝-NH_2及Cbz-白-NH_2做供体时,几乎只进行转肽而无供体水解,但以Bz-精-NH_2及Cbz-谷NH_2-NH_2为供体时都无转肽作用。受体以氨基酸或肽的酯或酰胺为最好,酪氨酸乙酯不能做为转肽反应的受体。以Cbz-甘-NH_2,甘-OEt为供受体时底物浓度对反应速度的影响指出,受体与酶的结合远较供体紧密。甘-OEt的存在使木瓜蛋白酶于250mμ处光吸收有显著降低,并且对木瓜蛋白酶于甲醇溶液中的失活具有保护作用,说明受体与酶系专一性的结合。对本文实验结果的意义进行了讨论。     

木瓜蛋白酶水解壳聚糖的工艺研究

本文通过正交试验对木瓜蛋白酶水解壳聚糖的工艺进行优化,并对降解过程中粘度、还原糖等一些指标的动态变化进行研究。结果显示,木瓜蛋白酶在反应温度45℃下降解壳聚糖的最佳工艺条件为壳聚糖的脱乙酰度70%,pH4.0,底物浓度1%,壳聚糖与酶的比例为25∶1(w/w)。其中底物脱乙酰度对酶解效果影响呈极显著水平,pH值影响呈显著水平。木瓜蛋白酶可较为有效地降解脱乙酰度为70%的壳聚糖,在其最适条件下对壳聚糖水解约60min,可控制产物平均分子量在1万以内。木瓜蛋白酶起始降解速率很快,20min后VDP变化趋于平稳,60min后基本维持在93～94%上下。反应进行60min后产物的平均分子量约为9000。还原糖含量在反应进行150min之后,还原糖的生成速度基本趋于平稳。     

酶解鹿茸血ACE抑制活性及其与抗氧化活性关系的研究

实验采用木瓜蛋白酶和Alcalase碱性蛋白酶水解鹿茸血,在不同的时间取样,分别测定血管紧张素转化酶(ACE)抑制率、二苯代苦味肼基自由基(DPPH.)清除率和羟自由基(.OH)清除率。结果表明Alcalase蛋白酶水解产物ACE抑制活性和DPPH.清除活性较强,其水解3h的产物ACE抑制率为90.63%,DPPH.清除率为14.40%;木瓜蛋白酶水解5h的产物.OH清除率最高,为96.7%。用SPSS10.0软件分析结果,发现ACE抑制率与DPPH.清除率具有显著相关性。     

乙醇溶液对木瓜蛋白酶催化活性的影响

研究了乙醇溶液对木瓜蛋白酶水解酪蛋白的催化活性及构象的影响。结果表明,木瓜蛋白酶在一定浓度乙醇溶液中水解酪蛋白的活性有显著上升。动力学测定表明木瓜蛋白酶在乙醇溶液中米氏常数（Km）下降。差示光谱显示,在乙醇溶液中木瓜蛋白酶的二级结构发生了变化。荧光发射光谱表明,木瓜蛋白酶在乙醇溶液中发射峰位几乎没移动,但发射强度明显增高。     

用木瓜蛋白酶及固定化木瓜蛋白酶拆分DL-苯丙氨酸

为了将手性化合物D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸进行分离,利用木瓜蛋白酶及固定化木瓜蛋白酶催化的方法对其拆分．试验结果表明,用DL-苯丙氨酸合成N-乙酰-DL-苯丙氨酸,得率为88.7％．木瓜蛋白酶、海藻酸钠 壳聚糖固定化木瓜蛋白酶(IPSAC)、尼龙布固定化木瓜蛋白酶(IPN)催化合成N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺时,对催化合成过程影响最大的因素分别是溶液中的离子强度、溶液中的离子强度、反应温度;溶液中的离子强度与pH对合成的影响较大．本试验得出分别用木瓜蛋白酶、IPSAC、IPN催化合成N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺的3个最佳方案;用此3个方案合成时,产率分别为61.2%、54.7%、36.3%．N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺水解生成L-苯丙氨酸,产率59.2%,光学纯度为96.6％．N-乙酰-D-苯丙氨酸水解生成D-苯丙氨酸,产率61.7%,光学纯度为95.7％．     

马鹿茸血免疫活性肽的制备及其活性研究

本文以免疫活性和DPPH·的清除能力为指标,研究了用木瓜蛋白酶与中性蛋白酶水解马鹿茸血制备活性肽的条件,并初步探讨了此活性肽的免疫活性与对DPPH·清除能力之间的关系.实验结果表明:当[E/S]为9000 U/g时,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解温度各为50和45 ℃,pH各为7.1和6.8,分别水解2和1.5 h可以获得最佳的酶解效果.在相同蛋白含量的情况下,两酶复合水解物的淋巴细胞增殖率比单酶水解增加了20.8%.免疫活性与DPPH·清除能力之间存在一定的相关性(r=0.957,P<0.01).     

甲醇溶液对木瓜蛋白酶催化活性的影响

试验结果表明,木瓜蛋白酶在一定浓度甲醇溶液中水解酪蛋白的活性显著上升;动力学测定表明,该酶在甲醇溶液中Km下降;在甲醇溶液中木瓜蛋白酶催化酪蛋白水解反应的最适pH为8.5,最适温度为70℃;紫外差示光谱研究表明,在甲醇溶液作用下木瓜蛋白酶的二级结构发生了变化;荧光发射光谱研究表明,木瓜蛋白酶在甲醇溶液中发射峰位向低波长移动,荧光峰值明显增高。     

几种蛋白酶对文蛤肉的酶解工艺条件研究

以文蛤为原料,水解度为指标,从胰蛋白酶,木瓜蛋白酶,胃蛋白酶和风味蛋白酶中选出水解效果较好的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶.并通过实验确定了胰蛋白酶,木瓜蛋白酶单酶水解及两者组合复合酶解文蛤肉的最佳工艺.结果表明:复合水解效果最佳.最佳工艺:先添加胰酶6000 u/g(原料),水解温度50℃,固液比1:3(V/W),pH 8.0,在此条件下水解6 h;然后改变条件,温度55℃,pH 5.5,底物浓度1:3(V/W),添加木瓜蛋白酶2000 u/g(原料),在此条件下水解2 h.通过实验验证,胰蛋白酶和木瓜蛋白酶组合在该条件下对文蛤肉蛋白具有较好的水解效果,其水解度为28.15%.     

木瓜蛋白酶水解马鹿茸血制备免疫活性肽的研究

选用木瓜蛋白酶对天山马鹿茸血进行水解制备免疫活性肽,确定了最佳水解工艺条件,并测定了三种不同水解度水解物的抗氧化活性和免疫活性。水解度(DH)为6.65%时的水解物具有最高DPPH.清除率,DH12.2%时的水解物具有最高OH.清除率。免疫活性体外检测实验显示,DH12.2%时的水解物促进细胞增值率随着浓度的增大而增大,呈现出良好的线性关系(P<0.05)。结果还显示,OH.清除率与免疫活性之间存在相关性,r=0.87(P<0.05).     

花蚬酶解物清除羟自由基作用研究

探讨了不同蛋白酶酶解花蚬蛋白所得酶解物对Fenton体系产生的羟自由基(.OH)的清除效果,然后进行Sephadex G-25凝胶柱分离酶解产物中的抗氧化活性肽,并测定活性肽相对分子质量分布。结果表明:木瓜蛋白酶在50℃、酶解30 min、pH=7.5、酶质量分数0.15%、m(底物)∶m(水)=1∶2的水解条件下,酶解物对羟自由基的清除效果最佳,清除率为86.9%;胰蛋白酶在温度55℃、酶解时间85 min、pH=8.0、酶质量分数0.30%、m(底物)∶m(水)=1∶2的水解条件下,酶解物对羟自由基清除效果最佳,清除率为89.5%。木瓜蛋白酶酶解物在最大洗脱峰时,清除率为84.73%,在最大峰处酶解物中活性肽的相对分子质量为5.68×103;胰蛋白酶酶解物有两个洗脱峰,在最大洗脱峰处分离组分对羟自由基的清除率很低,在较小洗脱峰处,其清除率为88.49%,该峰处活性肽的相对分子质量为1.165×104。     

酶促反应的“诱导契合-锁钥”模式

在酶学理论中,阐释酶识别底物专一性的代表性学说有"锁钥"和"诱导契合"模型等.作者此前研究了蚯蚓蛋白酶Ⅰ(Eisenia fetida proteaseⅠ,EfP-Ⅰ)的底物专一性,提出了"诱导契合-锁钥"反应模式.然而,采用EfP-Ⅰ建立的模式是否具有普遍的酶学意义需要进一步论证.以蚯蚓蛋白酶Ⅱ(Eisenia fetida proteaseⅡ,EfP-Ⅱ)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin,Sub)以及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)为材料,分别研究了底物反应后酶与其他底物的相互作用.结果显示,经过凝血酶底物chromozym TH(CTH)反应后,蚯蚓蛋白酶Ⅱ和枯草杆菌蛋白酶与尿激酶底物(chromozym U,CU)的反应活性显著降低(P<0.05),表现出符合"诱导契合-锁钥"反应的模式.蚯蚓蛋白酶Ⅱ和枯草杆菌蛋白酶先与CU反应后,却仍能与CTH反应,但后续不能与CU发生反应,仍然表现为"诱导契合-锁钥"模式.另外,丙酮酸反应后的LDH,对乳酸的反应活力显著降低(P<0.05),而乳酸反应后的LDH对丙酮酸的活性却无显著变化.这可能是丙酮酸诱导的LDH构象具有相对的刚性,而乳酸诱导的酶构象具有相对柔性所致.