实时定量PCR发展概述

实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,简称qPCR)是一种通过荧光信号对PCR进程进行实时监测,并对未知模板进行定量分析的一种核酸定量技术,该技术在临床诊断和生命科学等多领域发挥着重要的作用。现就生物制品领域有着重要应用价值的中介探针聚合酶链反应(mediator probe polymerase chain reaction,MP PCR)和数字聚合酶链反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)新技术加以介绍,同时也对qPCR技术中的关键因素(如参考基因选择和核酸质量评价)以及qPCR最低限度标准(minimum information for the publication of real-time quantitative PCR,MIQE)指南作一概述。     

聚合酶链反应检测宫颈癌中HPV16E6／E7相关序列

本文报告了采用聚合酶链反应(即PCR技术)检测人宫颈癌中人乳头瘤病毒16型(HPV16)的E_6/E_7相关序列。在正链引物(SP)和反链引物(ASP)的诱导下,以二步温控法聚合酶链反应对34例人宫颈癌组织DNA进行检测,发现宫颈癌中HPV16E_6/E_7相关序列存在的阳性率达67.6％(23/34)。本研究结果提示:HPV16可能在宫颈癌的发生发展过程中起重要作用,采用PCR技术选择性地检测HPV16的转化基因(E_6、E_7)对深入探讨宫颈癌发生的机理、早期发现宫颈癌患者等有重要意义。     

检测低拷贝数HBV DNA含量的临床研究

目的:了解不同试剂在应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)以及巢式PCR方法在检测低拷贝数的HBV DNA量的差异与灵敏度。方法:用上海复星医学科技发展有限公司(A方法)检测出了68例HBV DNA结果为5.1×101-1.0×103拷贝数/亳升的低拷贝数标本。然后,三家不同公司的试剂(方法 B、方法 C、方法 D)对这些样本进行复核。另外,巢式聚合酶链反应PCR法检测此68例标本。随访巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA的病人。结果:用四种方法(A、B、C、D)检测的68个样本的HBV DNA拷贝数结果如下:无拷贝(0,9,12,4);101-102(21,17,18,22);102-103(47,36,28,35),大于103(0,6,10,7)。同时,用巢式聚合酶链反应检测此68例标本,有55例检测为阳性,有13为阴性结果。巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA含量的病人,随访发现此10病人有8例均在1~3月后出现HBV DNA的反跳,并伴肝功能的不正常,其HBV DNA的含量均在104拷贝数/毫升以上。结论:目前所用的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)的方法和试剂对低拷贝数HBV DNA存在不稳定性和不确定性。巢式PCR法对低拷贝数HBV DNA的检测灵敏度要远高于实时荧光定量PCR法。该研究提示测对抗病毒治疗过程中患者进行低拷贝数HBV DNA的检将提供有效的药物评价和预后信息。     

利用早孕绒毛组织和PCR技术检测先天性人巨细胞病毒感染

人的巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)已成为引起宫内感染的重要原因。在新生儿中先天性HCMV的感染率为0.2-2.2％。为了建立一种可行的先天性HCMV感染产前诊断技术,我们利用早孕绒毛组织和聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术对孕早期的先天性HCMV感染进行了研究。现简报如下:     

检测低拷贝数HBVDNA含量的临床研究

目的:了解不同试剂在应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)以及巢式PCR方法在检测低拷贝数的HBV DNA量的差异与灵敏度.方法:用上海复星医学科技发展有限公司(A方法)检测出了68例HBV DNA结果为5.1× 101-1.0× 103拷贝数/毫升的低拷贝数标本.然后,三家不同公司的试剂(方法B、方法C、方法D)对这些样本进行复核.另外,巢式聚合酶链反应PCR法检测此68例标本.随访巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA的病人.结果:用四种方法(A、B、C、D)检测的68个样本的HBV DNA拷贝数结果如下:无拷贝(0,9,12,4);101-102 (21,17,18,22);102-103(47,36,28,35),大于103(0,6,10,7).同时,用巢式聚合酶链反应检测此68例标本,有55例检测为阳性,有13为阴性结果.巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA含量的病人,随访发现此10病人有8例均在1～3月后出现HBV DNA的反跳,并伴肝功能的不正常,其HBV DNA的含量均在104拷贝数/毫升以上.结论:目前所用的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)的方法和试剂对低拷贝数HBV DNA存在不稳定性和不确定性.巢式PCR法对低拷贝数HBV DNA的检测灵敏度要远高于实时荧光定量PCR法.该研究提示测对抗病毒治疗过程中患者进行低拷贝数HBV DNA的检将提供有效的药物评价和预后信息.     

慢性阴道炎患者生殖道解脲脲原体和沙眼衣原体感染分析

目的通过荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测慢性阴道炎患者阴道内解脲脲原体(Uu)和沙眼衣原体(Ct)感染状况,用以指导临床正确治疗。方法应用荧光定量聚合酶链反应对380例慢性阴道炎患者的阴道分泌物进行解脲脲原体和沙眼衣原体PCR检测。结果解脲脲原体阳性率为42.9%,其阳性标本的平均拷贝数为3.4×105copies/ml,沙眼衣原体阳性率为16.6%,其阳性标本的平均拷贝数为5.8×104copies/ml,解脲脲原体和沙眼衣原体合并感染的阳性率为12.6%。结论PCR技术具有简便、快捷、准确的优点,是目前快速诊断慢性阴道炎患者Uu、Ct感染状况的可靠诊断方法之一。     

浙江省献血员HGV和TTV感染情况的调查

应用逆转录套式聚合酶链反应(RT-Nested PCR)和半套式聚合酶链反应(Semi-nested PCR)分别检测来自浙江省3个地区165例献血员血清标本中的庚型肝炎病毒(HGV)RNA和输血传播性病毒(TTV)DNA.14.6%(24/165)和12.7%(21/165)的血清标本分别检出HGV RNA和TTV DNA,其中3.6%的血清标本(6/165)可同时检出HGV RNA和TTV DNA.实验结果表明,浙江省献血员中HGV和TTV的感染率较高.     

Perkin Elmer庆祝PCR发明十周年

Perkin-Elmer Corporation于1994年9月12～14日在Cold Spring Harbor实验室召开了题为“庆祝PCR发明十周年”的会议,以此纪念聚合酶链反应(PCR)应用的头十年。会议议程包括回顾PCR技术的历史并展示这项技术在目前及今后的应用前景。会议开始时由Jim Watson致词并由PCR方     

mpt64-卡介苗重组疫苗的构建、免疫原性及抗结核作用

通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原MPT64的编码基因与穿梭质粒载体pYUB295重组,采用电穿孔技术将重组质粒导入到卡介苗中,应用聚合酶链反应(PCR)扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对mpt64-卡介苗重组疫苗鉴定:成功地构建了MPT64基因pYUB295重组质粒,MPT64蛋白在卡介苗中能分泌表达....     

1109型微电脑自动基因扩增仪

当前,采用分子生物学最新技术——聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)可在生物体外,靠Taq DNA聚合酶的作用,于较短的时间内将目的基因不失真地扩增几十万倍到一百万倍。从而使分析鉴定某些基因片段序列的工作省略了许多复杂的步骤。 应用PCR技术对目的基因进行扩增时,原始的方法是把盛有反应液的样品管用手工在热     

利用拆分绿色荧光蛋白检测端粒酶TERT亚基与端粒末端蛋白TPP1的相互作用

目的:构建pCDH-Flag-NGFP-TERT、pCDH-Myc-TPP1-CGFP基因的真核表达载体,验证TPP1-CGFP蛋白能募集到端粒区,并通过GFP蛋白自发重建检测TERT与TPP1的相互作用.方法:以相应质粒为模板,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增出N...     

聚合酶链反应在研究DNA多态性中的应用

聚合酶链反应(Polymerase chain reaction PCR)是一种体外DNA扩增技术,自1985年Saiki等首次报道PCR方法以来,PCR技术迅速发展,并已广泛应用于生命科学各个方面。如基因克隆、遗传病的诊断、传染病的诊断、癌基因的检测等,由于PCR技术特异性强,扩增效率高、快速、录敏,且能克服限制性片段长度多态性(RFLP)的局限性,因此,它被有效地应用于研究DNA多态性。     

有关聚合酶链反应的若干问题

聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR),又称体外基因扩增方法,是80年代中期由mullis发明的一种新的分子生物学技术。     

长模板聚合酶链反应技术在病毒学研究中的应用

长模板聚合酶链反应(PCR)技术是一种可扩增几个kb甚至几十个kb基因片段的PCR新技术,已被用于病毒全长基因,感染性克隆的构建,转录体的制备,病毒基因变异、分型的分析和病毒基因功能组学的研究等方面.     

特异性DNA倍增技术(PCR)及其应用

特异性DNA倍增技术(PCR)是近年来发展的一种新技术,具有快速、简便、灵敏、特异性高和重复性好等优点,尤其适合于临床分子生物学检测。PCR技术包括三个循环过程:(1)模板DNA的变性,(2)模板DNA-引物的复性,(3)DNA聚合酶作用下的引物链的延伸。本文对耐高温Taq DNA聚合酶、PCR的反应体系、PCR产物特异性的影响因素和PCR技术的应用等几个方面进行了综述。     

聚合酶链反应(PCR)用于丙肝病毒的检测研究

丙型肝炎是一种严重危害人们健康的传染性疾病之,如何提高其确诊率是近年来流行病学及基础医学研究的热门课题,本文就聚合酶链反应(PCR)技术应用于丙型肝炎研究方面的进展作一综述。     

过氧化氢酶基因定向进化文库的构建及其评价

采用易错聚合酶链反应和DNA改组技术构建野生型梅花鹿过氧化氢酶(CAT)基因的突变体文库,并随机对两种方法所得产物各5个样品做序列测定。序列分析结果表明突变率分别为0.329%和27.58%,易错聚合酶链反应体系的错配率可以比普通PCR体系提高约10倍,DNA改组的突变率则更高,但是难以避免由于突变率太高造成的目的基因无法正确翻译这一情况。另外,应用邻接法(neighbor-joining, NJ)对随机选择的过氧化氢酶基因突变体序列和野生型序列做核酸和蛋白质序列的NJ进化树,进化关系与突变率分析基本一致。     

聚合酶链反应在环境中的应用——PCR反应用来监测环境中的微生物

目前,聚合酶链反应(PCR)的应用越来越广泛,在环境监测中利用PCR来检查土壤,沉积物和水中含有的致病微生物,由于这一反应的灵敏性和特异性,一些研究人员也用PCR来 研究微生物生态的基本问题。     

聚合酶链反应用于微生物感染诊断中诸问题的探讨

聚合酶链反应(PCR)在微生物检验和传染病的实验诊断中是一种应用广泛的实验方法,但是在其应用过程中也存在一些问题.本文中阐述了PCR在应用中的问题,如假阳性和假阴性反应、标本的获取和制备、抗生素药敏试验和耐药性、特异性PCR检测、广范围PCR等,并提出一些PCR技术的新进展和有待解决的问题.     

聚合酶链反应实验课的教学

聚合酶链反应(PCR)是近年发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术,该法操作简便快速,并且非常有效,可在很短的时间内得到数百万个特异DNA序列的拷贝.