多粘类芽胞杆菌利用生物柴油副产物粗甘油生产乙偶姻

研究多粘类芽胞杆菌利用廉价底物生物柴油副产物粗甘油批次发酵生产乙偶姻,考察不同pH条件、不同转速下乙偶姻、2,3-丁二醇和乙酸3种主要产物的产量,根据发酵结果设计一种三阶段溶氧调节的方法,结果表明:经76h批次发酵,乙偶姻产量为14.62 g/L,副产物2,3-丁二醇和乙酸分别为1.24和2.93 g/L;副产物量低,且易于分离,可以有效减少后期分离提取产物的成本。     

代谢工程改造枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻

乙偶姻是枯草芽孢杆菌的主要代谢产物,它作为一种食用香精,广泛应用于食品、烟草、化妆品、清洁剂、酒类等行业。本研究首先在不产芽孢的枯草芽孢杆菌(BSD1,阻断了芽孢的合成途径)中敲除了2,3-丁二醇脱氢酶(BDH)的编码基因bdh A、乳酸脱氢酶(LDH)的编码基因ldh和乙酸激酶的编码基因(ACK)ack A,随后克隆了来自菌株B.subtilis168的α-乙酰乳酸合成酶(ALS)和α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)基因als S和als D,并将其在上述敲除菌中过量表达,结果表明阻断副产物合成途径和加强乙偶姻合成途径关键酶的表达,会显著提高乙偶姻的产量,最终乙偶姻产量达到38.08 g/L,产率为0.45 g·L~(-1)·h~(-1),产率提高了约87.5%。     

一株耐受高浓度葡萄糖且产乙偶姻菌株的筛选及产物鉴定

为获得一株耐受高浓度葡萄糖且产乙偶姻的菌株,利用高糖培养基以及乙偶姻显色液从烟田土壤中筛选到一株全新菌株;将筛选出的菌株利用全基因组测序技术和16S rDNA序列比对分析对菌株进行鉴定,并利用不同浓度葡萄糖的培养基对菌株进行耐受实验;最后,利用GC-MS(气相-质谱)将菌株的发酵产物定性分析,并对菌株进行72 h的初步发酵。结果显示,筛选获得菌株为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),命名为PX03。葡萄糖耐受实验中,菌株PX03在含有500 g/L葡萄糖的培养基中依然能生长,OD600可达65;300 g/L葡萄糖浓度下生长最好,OD600可达100。GC-MS定性结果分析发现,该菌株可产大量的乙偶姻(22.51%)和2,3-丁二醇(21.29%),同时可产乙酸(13.97%)、3,4-二羟基-3,4-二甲基己烷-2,5-二酮(8.52%)、吡喃酮(5.24%)和3-甲基-丁酸(4.47%)等一些香气成分。对菌株的初步发酵结果显示,该菌株乙偶姻产量可达41 g/L。     

乙酸合成途径阻断及NADH氧化酶表达对于谷氨酸棒杆菌生产乙偶姻的影响

【目的】研究乙酸合成途径阻断及NADH氧化酶表达对于谷氨酸棒杆菌生产乙偶姻的影响。【方法】在谷氨酸棒杆菌CGF2中异源表达als SD操纵子构建乙偶姻生产菌株CGT1,考察敲除乙酸生成途径cat和pqo对乙偶姻的影响。然后引入短乳杆菌的NADH氧化酶,在优化的溶氧条件下研究其对乙偶姻产量的影响。【结果】CGT1在摇瓶发酵中可积累6.27 g/L乙偶姻,敲除cat使乙偶姻产量显著提高30.94%,达到8.21 g/L;双敲除cat和pqo没有进一步提高产量。通过优化发酵的溶氧水平,乙偶姻产量达到10.06 g/L。在高溶氧水平下引入NADH氧化酶导致菌株的生长和糖代谢速率提高,但乙偶姻产量略有降低。在分批补料发酵中,重组菌株乙偶姻产量达到40.51 g/L,产率为0.51 g/(L?h)。【结论】在谷氨酸棒杆菌中阻断乙酸合成途径cat能够有效提高乙偶姻产量,NADH氧化酶在高溶氧水平下表达不利于乙偶姻的合成,需要进一步调节表达水平以确定其效果。     

枯草芽孢杆菌氧化还原感应全局调控因子Rex对乙偶姻合成的影响

【背景】枯草芽孢杆菌体内含有一种可响应胞内氧化还原水平的因子,称之为氧化还原感应全局调控因子Rex (由基因ydiH编码)。Rex可通过感知辅酶NADH/NAD+水平的变化来调节胞内氧化还原平衡。【目的】研究Rex对枯草芽孢杆菌乙偶姻合成和辅因子代谢的相关性。【方法】利用比较转录组挖掘乙偶姻和2,3-丁二醇可逆转化过程中显著差异的基因,并通过Cre/lox基因敲除技术敲除ydiH、acuA (乙酰AcsA)和acoC (二氢脂酰胺乙酰转移酶)。随后,利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术分析敲除菌株中乙偶姻相关基因的转录水平。【结果】通过发酵实验发现,敲除ydiH会在一定程度上抑制菌体的生长速率,但发酵前期乙偶姻单位细胞产量和底物转化率都得到了显著提高;敲除acuA和acoC后,对乙偶姻合成、菌体生长和糖耗速率均影响不大;敲除ydiH后,与乙偶姻合成相关基因alsR (alsSD的正转录调控因子)、alsS (α-乙酰乳酸合成酶)、alsD (α-乙酰乳酸脱羧酶)和bdhA (2,3-丁二醇脱氢酶)的转录水平显著上调。【结论】枯草芽孢杆菌氧化还原感应全局调控因子Rex通过抑制与...     

乙酸、糠醛和5-羟甲基糠醛对产酸克雷伯氏菌发酵生产2,3-丁二醇的影响

为了解产酸克雷伯氏菌对木质纤维素水解液中主要抑制物的耐受和代谢,考察了产酸克雷伯氏菌发酵生产2,3-丁二醇(2,3-butanediol,2,3-BDO)过程中对3种发酵抑制物乙酸、糠醛和5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural HMF)的耐受以及抑制物浓度的变化,检测了糠醛和HMF的代谢产物.结果表明:产酸克雷伯氏菌对乙酸、糠醛和HMF的耐受浓度分别为30 g/L、4 g/L和5 g/L.并且部分乙酸可作为生产2,3-丁二醇的底物,在0～30 g/L浓度范围内可提高2,3-丁二醇的产量.发酵过程中产酸克雷伯氏菌可将HMF和糠醛全部转化,其中约70％HMF被转化为2,5-呋喃二甲醇,30％HMF和全部糠醛被菌体代谢.研究表明在木质纤维素水解液生产2,3-丁二醇的脱毒过程中可优先考虑脱除糠醛,一定浓度的乙酸可以不用脱除.     

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵生产乙偶姻的pH调控策略

【目的】为了提高Bacillus subtilis CCTCC M 208157发酵生产乙偶姻的效率。【方法】在7 L发酵罐水平上考察不同pH条件对菌株生长及乙偶姻合成的影响。【结果】pH对菌株合成乙偶姻有显著影响,pH 4.5有利于细胞合成乙偶姻,但是延迟期较长;pH 5.5时菌株生长较快,但乙偶姻的产量偏低。因此提出了两阶段pH控制策略:发酵前期(0 16 h),控制pH 5.5;发酵中后期(16 72 h),控制pH 4.5。【结论】通过此策略,菌株合成乙偶姻的能力得到进一步提高,乙偶姻的产量、产率和生产强度分别为32.7 g/L、0.41 g/g和0.91 g/(L.h),分别比初始发酵条件下提高了41%、42%和69%。     

加强表达6-磷酸果糖激酶提高Bacillus subtilis乙偶姻合成效率

乙偶姻是枯草芽孢杆菌的主要胞外产物,它是一种广泛使用的食用香精,同时也可作为重要的化学中间体,因此提高枯草芽孢杆菌乙偶姻的产量和生产效率有重要意义。本研究克隆了编码枯草芽孢杆菌6-磷酸果糖激酶(PFKA)和丙酮酸激酶(PK)的编码基因pfk A和py K,并分别将其在高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌BM(敲除了2,3-丁二醇脱氢酶的编码基因bdh A)中过量表达。结果表明过量表达PFKA或者PK能有效提高糖酵解速率以及发酵过程的生物量,并且过量表达PFKA与过量表达PK相比更有利于乙偶姻的合成。在5 L发酵罐上对工程菌进行发酵实验发现,经底物流加发酵,乙偶姻产量达到66.8 g/L,生产效率达到0.74 g·(L·h)-1。本研究为利用枯草芽孢杆菌作为细胞工厂生产相关化合物有重要的借鉴意义。     

Analysis of 2,3-butanediol production with Klebsiella pneumoniae using sugar mixture under different oxygen supply conditions

以筛选的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae UV-86)为对象,考察供氧条件分别对菌体生长、葡萄糖和木糖双底物利用和产物合成的影响.研究发现生物量随氧供应量增加而增加.不同供氧条件对菌体消耗葡萄糖过程的影响较小,而代谢木糖的能力随氧供应量的增大而增强.微氧条件下2,3-丁二醇的生物合成能力最强,2,3-丁二醇产量在1.5 vvm下达到最高为30.1 g/L,是好氧时的2.5倍,最大体积产率为0.485 g/(L·h).不同条件下两底物产物分布有所区别,木糖代谢中乙酸生产增强.因此根据不同阶段代谢特点选择适合的供氧策略可以提高过程产量和产率.     

生物法制备平台化合物乙偶姻的最新研究进展

乙偶姻(3-羟基-2-丁酮)作为一种应用广泛的食用香料和重要的平台化合物,具有广阔的工业应用前景。与传统的化学合成方法不同,高效、环保的乙偶姻生物制备方法,可以减轻资源和环境压力,促进我国低碳经济的发展。近来,生物法制备平台化学品乙偶姻取得了丰硕的研究成果。总结了最近几年国内外在该领域最新的研究热点及方向,简述了发酵法生产乙偶姻的优势菌株概况,重点综述了以糖类物质为底物生产乙偶姻的最新策略及研究成果、将微生物改造为生产手性乙偶姻的高效细胞炼制工厂以及将2,3-丁二醇或双乙酰作为发酵底物的研究趋势,并介绍了乙偶姻的分离纯化工艺。使用非致病性的安全菌株,高效率地利用廉价底物,并采用经济、简单、环保的分离纯化方式,从而生产具有高附加值的食品级或高手性纯度乙偶姻,是生物法制备乙偶姻产业化发展的可靠保障。     

地衣芽胞杆菌乙醛酸循环对聚谷氨酸合成的影响北大核心

[目的]了解乙醛酸循环在地衣芽胞杆菌WX-02生物合成聚谷氨酸中作用,为聚谷氨酸生产提供新的解决方法。[方法]采用基因工程手段,以地衣芽胞杆菌WX-02为原始菌株,分别增强表达和敲除异柠檬酸裂解酶ace A基因,检测发酵过程中聚谷氨酸产量、生物量、胞内外代谢物和相关基因转录量。[结果]增强表达异柠檬酸裂解酶ace A基因后,胞内谷氨酸浓度显著升高(483.42 ng/m L/Log(CFU)),溢流代谢产物减少(乙酸5.41 g/L、乙偶姻5.82 g/L、2,3-丁二醇7.31 g/L),聚谷氨酸生物合成产量为11.74 g/L,相比原始菌株提高15%。谷氨酸脱氢酶roc G基因、谷氨酸消旋酶glr基因和聚谷氨酸合成酶复合体中pgs B基因转录水平相对原始菌株分别提高1.61倍、1.32倍和1.24倍。[结论]增强乙醛酸循环可以降低地衣芽胞杆菌WX-02乙酸等溢流代谢产物合成,提高胞内谷氨酸合成能力,并上调聚谷氨酸合成酶基因转录水平,最终提高聚谷氨酸生物合成产量。     

地衣芽胞杆菌乙醛酸循环对聚谷氨酸合成的影响

[目的]了解乙醛酸循环在地衣芽胞杆菌WX-02生物合成聚谷氨酸中作用,为聚谷氨酸生产提供新的解决方法。[方法]采用基因工程手段,以地衣芽胞杆菌WX-02为原始菌株,分别增强表达和敲除异柠檬酸裂解酶ace A基因,检测发酵过程中聚谷氨酸产量、生物量、胞内外代谢物和相关基因转录量。[结果]增强表达异柠檬酸裂解酶ace A基因后,胞内谷氨酸浓度显著升高(483.42 ng/m L/Log(CFU)),溢流代谢产物减少(乙酸5.41 g/L、乙偶姻5.82 g/L、2,3-丁二醇7.31 g/L),聚谷氨酸生物合成产量为11.74 g/L,相比原始菌株提高15%。谷氨酸脱氢酶roc G基因、谷氨酸消旋酶glr基因和聚谷氨酸合成酶复合体中pgs B基因转录水平相对原始菌株分别提高1.61倍、1.32倍和1.24倍。[结论]增强乙醛酸循环可以降低地衣芽胞杆菌WX-02乙酸等溢流代谢产物合成,提高胞内谷氨酸合成能力,并上调聚谷氨酸合成酶基因转录水平,最终提高聚谷氨酸生物合成产量。     

α—乙酰乳酸脱羧酶的研究进展及其应用前景

在啤酒酿造中,双乙酸（diacetyl）是影响啤酒风味成熟、熟化期长短的主要因素,当其含量超过阈值（0．15x10ed）时,产生令人难以接受的馊饭味．双乙酸主要是啤酒酵母代谢的产物,由a一乙酸乳酸（a－nnetoactate）经非酶氧化脱按产生,酵母的双乙酸还原酶将其还原成乙偶姻（ec     

应用合成生物学策略构建全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻

目的:在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶(DAR),同时构建辅酶NADH原位再生系统,利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成(S)-乙偶姻。方法:PCR克隆多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) dar基因连到质粒pETDuet-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR;通过Hi Trap TALON柱亲和层析纯化表达产物DAR酶蛋白,测定DAR的比酶活和分子动力学参数。在重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR中构建辅酶NADH原位再生系统,协同表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(GDH),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH,并以此重组菌为全细胞生物催化剂,优化催化条件,提高(S)-乙偶姻的产量和产率。结果:获得重组工程菌E. coli BL21(DE3)-DAR和E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR以NADH为辅酶还原丁二酮的米氏常数Km、最大催化速率Vmax、催化常数Kcat分别为2. 59mmol/L、1. 64μmol/(L·min·mg)、12. 3/s,还原丁二酮生成(S)-乙偶姻光学的纯度为95. 86%,具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶NADH原位再生系统后,重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料,乙偶姻产量达51. 26g/L,转化率为81. 37%,生产速率为5. 13g/(L·h)。结论:使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物(S)-乙偶姻,以重组菌为全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻,不需额外添加昂贵的辅酶,具有较高的生产应用价值。     

乙偶姻生物合成代谢调控及其应用

许多微生物在糖酵解过程中能够将糖类转化为乙偶姻来避免过度酸化。乙偶姻能够调节NAD＋/NADH的比率并存储碳源。此外,乙偶姻作为一种具有特殊奶油香气的食用香料,广泛应用于食品,烟草、酒类和化妆品行业。近些年研究发现许多植物根际促生菌能够通过产生乙偶姻激活植物对外界环境压力的抗性,激活植物系统抗性,抵御病原菌的侵袭。乙偶姻还可以促进植物生长,提高产量。另外,乙偶姻还是调节根际促生菌与宿主植物相互作用的信号分子。简述乙偶姻的生物合成路径及其调控,并介绍乙偶姻在食品、医药、化工、化妆品、植物保护、生物燃料等方面的应用。     

氧供应量对Klebsiella pneumoniae利用混合糖生物合成2,3-丁二醇过程的影响分析

以筛选的肺炎克雷伯氏茵（Klebsiella pneumoniaeUV-86）为对象,考察供氧条件分别对茵体生长、葡萄糖和木糖双底物利用和产物合成的影响。研究发现生物量随氧供应量增加而增加。不同供氧条件对茵体消耗葡萄糖过程的影响较小,而代谢木糖的能力随氧供应量的增大而增强。微氧条件下2,3-丁二醇的生物合成能力最强,2,3-丁二醇产量在1．5wm下达到最高为30．1g／L,是好氧时的2．5倍,最大体积产率为0．485g／（L·h）。不同条件下两底物产物分布有所区别,木糖代谢中乙酸生产增强。因此根据不同阶段代谢特点选择适合的供氧策略可以提高过程产量和产率。     

半连续和连续生物转化

培养的植物细胞在活性生长阶段通常不会产生大量的次级代谢产物,适合活性细胞生长的培养基和培养条件也与次级代谢产物生产所需要的条件不同.因此,经常用二步操作法通过植物细胞培养物进行次级代谢产物的生产,第一步适合细胞生长,第二步适合产物合成.可是,植物细胞分裂缓慢,需要几周或几个月产生的细胞体积才能适合在生物反应器中大规模生产代谢产物. 蒂宾根大学的科学家W.Kreis和E.Reinhard采用二步法培养毛地黄(Digitalis lanata)细胞,开发了一种生产强心甾类药物去乙酰毛花甙C的半连续方法.该方法采用2种     

代谢工程改造多粘芽孢杆菌及合成光学纯(R,R)-2,3-丁二醇

(R,R)-2,3-BD是一种重要的四碳平台化合物,在液晶材料、高附加值手性化合物,尤其是不对称合成光学纯药物等方面有天然优势.将来源于多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DSM 365的α-乙酰乳酸合成酶(α-acetolactate synthase)基因 alsS、α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase)基因alsD和(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶(2,3-butanediol dehydrogenase)基因R,R-bdh与表达载体pMA5连接,导入多粘芽孢杆菌P.polymyxa DSM 365中加强(R,R)-2,3-丁二醇的主代谢途径,构建可高效合成(R,R)-2,3-丁二醇的多粘芽孢杆菌工程菌株DM-5.利用工程菌株DM-5补料分批发酵60 h,(R,R)-2,3-丁二醇产量达54.91 g/L,得率为0.52 g/g,生产强度为0.92 g·L-1·h-1,与野生菌株相比(R,R)-2,3-丁二醇产量增加19.66％,且副产物甲醇浓度不变,乙醇、乙偶姻积累下降.本研究结果表明,在多粘芽孢杆菌中过量表达关键基因alsS、alsD和R,R-bdh 能够显著提高(R,R)-2,3-丁二醇的产量和生产强度,为多粘芽孢杆菌的代谢工程改造和工业化生产(R,R)-2,3-丁二醇提供参考.     

利用发酵法生产四甲基吡嗪研究进展

2,3,5,6-四甲基吡嗪(2,3,5,6-Tetramethylpyrazine,TTMP)是一种重要的食品香料添加剂,同时具有治疗心脑血管疾病、呼吸系统疾病和肾小球疾病等的药用价值。回顾了微生物发酵法生产TTMP的研究进展,并分析了TTMP的产生机制,总结了提高生产TTMP的有效途径,包括筛选内源性高产菌株、发酵过程优化、外源添加铵盐和分阶段的发酵控制等策略。提出合成TTMP的过程是一个生化反应过程,是生物酶催化代谢产生乙偶姻和乙偶姻与铵离子自发生成TTMP两个阶段综合作用的结果,利用分阶段温度控制的发酵策略可有效提高TTMP产量。对产物的提取和纯化进行了介绍,并根据目前的进展、面对的挑战和发展趋势对发酵法生产TTMP研究前景进行了展望。     

化工上的应用

知1395利用一种假丝醉母的游离和固定化脂酶通过与甘油三乙酸脂的醋交换化拆开D工一薄荷醉庚】/Lokotsch,W一11APPI.Microbiol.Biotechnol一1989,31(5/6)一467一472[译自CBA,1989,(11),4878】 用ca月d翻阮cyU九d护aceu的游离和固定化脂酶,并以甘油三乙酸酸作酸基给体,在异辛烷中的酪交换作用,是D,L一薄荷醇外消旋拆解的有效方法.同乙酸作酸基供体的醋合成相比,这个高度立体选择型反应不产生水.甘油三乙酸醋的浓度若高于10 mmol/l,醋交换作用会受抑制,使用甘油二乙酸酸更是如此.产物乙酸甲醋 一103一没有影响.加水会便脂醉几活性明显降…