SEM病毒中国株流行病学研究及克隆和序列分析

为了解SEN病毒中国株的流行病学及基因序列,采集肝炎患者（甲－戊型）、非甲－非戊型肝炎患者、ALT升高的婴幼儿、尿毒症患者、静脉毒瘾者和健康体检人群的血清标本,用巢式PCR检测SEN病毒,结果他们的检出率依次为13．3％、20．5％、4．8％、5．8％、5．7％和0。PCR获得了两 不同长度阳性片段。选取5份阳性PCR产物进行纯化、连接及转化,获取重组克隆,命名为pGCEM-SENVL(1、2、3）、pGEM-SENVS(1、2）,进行DNA序列分析。结果与SEN病毒（AX025667）序列同源性分别为87．7％、76．1％、88．2％、72．7％和78．8％。首次发现我国存在SEN病毒散发感染,并存在不同于SEN病毒（AX025667）的中国变异株,而且有同一患者存在两种变异株的复合感染。     

SEN病毒D亚型中国分离株基因克隆及序列分析

According to the published nucleotide sequence of SEN virus genome,specific primers were designed and synthesizedFrom the serum of a Chinese patient with non-A-E hepatitis,two long fragments(totally 3175bp) spanning the complete coding region of SENV-D variant gene were amplified by semi-nested PCRThe amplified fragments were cloned and sequencedThe nucleotide sequence homology of this Chinese strain with SENV-D(AX025730),SENV-D(AB059352) and TTV(AB028668) were 90%,88% and 91% respectivelyThe protein encoded by ORF1 has two putative conserved sequence motifs relating to the replication of the virus and,besides,a conserved ATP/GTP-binding motif and several highly conserved protein kinase phosphorylation sites     

兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的克隆和序列分析

应用RT—PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84中成功扩增出预期大小为1．7kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEM^R—T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆,序列分析表明扩增的中国株BHD衣壳蛋白基因片段长度为1740bp,共编码580个氨基酸。该核酸序列与其它国家报道的多株BHDV序列相互间同源性高达98．2％一99．0％,其推导的氨基酸序列同源性也达98．3％--99．1％,为极度保守片段。     

鸡传染性支气管炎病毒变异株全基因组序列分析

为了明确传染性性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)分离株CK/CH/SD09/005的分子特征,以进一步丰富国内IBV的分子流行病学信息。本研究设计了25对引物对其全基因组进行了序列测定,并与参考株进行了同源性比较和S1基因遗传进化分析。结果显示CK/CH/SD09/005基因组为27 691bp(不包括5′端Cap和3′端Poly A)。全基因组同源性比对发现,CK/CH/SD09/005仅与GenBank中广西2009年分离株GX-NN09032各基因高度同源(97%~99%)。除GX-NN09032外,CK/CH/SD09/005基因组5′端复制酶基因(Gene 1)和3′端非转录区(Untranslated region,UTR)与2个QX基因型参考株ck/CH/LDL/091022和SDIB821/2012同源性最高,分别为97%和98%,但是3′端结构蛋白和非结构蛋白基因(S-3a-3b-3c/E-M-5a-5b-N)与这两个毒株同源性较低,仅为72%~90%。其ORF3c/E、5a、5b和N分别与韩国分离株1011、国内分离株CK/CH/LXJ/02I、DK/CH/HN/ZZ2004和YX10同源性最高,分别为97%、96%、99%和96%,而其ORF3a、3b和M与参考株同源性均低于90%。S1基因遗传进化分析发现,CK/CH/SD09/005和国内外39个参考株形成7个进化分支(基因型),CK/CH/SD09/005和2007以来几个分离株属于基因Ⅳ型,与其它6个基因型参考株S1和S2基因同源性为66%~69%和72%~81%,S1基因不仅表现广泛性点突变,而且有多处碱基插入和缺失,S2仅表现点突变。本研究结果表明CK/CH/SD09/005是一个变异株,可能是QX基因型IBV流行株与其它毒株重组进化而来,此外还涉及基因突变、插入和缺失等多种变异机制。     

山羊关节炎脑炎病毒甘肃株全基因组克隆和序列分析

根据GenBank中发表的山羊关节炎脑炎病毒CAEV-CO株（caprine arthritis encephalitis virus-CO,CAEV-CO）的全基因组序列（序列号：NC-001463）,设计合成了7对引物,对CAEV甘肃株的全基因组进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果表明,CAEV-甘肃株基因组全长为9186nt。与国际标准毒株CAEV—CO株相比,在编码区有12个碱基的缺失,二者的核苷酸同源性为91．0％;在非编码区有27个核苷酸的插人,核苷酸同源性为97．0％。gag、pol、蛋白Q、tat、env基因编码的氨基酸同源性分别为94．6％、94．7％、87．9％、94．7％和91．5％。     

犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析

从我国内蒙古地区流行的犬细小病毒病病犬的肠溶物中分离提纯犬细小病毒（ＣＰＶ）。提取病毒基因组ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,采用人工合成的引物进行ＰＣＲ扩增,ＰＣＲ产物经ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ双酶切后,克隆于ｐＵＣ１９质粒的ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ位点。重组质粒ｐＵＣＶＰ２经ＰＣＲ鉴定、限制酶切分析和序列分析,结果表明：获得了犬细小病毒内蒙株（ＣＰＶ－ＩＭ）ＶＰ２基因的全长克隆,ＶＰ２基因全长１７５５ｎｔ,     

猪圆环病毒2型分离毒株全基因组的克隆及序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV－2）基因序列,设计两对特异性引物,用PCR方法从接种疑似PMWS仔猪病料的细胞中分段扩增2个分离毒株全基因组。将扩增片段克隆入pGEM-T easy载体,筛选获得含有相应片段的阳性重组质粒。对质粒中的插入片段进行测序拼接,获得2株均为1768bp的全基因组序列。应用DNA star序列分析软件,对所测PCV－2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行同源性比较,并绘制系统发生树,结果发现：所测两毒株之间的核苷酸序列同源性极高,可达99．8％,亲缘关系密切;与PCV－2参考毒株的同源性介于95．3％－99．7％之间,其中与美国的一株PCV－2同源性最高,分别为99．5％和99．7％,亲缘关系很近;与国内两分离株同源性分别为96．4％和98．8％－98．9％;与PCV－1参考毒株同源性仅为77．1％－77．5％。     

伪狂犬病病毒湖北株糖蛋白gD基因的克隆及序列测定

According to the sequence of gD gene of PRV Rice strain, the primers of 22bp were designed.Using PRV genomic DNA of Hubei and Shuangcheng virus strains which infected BHK 21 cell separately as template, the gD gene of PRV was amplified sucessfully by PCR and cloned into pGEM T vector. Restriction enzyme analysis showed that the cloned gD gene at SmaⅠ,SalⅠ,KpnⅠ,PvuⅡ sites was the same as that of PRV Rice strain. The gD gene consisted of 1,263 nucleotides including an open reading frame spanning 1,197 nucleotieds which could encode a protein of 398 amino acids. The ORF didn′t include an amino acid sequence directing N linked glycosylation (NXT or NXS). Comparison of our complete Hubei strain gD gene sequence with the Rice strain gD gene sequence showed that the nucleotide and deduced amino acid homology were about 97% and there was an 12 basepair deletion in 835 846 nucleotide sites that coded Arg Pro Arg Pro. A region of the amino acid sequence and the positions of the cysteine residues of PRV HB gD were homologous to HSV I glycoprotein D. This work laid foundation for PRV gene immunization and studying PRV sub unit vaccine.     

蓝舌病病毒Z1株VP7基因的克隆及序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ扩增我国蓝舌病毒Ｚ１株的ＶＰ７基因,直接将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体中,用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ分析经蓝／白斑筛选和ＰＣＲ鉴定的重组质粒,用ＤＩＧ标记克隆片段制成探针与病毒基因组进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交,证明插入片段为ＢＴＶ ＶＰ７基因特异性片段。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列,将这一序列与国外已发表的９株蓝舌病毒及相关的环状病毒的ＶＰ７基因进行了比     

香蕉束顶病毒基因克隆和序列分析

对香蕉束顶病毒（ＢＢＴＶ）中国分离株ＤＮＡ组份Ｉ（ＤＮＡ－１）、外壳蛋白（ＣＰ）和运转蛋白（ＭＰ）基因进行了克隆和序列分析。ＢＢＴＶＤＮＡ－１含有１１０３个核苷酸,与南太平洋和亚洲分离株分别有８７％－８８％ ９６．９－９８％的核苷酸序列同源性。由ＤＮＡ－１编码的复制酶含有１８６个在酸残基。与南太平洋和亚洲分离株分别有８４．４％－９５．８％和９７．６％、９８．０％的氨基酸序列同源性。外壳蛋白基因由５     

中国猪瘟兔化弱毒兔脾毒NS2-3基因的序列分析

根据已发表的猪瘟病毒序列,设计并合成了覆盖有ＮＳ２－３全基因的４上物,应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从接种了猪瘟兔化弱毒（ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒａ ｖｉｒｕｓ ｌａｐｉｎｉｚｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｓｔｒａｉｎ,ＨＣＬＶ）的兔脾组织中,成功地扩增了ＮＳ２－３基因,将其克隆到Ｔ载体后,测定了其核苷酸序列。结果显示,所克隆的ＮＳ２－３基因长２９６４个核苷酸,编码９８８年氨基酸。用ＤＮＡＳＩＳ和ＰＲＯＳＩＳ软件分析表     

中国19个狂犬病病毒街毒分离株N基因的序列分析

测定了30年来从不同动物中分离的19个中国狂犬病病毒街毒株N基因的部分核酸序列,并对其核苷酸差异做了比较分析.可将中国狂犬病病毒街毒株分为4个组群,各组间的同源性为83.45%～88.62%.除广西地区分离的狂犬病病毒街毒株彼此差异较大外,其余街毒株的地理分布与其N基因核酸序列差异的距离是密切相关的,基本上可按其地理分布分为东、西二大组.     

传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株(SD/97/02)S2蛋白基因的序列测定和分析

根据GenBank上发表的IBV S2基因序列,自行设计了两对引物,分别扩增SD／97／02株S2基因的上游1100bp部分和下游的900bp部分,两段序列拼接后包含了S2全基因的序列。将此两段分别克隆入pGEM T-easy载体,测序后将序列用分析软件DNASTAR和网上的BLAST软件进行分析,结果表明,S2基因比S1基因相对来说更保守,位于氨基酸第560－600位很有是与囊膜锚着的部位,而S2与S1的交界处以HRRRR为特征,这不同地常规的RRF／SRR。     

从我国分离的3株蛙虹彩病毒与FV3主要衣壳蛋白基因同源性的比较

近年来,由虹彩病毒引起的爬行动物、两栖动物和鱼类疾病已在美洲、欧洲、亚洲和澳洲等地普遍流行[1].虹彩病毒科(Iridoviridae)成员是直径大小为120nm～300nm的球形病毒,其基因为单分子线状双链DNA[2].形态学和血清学研究已初步揭示蛙虹彩病毒属(Ranavirus)有某种程度的相似性[1].分布于世界各地的虹彩病毒是否都具有基因同源性?同源性有多大?为了回答上述问题,Mao等首先对蛙虹彩病毒的代表株,即早年从美国分离到的Frog virus3(FV3)进行了分子生物学研究,克隆并测出了主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因的序列,由此建立了水生动物虹彩病毒比较分子生物学方法[3,4].     

4株鸡马立克氏病病毒国内分离株Meq基因的克隆与序列分析

根据鸡马立克氏病病毒(MDV)GA株Meq基因序列,设计并合成一对用于扩增Meq基因的引物,利用这对引物通过PCR方法分别扩增4株东北地区分离的强毒株、国内标准强毒株J-1株、国内疫苗株814株的Meq基因片段,进行克隆测序,对4株MDV分离毒株Meq基因与国内传统毒株Meq基因及GenBank上收录的国内外9株毒株Meq基因序列进行比较分析.序列比较显示,不同的MDV株的Meq基因序列相对比较保守,它们相互间氨基酸序列的同源性在96.5%～99.7%之间.4株MDV分离毒株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变;3株分离毒株Meq基因上相同位置均存在两个定点突变,这两处点突变是国内近几年分离株所特有的,国外已发表的MDV毒株Meq序列中不存在这种变化.分离株Meq基因的这些突变和毒株毒力的关系具有一定的规律性,但是这些规律性还有待进一步研究.     

从我国分离的3株蛙虹彩病毒与蛙病毒3型主要衣壳蛋白基因同源性的比较

Since 1995,three viral isolates named RGV9506,RGV9807 and RGV9808 associated with frog mortality were isolated from farm-raised frogs (Rana grylio virus,RGV) in China.Both ultrastructural morphology and serological characterisitics had shown that the RGV isolates belong to genus Ranavirus. The DNA sequence analysis of the 5′end of the major capsid protein(MCP) gene of RGV isolates by PCR amplification produced a 531bp fragment.DNA templates were prepared from cells infected with different RGV isolates and the specific primers designed were based on highly conserved region at the 5′ of the gene encoding Frog virus 3(FV3) MCP, which is the typical species of the genus Ranavirus.The PCR products indicate that the nucleotide sequence of MCP gene of the RGV9506,RGV9807 and RGV9808 showed 99.6%, 99.8% and 98.4% homology respectively with the corresponding region of the MCP gene of FV3.     

Molecular Detection and Characterization of Chinese Yam Mild Mosaic Virus Isolates

An improved RT‐PCR was developed and validated for the detection of Yam mild mosaic virus (YMMV). Sequences of the coat protein core region of 19 Chinese isolates were obtained, and analysis indicated the presence of different genetic variants. Phylogenetic analyses showed that the Chinese isolates were divided into two distinct clusters. Complete genomic sequences of two distinct Chinese variants were determined to be 9527 and 9529 nucleotides long, excluding the 3′ poly (A) tail. Their genomic structure and organization were virtually identical to that of a Brazilian isolate. The two variants shared identity of 87.3% to one another and 83.9–84.6% to the Brazilian variant at the genomic sequence level. Phylogenetic analyses supported that they represented two distinct YMMV lineages.     

鸡传染性支气管炎病毒变异株的分离及其S1基因序列分析

本实验对山东省泰安地区某蛋鸡场产蛋下降鸡群发生的临床症状疑似鸡传染性支气管炎病例,无菌采集气管、肺脏、肾脏等组织,接种SPF鸡胚,经病毒形态观察、血凝特性试验、动物回归试验等证实,我们鉴定到一株鸡传染性支气管炎病毒(IBV);病毒中和试验表明,该病毒为一株变异毒株,使用国外针对IBV793/B血清型发表的血清型特异性引物经RTPCR方法获得了该毒株的免疫原基因S1基因,初步确定该传染性支气管炎病毒变异毒株为793/B血清型。     

大蒜花叶病毒外壳蛋白基因cDNA的克隆和序列分析

我们从自然发病的大蒜中分离得到了大蒜花叶病毒。以其基因组ＲＮＡ为模板合成了３＇末端部分ｃＤＮＡ。从中选出一批插入片段在２．０ｋｂ以上的重组克隆,经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ点杂交分析证实了所选克隆与基因组ＲＮＡ同源。通过对若干个克隆的插入片段两端部分序列的测定,选出一个克隆ｐＧＭ４９５,其插入片段的长度约为２．４ｋｂ,３′末端存有一个Ｐｏｌｙ（Ａ）结构,它应包含了编码该病毒外壳蛋白全部序列。序列测定的结果表明,这个ｃＤＮＡ片段全长为２３７９ｂｐ,其中含有与酶切图谱分析结果相符的ＥｅｏＲＩ、ＰｓｔＩ及ＢａｍＨＩ酶切位点。第一个终止密码子ＴＡＡ与３′ｇ末端相距２６４ｂｐ,我们根据碱基序列推定的氨基酸序列与其它已发表的Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ的外壳蛋白氨基酸序列以及外壳蛋白翻译后加工的蛋白酶专一切点相比较后推测,编码该病毒外壳蛋白序列可能起始于３′末端上游的１１７０ｂｐ处,共编码３０２个氨基酸,其分子量为３６ｋＤ,略大于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ所测定的３３ｋＤ,非编码区域长２６４ｂｐ,富含ＡＴ,并有多个终止密码子的存在。趾３′末端３２～２７ｂｐ处有一个ＡＡＴＡＡ序列。