重组p16腺病毒的构建及其对人白血病细胞的抑制作用

为了探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及野生型 p1 6基因的抗肿瘤特性 ,构建了复制缺陷型重组 p1 6腺病毒 .首先将 p1 6全长 c DNA插入穿梭质粒 p Ad CMV产生重组质粒 p Ad-CMV- p1 6,然后通过脂质体介导与 p JM1 7共转染 2 93细胞 ,经同源重组产生 E1区缺失的重组腺病毒空斑 .用纯化后的腺病毒感染人白血病细胞株 HL- 60后 ,PCR及 Western blot分析显示在感染细胞中有外源性 p1 6 c DNA存在和 p1 6蛋白表达 ;被感染的 HL- 60细胞的生长受到明显抑制 ,而未感染细胞及对照腺病毒感染的细胞没有受到抑制 .结果表明 ,腺病毒作为一种新型基因转移载体 ,可有效地介导肿瘤抑制基因 p1 6的表达 ,在肿瘤基因治疗方面具有很大的应用前景 .     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF2与猪GM-CSF基因重组腺病毒共表达及免疫效果分析

旨在构建含融合基因pGMCSF-ORF2的重组腺病毒,并对其表达水平和免疫效果进行分析.运用PCR方法扩增PCV2 ORF2和pGM-CSF基因,拼接后克隆入pMD18-T载体,然后再亚克隆入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后电转化含腺病毒基因组(AdEasy-1)的大肠杆菌细胞BJ5183-Ad-1,成功获得了重组腺病毒DNA.将纯化后的重组腺病毒DNA转染AD293细胞,经过病毒基因组的PCR和转录水平的RT-PCR及Western blot等方面对融合蛋白的表达进行了鉴定.以该病毒免疫Babl/c小白鼠,对免疫小鼠血清中PCV2抗体进行检测.结果显示,获得了pGMCSF-ORF2重组基因,重组腺病毒载体构建成功,获得了表达pGMCSF-ORF2融合蛋白的重组腺病毒.该病毒免疫小鼠后,在小鼠血清中检测到了PCV2的特异性抗体.获得的重组腺病毒能有效表达pGMCSF-ORF2融合蛋白,且可诱导小鼠产生针对PCV2的特异性抗体.     

用大肠杆菌同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组

利用大肠杆菌细胞内质粒间同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组 DNA,高效构建携带有外源基因的均一重组腺病毒 .将带有狂犬病毒糖蛋白 (GP)基因和加强型 GFP(enhanced GFP,EGFP)表达盒的重组穿梭质粒 p Ad- Track- CMV/ GP与腺病毒骨架载体质粒 p Ad Easy- 1一起同时电击共转化大肠杆菌 BJ51 83.在 BJ51 83细胞内 ,带有同源序列的重组穿梭质粒与骨架载体可进行同源重组 ,得到以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组 p Ad- GP’.以 p Ad- GP’为模板 ,经DNA测序确认 GP基因成功整合入此质粒中的腺病毒基因组 E1区外源基因表达盒中 .线形化的p Ad- GP’转染 2 93细胞后可得到基因组结构均一、在 E1区插入有 GP和 EGFP表达盒的重组腺病毒 ,病毒滴度可达 1× 1 0 8pfu/ ml.电镜下此重组病毒颗粒直径约为 70 nm,略呈球形 ,用荧光显微镜观察感染细胞有很强的 EGFP表达 .实验表明 :利用大肠杆菌同源重组获得克隆化的重组腺病毒基因组 DNA,可高效制备高滴度的均一重组腺病毒     

巨噬细胞特异性启动子/抗菌肽PR39基因腺病毒载体的构建及其表达

旨在构建由巨噬细胞特异性启动子调控的抗菌肽PR39基因腺病毒表达载体,检测目的基因在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达。PCR扩增巨噬细胞启动子/抗菌肽PR39成熟肽基因序列,插入腺病毒穿梭载体pAdTrack中,重组穿梭质粒(pAdTrack-SP/PR39)与腺病毒骨架(pAdEasy-1)共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒载体(pAd-SP/PR39)。pAd-SP/PR39经PacI线性化后转染293细胞,包装出重组腺病毒(Ad-SP/PR39)。Ad-SP/PR39感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,经RT-PCR和免疫细胞化学检测PR39的靶向表达特异性。成功构建了由巨噬细胞特异性启动子调控的抗菌肽PR39基因腺病毒表达载体。包装出的重组腺病毒仍然能感染小鼠巨噬细胞且高效表达抗菌肽PR39。构建的重组腺病毒能够在巨噬细胞中表达抗菌肽PR39基因,为靶向表达抗菌肽在胞内菌感染治疗中的应用奠定了基础。     

人eNOS复制缺陷型重组腺病毒的构建

目的:构建以巨型细胞病毒(CMV)为启动子的heNCS重组腺病毒转移载体.方法和结果:将heNOS cDNA全长亚克隆到穿梭质粒启动子CMV的下游,通过I-Ceu Ⅰ和PI-SceⅠ两个稀有酶切位点将目的基因heNOS与腺病毒质粒DNA(pAdeno-X)进行体外连接,获得重组腺病毒质粒DNA(pAdeno-heNOS),后者经限制性内切酶PacⅠ切割,利用脂质体转染法获得heNOS重组腺病毒.PCR双引物法鉴定是否成功构建heNCS重组腺病毒.结论:PCR双引物检测含有heNOS片段,表明成功构建了heNOS重组腺病毒转移载体AdhCMV-heNOS.     

表达流感病毒神经氨酸酶基因的重组腺病毒的构建

通过RT-PCR方法扩增流感病毒神经氨酸酶基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pTrackCMV,此重组质粒与腺病毒DNA共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒.经PCR证实目的基因已整合至腺病毒基因组中,western blot检测到神经氨酸酶的表达.重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果表明2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答反应,滴鼻组的免疫效果优于灌胃组.     

汉坦病毒囊膜糖蛋白G1基因重组腺病毒载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

拟构建汉坦病毒Gl基因重组腺病毒载体并在VeroE6细胞中表达,为汉坦病毒基因疫苗的研究提供实验基础。PCR法从含汉坦病毒-76118株M基因的M56质粒扩增糖蛋白G1基因片段,利用穿梭质粒pShuttle,将其克隆入Adeno—X病毒DNA,获得重组腺病毒DNA,转染HEK293细胞,包装、扩增后得到汉坦病毒Gl基因重组腺病毒原种,感染VetoE6细胞,用IFA法和ELISA法检测表达产物。得到了含汉坦病毒G1基因的重组腺病毒,其滴度约为10^11pfu／ml,感染VeroE6细胞后检测到汉坦病毒糖蛋白G1的表达。     

腺病毒载体介导PDX-1在骨髓间充质干细胞中的表达

为研究PDX-1基因在骨髓间充质干细胞中的表达情况及生物学功能的发挥,构建了含PDX-1基因的重组腺病毒载体.酶切PDX-1基因并连入穿梭质粒pAdTrack-CMV.用电穿孔法使穿梭质粒pAdTrack-CMV-PDX-1与病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组.利用脂质体介导重组腺病毒载体转染293细胞,包装出完整的腺病毒.分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞.用重组腺病毒感染间充质干细胞.用荧光显微镜、RT-PCR、免疫荧光染色等方法检测PDX-1、胰岛素基因及蛋白质的表达,用放射免疫分析法检测转基因细胞分泌胰岛素情况.结果表明:通过测序、PCR、酶切等鉴定PDX-1基因已正确插入穿梭质粒中,并与病毒骨架质粒重组.重组腺病毒滴度为6.3×107PFU/ml.通过荧光显微镜观察证实重组腺病毒可高效感染骨髓间充质干细胞,经RT-PCR、免疫荧光染色证实转染pAd-PDX-1后培养7天的细胞中有PDX-1及胰岛素基因的表达.这些转基因的细胞向胞外分泌的胰岛素量为(15.21±3.50)mIU/L.     

细菌内同源重组法制备FMDV聚蛋白编码基因重组腺病毒

采用PCR方法从重组质粒pMD18_T/PP中扩增出FMDV的聚蛋白(PP)编码基因,再亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成重组穿梭质粒rpAd_CMV/PP;将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体通过在大肠杆菌内质粒间同源重组获得重组腺病毒质粒rpAd/PP。将腺病毒载体线性化后用脂质体介导转染293细胞从而获得含有口蹄疫病毒PP编码基因的重组腺病毒。通过倒置显微镜观测,可见明显的细胞病变,利用荧光显微镜可观测到报告基因绿色荧光蛋白的表达,并在电镜下观察到FMDV的空衣壳。结果证明已成功获得了含有口蹄疫病毒PP编码基因的重组腺病毒rAd/PP,并成功表达组装FMDV空衣壳,为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。     

人Stathmin基因siRNA腺病毒载体的构建及病毒鉴定

目的:为了寻求解决非特异性杀伤作用的星形细胞瘤的基因治疗问题的新途径.本研究构建带有Stathmin siRNA的复制缺陷腺病毒载体并包装病毒.方法:(1)两个目标siRNA基因片段合成并分别插入pSilencer4.1-CMV载体中从而构建两个重组真核表达栽体:pSilencer4.1-CMV-S1和pSilencer4.1-CMV-S2.(2)用EcoR Ⅰ和BamH Ⅲ双酶切pSilencer4.1-CMV-S1和pSilencer4.1-CMV-S2,将目的片段分别装进穿梭质粒,从而构建pShuttle-CMV neo-S1和pShuttle-CMV neo-S2.以独特的限制性内切酶PI-Sce Ⅰ合I-Ceu Ⅰ双酶切这两个穿梭质粒并重组至骨架Adeno-XTM Viral DNA上.并以PCR方法来鉴定.(3)线性化Ad-pShuttle-CMV neo-S1和Ad-pShuttle-CMV neo-s2并转染入HEK293细胞,出毒后进行PCR毒种鉴定和滴度分析.结果:(1)酶切分析和DNA测序表明,小干扰RNA片段的成功连接到pSilencer4.1-CMV载体上分别.(2)酶切分析表明两个目的基因片段,都分别成功连接入穿梭载体pShuttle.PCR表明pShuttle-CMV neo-S1和pShuttle-CMV neo-S2分别与骨架重组成功.(3)腺病毒DNA进行PCR鉴定后表明成功地在体外重组并生产出腺病毒.且冻融产毒细胞保证了较高的重组腺病毒滴度.结论:Adeno-XTM系统是一个能简单而有效生产能表达目的基因腺病毒的系统.我们构建的腺病毒有望成为星形细胞瘤新的高效而安全的治疗方法.     

鼠重组磷脂酶D2腺病毒的构建及功能的初步研究

将磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D2基因及其功能缺陷点突变基因 (K75 8R)从真核表达载体pCGN中克隆至带有绿色荧光标记蛋白的穿梭质粒pAdTrack CMV中 ;再与腺病毒骨架载体一起在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组 ,成功构建磷脂酶D2重组腺病毒。该病毒颗粒感染人胚肾 2 93细胞 ,高效表达磷脂酶D2及其功能缺陷蛋白。这种表达对M3乙酰胆碱受体介导的细胞内磷脂酶D激活无影响。但磷脂酶D2功能缺陷蛋白对蛋白激酶C介导的胞内磷脂酶D激活有显著抑制作用 ;相反 ,磷脂酶D2蛋白有显著增强作用。结果表明     

SOCS3基因重组腺病毒的构建及其在猪脂肪细胞中的表达

本研究旨在构建细胞因子信号转导抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的重组腺病毒表达载体,获得有感染性的病毒颗粒。以pcDNA3-SOCS3质粒为模板扩增SOCS3基因,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,经测序验证后,重组的穿梭质粒用PmeI酶切线性化后转化到BJ5183感受态细菌中与其内的骨架载体pAdEasy-1进行同源重组,获得的重组质粒pAd-SOCS3,经PacI线性化后转染至HEK293细胞中进行包装和扩增,纯化后用TCID50法测定病毒滴度。以重组的病毒感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3 mRNA和蛋白的表达。重组腺病毒载体pAd-SOCS3经酶切及PCR鉴定正确,病毒滴度为1.2×109PFU/mL;感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜观察可见报告基因GFP的表达;RT-PCR和Western blotting检测到细胞中SOCS3 mRNA和蛋白的表达显著提高。本研究成功构建了SOCS3基因的重组腺病毒,感染原代培养的猪脂肪细胞可稳定表达SOCS3蛋白,为深入研究SOCS3的功能奠定了基础。     

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT2的体外激酶活性分析

目的 建立蛋白激酶AKT2体外磷酸化检测体系.方法 构建携带AKT2 cDNA编码区的pLNCX2逆转录病毒重组载体,包装重组病毒,转导293A细胞,G418筛选得到稳定表达组成型活化的AKT2细胞株,应用免疫沉淀获得蛋白激AKT2;将核基质结合蛋白SATB1的1～204的氨基酸序列及其47位丝氨酸的突变体S47A、S47D,分别与GST基因融合表达载体pGEX4T-1进行重组,经测序鉴定后转化大肠埃希菌BL-21,IPTG诱导表达经亲和纯化得到GST-SATB1 1-204、GST-SATB1 1-204 S47A和GST-SATB1 1-204 S47D融合蛋白;利用免疫沉淀的AKT2磷酸化GST-SATB1融合蛋白,应用免疫印迹检测其是否被磷酸化.结果 细胞表达的蛋白激酶AKT2能高效的将野生型SATB1 1-204 磷酸化,而不能磷酸化其两种突变体.结论 成功建立了一个蛋白激酶体外磷酸化系统.     

G(i)-dependent activation of c-Jun N-terminal kinase in human embryonal kidney 293 cells

Heterotrimeric G proteins stimulate the activities of two stress-activated protein kinases, c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 mitogen-activated protein kinase in mammalian cells. In this study, we examined whether alpha subunits of G(i) family activate JNK using transient expression system in human embryonal kidney 293 cells. Constitutively activated mutants of Galpha(i1), Galpha(i2), and Galpha(i3) increased JNK activity. In contrast, constitutively activated Galpha(o) and Galpha(z) mutants did not stimulate JNK activity. To examine the mechanism of JNK activation by Galpha(i), kinase-deficient mutants of mitogen-activated protein kinase kinase 4 (MKK4) and 7 (MKK7), which are known to be JNK activators, were transfected into the cells. However, Galpha(i)-induced JNK activation was not blocked effectively by kinase-deficient MKK4 and MKK7. In addition, activated Galpha(i) mutant failed to stimulate MKK4 and MKK7 activities. Furthermore, JNK activation by Galpha(i) was inhibited by dominant-negative Rho and Cdc42 and tyrosine kinase inhibitors, but not dominant-negative Rac and phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors. These results indicate that Galpha(i) regulates JNK activity dependent on small GTPases Rho and Cdc42 and on tyrosine kinase but not on MKK4 and MKK7.     

狂犬病病毒糖蛋白重组人腺病毒的构建及免疫效果的初步研究

构建表达狂犬病病毒弱毒SRV9糖蛋白(GP)的重组人5型腺病毒,检测其对小鼠的免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆到腺病毒表达系统中的穿梭质粒多克隆位点,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-Gs9,以罗氏转染液介导线性化骨架质粒和重组穿梭质粒共转染293AD细胞,细胞病变后取培养物进行PCR鉴定并电镜观察,在293AD细胞上测定病毒滴度。以106 TCID50重组腺病毒腹腔接种昆明小鼠,免疫后不同时段采尾静脉血通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测小鼠血清狂犬病中和抗体效价。正确构建重组穿梭质粒pacAd5CMV-Gs9;获得表达狂犬病病毒SRV9株GP蛋白的缺陷型重组人5型腺病毒;病毒滴度达到106 CFU/mL以上;腹腔接种小鼠14d后均产生了抗狂犬病中和抗体,有效保护率达90%。成功获得了表达狂犬病病毒GP基因的重组腺病毒,该腺病毒免疫小鼠可产生保护性中和抗体,为进一步开发新型兽用狂犬病疫苗奠定了物质基础。     

TLR4全长及其截断体重组腺病毒的制备和功能鉴定

制备脂多糖 (LPS)Toll样受体 4 (TLR4 )全长及其胞内段缺失的TLR4截断体 (ΔTLR4 )的绿色荧光蛋白重组腺病毒并鉴定其功能 .用PCR方法扩增TLR4及ΔTLR4基因片段 ,酶切后亚克隆至腺病毒穿梭质粒中 ,形成带有目的基因的穿梭载体pAdTrack TLR4和pAdTrack ΔTLR4 .用BJ5 1 83细菌同源重组法将目的基因重组于腺病毒骨架载体中 ;将重组腺病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后 ,用脂质体法转染HEK 2 93细胞进行腺病毒的包装扩增 .将重组腺病毒感染CHO K1细胞 ,采用荧光毒酶报告基因方法检测其对LPS诱导NF κB激活的影响 .酶切及测序表明 ,TLR4全长及其截断体ΔTLR4的重组腺病毒载体构建正确 .荧光素酶报告基因检测结果表明 ,TLR4全长及其截断体的重组腺病毒感染细胞对LPS诱导的反应具有不同的影响 ,Ad ΔTLR4明显抑制了LPS引起的NF κB激活 (P <0 0 5 ) ,Ad TLR4则使LPS引起的NF κB活性增强 (P <0 0 5 ) .LPS对细胞的激活作用依赖于TLR4的结构完整性     

Identification of a C-terminal region that regulates mitogen-activated protein kinase kinase-1 cytoplasmic localization and ERK activation

The C-terminal region of mitogen-activated protein kinase kinase-1 and 2 (MKK1 and MKK2) may function in regulating interactions with upstream kinases or the magnitude and duration of ERK mitogen-activated protein kinase activity. The MKK C-terminal region contains a proline-rich region that reportedly functions in regulating interactions with the Raf-1 kinase and ERK activity. In addition, phosphorylation sites in the C terminus of MKK1 have been suggested to either sustain or attenuate MKK1 activity. To further understand how phosphorylation at the C terminus of MKK1 and protein interactions regulate MKK1 function, we have generated several MKK1 C-terminal deletion mutants and examined their function in regulating MKK1 localization, ERK protein activation, and cell growth. A deletion of C-terminal amino acids encompassing two putative alpha-helices between residues 330 and 379 caused a re-distribution of mutant MKK1 proteins to membrane compartments. Immunofluorescence analysis of MKK1 mutants revealed a loss of homogenous cytosolic distribution that is typically observed with MKK1 wild type, suggesting this region regulates MKK1 cellular localization. In contrast, MKK1 C-terminal deletion mutants localized to various sized punctate regions that overlapped with lysosome compartments. ERK activation in response to constitutively active Raf-1 or growth factor stimulus was attenuated in cells expressing MKK1 C-terminal deletion mutants. This could be partly explained by the inability of Raf-1 to phosphorylate MKK1 C-terminal deletion mutants even though the phosphorylation sites were intact in these mutants. Finally, we show that cells expressing MKK1 C-terminal deletion mutants displayed characteristic patterns of apoptotic cell death and reduced cell proliferation. These findings identify a novel C-terminal region between amino acid residues 330 and 379 on MKK1 that is necessary for regulating the cytoplasmic distribution and subsequent ERK protein activation necessary for cell survival and viability.     

CD/TK单、双自杀基因重组腺病毒的制备及初步应用

为制备表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase ,CD)和单纯疱疹病毒 1 胸苷激酶(herpessimplexvirustype 1thymidinekinase ,TK)双自杀基因的重组腺病毒载体 ,为再狭窄基因治疗的应用奠定基础 ,首先构建了含单、双自杀基因的腺病毒穿梭载体 ,细菌内同源重组法获得重组腺病毒质粒 .脂质体介导下转染 2 93细胞进行包装并大量扩增得到Ad TK、Ad CD、Ad TK CD、Ad LacZ 4种重组腺病毒 .氯化铯 (CsCl)梯度离心法纯化后利用报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)测定病毒滴度 ,可达 10 9pfu ml .PCR和Western印迹法对外源基因进行鉴定 ,证明单、双自杀基因均已整合入腺病毒基因组并表达 .重组腺病毒感染血管平滑肌细胞后 ,用MTT法比较了单、双自杀基因的杀伤作用 ,发现在感染复数≤ 2 0时 ,双自杀基因对细胞的抑制作用明显高于单基因 .成功地构建腺病毒双自杀基因共表达载体 ,为进一步的体内外实验奠定了基础 .     

MEK kinase 3 directly activates MKK6 and MKK7, specific activators of the p38 and c-Jun NH2-terminal kinases.

Mitogen-activated protein kinase (MAPK)/extracellular signal-regulated kinase kinase kinase 3 (MEKK3) activates the c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) pathway, although no substrates for MEKK3 have been identified. We have examined the regulation by MEKK3 of MAPK kinase 7 (MKK7) and MKK6, two novel MAPK kinases specific for JNK and p38, respectively. Coexpression of MKK7 with MEKK3 in COS-7 cells enhanced MKK7 autophosphorylation and its ability to activate recombinant JNK1 in vitro. MKK6 autophosphorylation and in vitro activation of p38alpha were also observed following coexpression of MKK6 with MEKK3. MEKK2, a closely related homologue of MEKK3, also activated MKK7 and MKK6 in COS-7 cells. Importantly, immunoprecipitates of either MEKK3 or MEKK2 directly activated recombinant MKK7 and MKK6 in vitro. These data identify MEKK3 as a MAPK kinase kinase specific for MKK7 and MKK6 in the JNK and p38 pathways. We have also examined whether MEKK3 or MEKK2 activates p38 in intact cells using MAPK-activated protein kinase-2 (MAPKAPK2) as an affinity ligand and substrate. Anisomycin, sorbitol, or the expression of MEKK3 in HEK293 cells enhanced MAPKAPK2 phosphorylation, whereas MEKK2 was less effective. Furthermore, MAPKAPK2 phosphorylation induced by MEKK3 or cellular stress was abolished by the p38 inhibitor SB-203580, suggesting that MEKK3 is coupled to p38 activation in intact cells.