全血γ-干扰素释放试验在结核诊断中的应用价值

目的:评价全血γ-干扰素释放试验在结核病中的诊断价值。方法:将173例疑似结核病患者分为临床明确诊断肺结核63例(肺结核组)、肺外结核43例(肺外结核组)、排除结核67例(非结核组),观察各组γ-干扰素释放试验阳性率。结果:肺结核组、肺外结核组阳性率分别为85.7%(54/63)和88.4%(38/43),显著高于非结核组11.9%(8/67)(P0.01);诊断灵敏度为86.8%,特异度为88.1%。结论:全血γ-干扰素释放试验具有较高灵敏度和特异度,可用于肺结核及肺外结核的辅助诊断,适合临床推广使用。     

T SPOT TB技术用于结核的辅助诊断

近年来,我国结核病的发病率有上升趋势,临床上经常会遇到一些症状不典型的结核病和肺外结核病,而目前可用于诊断结核病的方法有限,同时又缺乏快速敏感的实验室技术,为结核病的早期诊断与治疗带来困难.酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)技术是一种新型的免疫酶技术,从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞[1].由ELISPOT发展而来的T SPOT TB(结核感染T细胞斑点试验)技术用于检测结核感染后特异性T细胞分泌的γ干扰素(IFN-γ),并据此结果判断是否感染结核.     

活动性肺结核密切接触者结核感染情况及随访分析

本文筛查和随访结核密切接触者的潜伏感染情况和发病情况,并分析了相关的影响因素。首先,回顾性分析了2012年3月—2019年8月在无锡市第五人民医院结核科住院的活动性肺结核患者的临床资料,并随访了其中进行过γ干扰素释放试验(interferon-γ release assay, IGRA)的密切接触者。7年共完整随访到39例活动性肺结核患者及其74例密切接触者,74例密切接触者中27例IGRA阳性(36.5%),47例IGRA阴性(63.5%),且IGRA阳性密切接触者中无一例进展为活动性结核。单因素分析结果提示,IGRA阳性密接组和IGRA阴性密接组在吸烟(3/27 vs 0/47,P=0.045)、与结核患者接触时间>5 h/d (22/27 vs 23/47,P=0.007)、同屋居住(23/27 vs 20/47,P=0.001) 3方面的差异具有统计学意义。进一步比较发现,较于IGRA阴性密接组,IGRA阳性密接组接触的活动性肺结核患者痰涂片结核菌的负荷量更高(P=0.019)。多因素分析结果则显示,肺结核患者痰涂片结核菌量能够显著影响密切接触者的IGRA结果,痰结核菌量...     

结核分枝杆菌MPT83的免疫原性及其奶牛结核病血清学检测方法的建立

【目的】利用大肠杆菌系统表达并纯化结核分枝杆菌MPT83蛋白,通过小鼠模型评价其免疫原性,建立血清学间接ELISA方法用于牛结核病临床检测,评价其应用潜能。【方法】构建p ET30a(+)-mpt83重组质粒,转化BL21(DE3)诱导表达并纯化,经细胞表面分子的流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)分析、ELISPOT试验等分析其在小鼠中的免疫原性,建立间接ELISA方法,检测临床奶牛血样,评价其用于牛结核病血清学检测的潜能。【结果】SDS-PAGE显示目的蛋白成功表达,Western blot证实其对兔抗H37Rv多抗血清具有良好免疫反应性;FCM结果显示其下调树突状细胞表面CD80分子的表达,上调小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞表面CD69的表达,ELISPOT结果表明其诱导的特异性IL-4分泌细胞数显著高于IFN-γ分泌细胞数,表现为Th2型免疫应答;建立了ELISA方法,检测临床奶牛血样200份,与牛结核外周血γ-干扰素体外释放试验结果的阳性符合率和阴性符合率分别为48.6%和90%。【结论】在大肠杆菌系统中高效可溶性表达MPT83蛋白,其在小鼠模型中主要呈现Th2型免疫应答,并以该蛋白为抗原建立了牛结核病血清学检测的间接ELISA方法。     

T细胞免疫检测在肺结核鉴别诊断中的应用

目的评估结核感染T细胞免疫检测(IGRA/ELISA法)用于在肺部感染患者中鉴别诊断结核病的效能。方法选取肺部感染患者106例,根据结核诊断标准确诊30例为结核感染,76例为非结核感染。用IGRA/ELISA法检测患者血液中经结核特异性抗原刺激后的淋巴细胞释放的IFN-γ含量,比较两组IFN-γ含量的差异;绘制ROC曲线并分析AUC和最佳截断值及最佳界点处的敏感度、特异度和约登指数。结果结核组IFN-γ浓度均值为(329.72±31.03)pg/mL,非肺结核组为(52.77±12.08)pg/mL,t=8.318,P0.001。ROC曲线下面积AUC=0.934(95%CI,0.890~0.978),当界点为59.70pg/mL时,灵敏度为100.0%,特异度为78.9%,约登指数为0.789;当界点为108.25pg/mL时,灵敏度为90.0%,特异度为84.2%,约登指数为0.742;当界点为404.00pg/mL时,灵敏度为33.3%,特异度为100.0%,约登指数为0.333。结论以IGRA/ELISA法检测IFN-γ浓度,以59.70pg/mL,108.25pg/mL,404.00pg/mL三个界点辅助临床对肺部感染鉴别诊断结核病有较好应用价值。     

牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法的建立

本研究旨在建立一种牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法,并评价该方法用于牛结核病检测的价值。通过筛选与天然牛γ干扰素特异性结合的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体,并探索不同的实验条件确定最佳包被抗体浓度、最佳细胞数量和最佳检测抗体浓度等,建立牛γ干扰素ELISPOT检测方法。采集30头奶牛尾静脉血并分离外周血单个核细胞,以结核菌素作为刺激原,使用建立的ELISPOT检测方法进行牛结核病检测,并与BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测结果进行比较。筛选到两株与天然牛γ干扰素特异性结合的单抗2G5和5E11,确定ELISPOT检测方法的最佳实验条件为:包被抗体2G5浓度2.5μg/m L,每孔细胞数量2.5×105个,检测抗体Bio-5E11浓度1μg/mL。使用建立的ELISPOT检测方法与BOVIGAMTM ELISA试剂盒对30头奶牛进行同步检测,结果显示,以BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测结果作为参考标准,14头BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测阳性牛中,ELISPOT方法检出的阳性牛为11头,敏感性为78.6%(11/14);16头BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测阴性牛中,ELISPOT方法检出的阴性牛为12头,特异性为75%(12/16)。应用结核菌素作为刺激原的牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法可用于牛结核病辅助检测,具有潜在的临床应用价值。     

奶牛结核病诊断方法的比较研究

旨在比较目前实验室用于检测牛结核方法及PPD皮内变态反应检测牛结核的敏感性和特异性.对145头进行了PPD结核菌素实验的牛进行了IFN-γ体外释放试验,ELISA方法检测ESAT-6,CFP-10,MPB70,MPB83四个蛋白的抗体,胶体金检测两种相似蛋白MPB70和MPB83.结果表明,IFN-γ体外释放试验的敏感性和特异性最高,与PPD皮内变态反应有较高的符合性.在抗体检测方面,iELISA的敏感性高于胶体金方法.虽然抗体检测(iELISA和胶体金方法)比细胞介导的免疫方法(IFN-γ和PPD)敏感性要低,前者更适合于检测处于结核病程发展后期的样本,并且可以有效降低假阳性反应.     

结核分枝杆菌感染实验室诊断新进展及其应用

结核菌感染者日益增多,给人群造成极大威胁.准确、及时的实验室检查能保证感染患者得到早期诊断和治疗,从而对消除传染源、控制结核病流行起到关键的作用.传统的实验室诊断方法有限,以T细胞为基础的γ-干扰素释放试验以其高度的敏感性和特异性受到国内外检验工作者的广泛关注.本研究就γ-干扰素释放试验的优势及在临床中的应用进行综述.     

γ干扰素释放试验在儿童肺结核诊断中的价值

为研究2种γ干扰素释放试验(IGRA)试剂盒在结核病高发、卡介苗(BCG)高接种地区用于诊断儿童肺结核的价值,共入组临床怀疑肺结核患儿114例,其中45例行QuantiFERON-Gold In-Tube(QFT-GIT)检测,69例行T-SPOT.TB检测,收集临床资料,比较2种方法的灵敏度、特异度、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。结果显示,QFT-GIT在儿童肺结核诊断中的灵敏度为84.6%、特异度为81.3%、PPV为91.7%、NPV为76.5%。T-SPOT.TB的灵敏度为72.3%、特异度为93.7%、PPV为97.1%、NPV为53.6%。与未治疗患儿相比,激素治疗患儿QFT-GIT和T-SPOT.TB的阳性率显著下降。研究提示,QFT-GIT和TSPOT.TB较少受潜伏性结核感染的影响,用于中国儿童肺结核的诊断具有较高的PPV。     

携带猪γ干扰素基因逆转录病毒载体的构建及其在猪肾细胞(PK-15)中的表达

将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/106cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。     

人α和γ干扰素联合应用的抗病毒协同作用

采用病毒产量减少试验,在A_(540)细胞上观察α和γ干扰素联合应用的抗病毒协同作用。结果表明:协同倍数为5-16倍;协同作用由干扰素本身的性质所决定,与其它成分无关;α干扰素不能促使γ干扰素加快透生抗病毒状态的建立;故认为协同作用的产生与两型干扰素的细胞受体不同以及抗病毒的生化途径不同有关。     

TNF-alpha，IFN-r，TGF-beta及IL-10 在骨关节结核中的表达及意义

目的:探讨转化生长因子(TGF-β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)及白介素-10(IL-10)在骨关节结核组织中的表达及其对骨质骨量的影响。方法:选择2012年6月-2014年6月我院收治的骨关节结核患者50例,应用免疫组化法检测患者结核中心病灶TGF-β、TNF-α、IFN-γ及IL-10的表达水平。结果:TNF-α、IFN-γ、TGF-β及IL-10在结核组织中呈不同程度的阳性表达(P<0.05)。TNF-α和IFN-γ在增生性病变中的表达高于干酪性病变,TGF-β和IL-10在干酪性病变中的表达高于增生性病变(P<0.05)。增生性病变中,IFN-γ在坏死性结核肉芽肿中的表达低于非坏死性肉芽肿(P<0.05),TNF-α、TGF-β及IL-10表达无明显差异(P>0.05)。干酪性病变中,TNF-α在非坏死性结核肉芽肿中的表达高于坏死性肉芽肿,TGF-β在坏死性结核肉芽肿中的表达高于非坏死性肉芽肿(P<0.05),IFN-γ和IL-10表达无明显差异(P>0.05)。与正常骨组织细胞数相比,增生性病变与干酪性病变组织的成骨细胞数低,破骨细胞数高(P<0.05)。结论:TGF-β、TNF-α、IFN-γ及IL-10在骨关节结核组织中存在不同程度的表达,对病情的发生发展及骨质骨量具有重要影响。     

结核分枝杆菌海藻糖磷酸磷酸酶诱导小鼠体液和细胞免疫应答

目的 研究结核分枝杆菌(M．tuberculosis)海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)诱导小鼠体液和细胞免疫。方法 差速离心分离结核分枝杆菌H37Rv和卡介苗(BCG)的各细胞组分,通过Western杂交检测抗原TPP在结核分枝杆菌H37Rv和BCG中的亚细胞定位情况。分别用5×10~6CFU的BCG和50μg的TPP蛋白免疫C57BL/6小鼠,检测小鼠血清中抗TPP的IgG1和IgG2a抗体效价。取免疫小鼠的脾细胞,体外抗原刺激,用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测γ干扰素(IFN-γ)分泌细胞。结果 TPP亚细胞定位于结核分枝杆菌H37Rv和BCG的胞壁和细胞膜组分。TPP蛋白免疫后小鼠产生的TPP特异性IgG1和IgG2a抗体效价明显高于BCG免疫小鼠,并且IgG2a的抗体效价高于IgG1。体外抗原刺激TPP蛋白和BCG免疫小鼠的脾细胞,都能诱导较高的IFN-γ分泌。结论 结核分枝杆菌细胞壁蛋白TPP能诱导小鼠Ⅰ型辅助性T细胞介导的免疫反应,可作为抗结核疫苗的候选抗原。     

人IFN-γ体外释放检测法的建立及其在结核病诊断中的应用

本研究旨在建立人IFN-γ体外释放检测法,用于人结核病的特异性诊断.克隆表达了人IFN-γ基因,利用纯化的重组IFN-γ免疫小鼠,获得两株高效价的单克隆抗体.用所获得的单克隆抗体及兔抗IFN-γ多克隆抗体建立了检测人IFN-γ的夹心ELISA,检测灵敏度达到31.25 pg/mL.采集111位结核病阳性病人与292位临床健康对照者肝素抗凝全血,利用结核菌特异性抗原ESAT-6/CFP-10融合蛋白体外刺激外周血淋巴细胞释放IFN-γ,用所建立的夹心ELISA及商品化试剂盒平行检测所有样本,结果表明两种方法的检测结果相符.结核患者的检测灵敏度为95.5%,健康对照的阳性检出率为16.7%,患者与健康对照的阳性检出率差异极显著(P<0.01),证实所建立的方法灵敏度与特异性均很高,具有良好的应用前景.     

CBR2激活与小胶质细胞的活化和损伤的关系

目的:探讨大麻素CBR2受体激动剂AM1241预处理对脂多糖(LPS)和γ-干扰素(IFN-γ)所致炎症反应对小胶质细胞活化和损伤的影响。方法:联用LPS和IFN-γ作为小胶质细胞损伤模型,将细胞分为Control组、AM1241组、LPS/IFN-γ组和AM1241+LPS/IFN-γ组;AM1241组和AM1241+LPS/IFN-γ组经AM1241预处理2h,LPS/IFN-γ组和AM1241+LPS/IFN-γ组用含LPS和IFN-γ的培养基培养24h。采用MTT法检测细胞代谢率,硝酸还原酶法检测细胞培养液中一氧化氮(NO)释放量,酶联免疫吸附剂测定细胞培养基中炎症因子释放量,倒置相差显微镜观察细胞形态。结果:与LPS/IFN-γ组相比,AM1241+LPS/IFN-γ组细胞代谢率明显升高(P<0.05),NO、TNF-α、IL-1β和IL-10释放量明显减少(P<0.05),活化和损伤程度明显减轻。结论:大麻素CBR2受体激动剂AM1241预处理可减轻LPS和IFN-γ对小胶质细胞的活化和损伤。     

重组鸡γ_干扰素在昆虫细胞中的高效表达

将鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)基因克隆到载体pFASTBAC1中,构建转移载体pFASTBAC1-ChIFN-γ,然后转化DH10Bac感受态大肠杆菌,通过位点特异性转座,将ChIFN-γ基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建表达质粒Bacmid-ChIFN-γ;通过脂质体将表达质粒转染Sf9昆虫细胞,用间接免疫荧光试验鉴定重组鸡γ-干扰素(rChIFN-γ)的表达;通过水泡性口炎病毒感染鸡胚成纤维细胞(CEF)的细胞病变抑制试验,检测rChIFN-γ的活性。研究结果表明,感染重组杆状病毒的Sf9细胞能高效表达rChIFN-γ,且当每个细胞的感染量为1个病毒时,细胞在感染96h后,rChIFN-γ基因表达产物的活性最高,达到106~107.2U/mL。以rChIFN-γ进行对新城疫病毒(NDV)F48E8株、禽流感H5N1病毒(AIV-H5)和马立克氏病病毒(MDV)GA株的抗病毒活性试验,发现rChIFN-γ对AIV-H5和MDV GA株病毒有明显的抑制其致细胞病变作用,但对NDVF48E8株病毒在体外不能抑制其致细胞病变作用,仅能在病毒滴度上表现抑制效果。     

新型结核病疫苗AEH/Al/IC在小鼠中的免疫原性研究

目的检测重组结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)融合蛋白Ag85B-ESAT6(Antigen 85 B,6-kDa early secretory antigenic target,AE)和热休克蛋白X(heat shock protein X,Hsp X)与氢氧化铝和聚肌胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid,poly I∶C)构建的新型结核病亚单位疫苗AEH/Al/IC在小鼠中的免疫原性。方法用疫苗(AEH/Al/IC)和佐剂(Al/Poly I∶C)分别免疫雌性BALB/c小鼠3剂次,每剂次间隔10 d。末次免疫后第10天,经ELISA检测小鼠血清中抗原特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a的抗体效价,经酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot,ELISPOT)检测小鼠脾细胞分泌抗原特异性IFN-γ和IL-2的细胞频数,经ELISA检测小鼠脾细胞抗原特异性IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌量。结果与佐剂组相比,疫苗组诱导小鼠产生了高水平的AE和Hsp X特异性抗体;疫苗组诱导小鼠产生的AE和Hsp X特异性IFN-γ和IL-2阳性脾淋巴细胞(斑点形成细胞spot forming cells,SFC)均高于佐剂组,差异有统计学意义(IFN-γ:P0.05; IL-2:P0.05);疫苗组小鼠脾细胞AE特异性IFN-γ、IL-2和TNF-α分泌量明显较佐剂组高,差异均有统计学意义(P0.05),Hsp X特异性IFN-γ和TNF-α分泌量比佐剂组稍高,但差异均无统计学意义(P0.05)。结论结核病亚单位疫苗AEH/Al/IC具有良好的免疫原性,有希望成为一种新型的结核病预防候选疫苗。     

结核分枝杆菌对巨噬细胞抗原呈递功能的抑制作用

本文旨在通过观察结核分枝杆菌刺激后巨噬细胞抗原呈递功能的变化, 探讨结核分枝杆菌的免疫逃逸机制。在体外, 结核分枝杆菌刺激巨噬细胞24 h 后, 用流式细胞仪检测γ干扰素( IFN-γ) 诱导的主要组织相容性复合物( MHC) Ⅱ类分子、CD86 和CD80 的表达变化; 酶联免疫吸附试验( ELISA) 检测巨噬细胞的抗原呈递功能; 反转录-聚合酶链反应检测巨噬细胞CⅡTA 及其启动子PⅠ、PⅢ和PⅣ的mRNA 水平。结果发现, 结核分枝杆菌抑制IFN-γ诱导的巨噬细胞表面MHCⅡ 类分子和CD86 的表达, 且呈剂量依赖性, 但CD80的表达变化不明显; 抗原呈递功能明显降低; 结核分枝杆菌刺激后巨细胞CⅡTA 及其启动子PⅠ、PⅢ和PⅣ的mRNA 水平显著降低。提示结核分枝杆菌可能通过降低CⅡTA 及其启动子PⅠ、PⅢ和PⅣ 的mRNA 水平, 抑制IFN-γ诱导的巨噬细胞MHCⅡ类分子的表达; 结核分枝杆菌可降低巨噬细胞CD86 的表达, 抑制IFN-γ诱导的巨噬细胞抗原呈递功能。     

北极狐γ-干扰素cDNA的克隆、表达及活性测定

为研究狐γ-干扰素的生物学活性,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从北极狐外周血淋巴细胞中扩增出γ-干扰素(VuIFN-γ)cDNA.序列分析表明VuIFN-γcDNA全长501 bp,编码23个氨基酸的信号肽和144个氨基酸的成熟肽蛋白,与已发表的银黑狐和犬IFN-γ核苷酸序列同源性为99.8%和99.4%;氨基酸同源性均为100%.应用原核表达系统高效表达北极狐γ-干扰素成熟肽蛋白,SDS-PAGE和Western blotting分析表达的融合蛋白分子量约为19 kD,以不溶性的包涵体形式存在.重组蛋白经纯化和复性,在Vero和MDCK细胞上可明显抑制VSV病毒的复制,并测出北极狐重组γ-干扰素的活性单位分别为1.0×106 u/mg和1.56×105 u/mg,为进一步开发基因工程狐干扰素奠定基础.     

结核感染T细胞斑点试验在结核病诊断中的应用价值

目的:探讨并总结结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)在结核病诊断中的价值。方法 :回顾性分析了某医院的疑患结核病患者128例,通过收集大量患者的临床资料,并分别对患者采取T-SPOT.TB和结核菌素试验(TST)的试验方法,比较二者试验结果的差异性,总结其对结核病诊断的灵敏性和特异性。结果:根据试验结果可以总结出T-SPOT-TB试验的灵敏性和特异性要更优于TST试验(P0.05)。结论:T-SPOT-TB试验相比较于TST具有更高的灵敏性和特异性,更加适用于作为结核病的筛检试验,在结核病诊断中的具有更高的应用价值。