马克斯克鲁维酵母的木糖和阿拉伯糖发酵

马克斯克鲁维酵母作为非常规酵母在燃料乙醇发酵中受到人们越来越多的关注。马克斯克鲁维具有天然的发酵戊糖的能力,但不同菌株的发酵能力存在较大差异。本研究比较了3株马克斯克鲁维菌株Kluyveromyces marxianus 9009/1911/1727(K.m 9009/1911/1727)在不同温度下的木糖和阿拉伯糖的发酵性能差异,结果发现不同发酵温度下,3株菌在耗糖速率、糖醇产率均表现出了显著的差异。菌株K.m 9009和K.m 1727在40℃下的发酵性能均优于30℃,这充分体现了马克斯克鲁维酵母的高温发酵优势。针对发酵差异,采用PCR方法获得3个不同菌株的戊糖代谢途径中的5种关键代谢酶(XR、XDH、XK、AR和LAD)的基因序列,并利用Clustalx 2.1进行了序列比对。结果显示3株菌的相关基因与文献中报道的1株克鲁维酵母的相应关键酶氨基酸编码序列相似性达98%以上,并且差异的氨基酸不在酶的关键位点处。在此基础上,通过Real-time实验,对木糖发酵差异最为明显的K.m 1727和K.m 1911的木糖代谢过程4个关键酶(XR、XDH、XK和ADH)的基因表达量进行测定,其结果显示对于耐热菌株K.m 1727,XDH和XK基因表达量低是导致木糖代谢过程中木糖醇积累、乙醇产量低的主要原因。最后,将所测得的马克斯克鲁维酵母的戊糖代谢关键酶序列与其他不同种属相比对,确定了其木糖和阿拉伯糖代谢途径,为进一步利用代谢工程方法提高戊糖发酵性能奠定了基础。     

可同化阿拉伯糖的木糖还原酿酒酵母菌株构建

[目的] 以秸秆等木质纤维素类生物质为原料生产液体生物燃料乙醇,目前生产成本高,大规模工业化生产尚有较大难度。构建能同化阿拉伯糖进行木糖还原生产木糖醇的重组酿酒酵母菌株,以实现原料中全糖利用、生产高附加值产品,实现产品多元化。[方法] 首先,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术依次向出发菌株中导入阿拉伯糖代谢途径和木糖还原酶基因,使菌株获得代谢阿拉伯糖和将木糖转化为木糖醇的能力;其次,通过适应性驯化的进化工程手段,提高重组菌株对阿拉伯糖的利用效率;最后,通过混合糖发酵验证重组菌株利用阿拉伯糖和还原木糖产木糖醇的能力。[结果] 通过导入植物乳杆菌的阿拉伯糖代谢途径,酿酒酵母菌株获得了较好的利用阿拉伯糖生长繁殖的能力;进一步导入假丝酵母的木糖还原酶基因后,重组菌株在葡萄糖作为辅助碳源条件下可高效还原木糖产木糖醇,但阿拉伯糖的利用能力下降。利用以阿拉伯糖为唯一碳源的培养基进行反复批次驯化,阿拉伯糖的利用能力得以恢复和提升,得到表型较好的重组菌株KAX3-2。该菌株在木糖（50 g/L）和阿拉伯糖（20 g/L）混合糖发酵条件下发酵72 h时,对阿拉伯糖和木糖利用率分别达到42.1%和65.9%,木糖醇的收率为64%。[结论] 本研究成功构建了一株能有效利用阿拉伯糖并能将木糖转化为木糖醇的重组酿酒酵母菌株KAX3-2,为后续构建、获得阿拉伯糖代谢能力更强、木糖醇积累效率更高菌株的工作奠定了基础。     

一步法发酵菊芋生产乙醇

利用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)YX01具有菊粉酶生产能力且乙醇发酵性能良好的特点,直接发酵菊粉生成乙醇.在摇瓶中考察了该菌株最适发酵温度,进而在2.5L发酵罐中考察了通气量和底物浓度的影响.实验结果表明:该菌株最适发酵温度为35℃;在通气量为50 mL/min和100 mL/min时菌体生长加快,发酵时间缩短,但在不通气条件下糖醇转化率明显提高;在菊粉浓度235 g/L时,发酵终点乙醇浓度达到92.2 g/L,乙醇对糖的得率为0.436,为理论值的85.5%.在此基础上,使用近海滩涂种植海水灌溉收获的菊芋为底物,以批式补料方式直接发酵菊芋干粉浓度为280 g/L的底物,发酵终点乙醇浓度为84.0 g/L,乙醇对糖的得率为0.405,为理论值的80.0%.这些研究工作,为以菊芋为原料的燃料乙醇技术开发奠定了基础.     

菊粉酶基因在酿酒酵母中的表达及乙醇发酵

以乙醇耐受力较强的酿酒酵母为受体菌,构建了能够分泌菊粉酶的基因工程菌并进行了菊芋粉的生料发酵。首先,以马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus中的基因组DNA为模板,PCR扩增菊粉酶编码基因inu,分别使用菊粉酶自身启动子和酵母磷酸甘油激酶 (Phosphoglycerate kinase,pgk) 启动子,构建重组表达质粒HO/p-inu和HO/pgk-inu。经NotⅠ线性化后,采用电击法转化酿酒酵母工业菌株Saccharomyces cerevisiae 6525,分别得到含菊     

混合糖发酵重组酿酒酵母的菌株构建和菊芋秸秆同步糖化发酵研究

【目的】构建可用于纤维素乙醇高效生产的混合糖发酵重组酿酒酵母菌株,并利用菊芋秸秆为原料进行乙醇发酵。【方法】筛选在木糖中生长较好的酿酒酵母YB-2625作为宿主菌,构建木糖共代谢菌株YB-2625 CCX。进一步通过r DNA位点多拷贝整合的方式,以YB-2625 CCX为出发菌株构建木糖脱氢酶过表达菌株,并筛选得到优势菌株YB-73。采用同步糖化发酵策略研究YB-73的菊芋秸秆发酵性能。【结果】YB-73菌株以90 g/L葡萄糖和30 g/L木糖为碳源进行混合糖发酵,乙醇产量比出发菌株YB-2625 CCX提高了13.9%,副产物木糖醇产率由0.89 g/g降低至0.31 g/g,下降了64.6%。利用重组菌YB-73对菊芋秸秆进行同步糖化发酵,48 h最高乙醇浓度达到6.10%(体积比)。【结论】通过转入木糖代谢途径以及r DNA位点多拷贝整合过表达木糖脱氢酶基因可有效提高菌株木糖发酵性能,并用于菊芋秸秆的纤维素乙醇生产。这是首次报道利用重组酿酒酵母进行菊芋秸秆原料的纤维素乙醇发酵。     

酿酒酵母 L-阿拉伯糖转化乙醇代谢工程的研究进展简

L-阿拉伯糖是木质纤维素原料中一种重要的五碳糖组分,但传统的乙醇生产菌株酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）不能利用L 阿拉伯糖。通过代谢途径工程手段,在酿酒酵母中引入L 阿拉伯糖初始代谢途径可以获得能利用L 阿拉伯糖乙醇发酵的重组菌株。并且,通过代谢途径的疏通以及吸收系统的优化可以强化重组菌株代谢L 阿拉伯糖的能力。笔者从以上角度综述了近年来酿酒酵母转化L 阿拉伯糖生产乙醇的研究进展。     

纤维素降解产物对Kluyveromyces marxianus 1727共发酵葡萄糖和木糖的影响

研究纤维素酸水解产生的4种副产物乙酸、甲酸、糠醛、5-羟甲基糠醛及发酵产物乙醇对Kluyveromyces marxianus 1727共发酵葡萄糖和木糖的影响。结果表明:5.0 g/L乙酸和1.0 g/L甲酸对葡萄糖和木糖共发酵具有明显的抑制作用;1.0 g/L糠醛和5-羟甲基糠醛基本不影响K.marxianus 1727发酵葡萄糖,且能够被K.marxianus1727转化为毒性相对较低的物质。由于5-羟甲基糠醛的转化速率慢,对K.marxianus 1727发酵木糖的抑制程度大于糠醛。乙醇对K.marxianus 1727发酵木糖具有抑制作用,当乙醇质量浓度大于20 g/L时,生物量及木糖利用率约是对照的44%和70%。     

spt15突变基因对酿酒酵母木糖利用的影响

利用基因工程手段得到重组菌YPH499-3中的spt15有效突变基因,通过表达载体pYX212转化入酿酒酵母原始菌株YPH499中,重新获得酿酒酵母重组菌株。对其性状进行研究,结果表明该菌株能有效利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖。在30oC、200r/min,发酵72h时,50g/L木糖的利用率为82.0%,乙醇产率为28.4%;当木糖和葡萄糖以质量比1:1混合发酵时,木糖和葡萄糖的利用率分别为80.4%和100%,乙醇产率为31.4%;同时发现木糖醇的含量极低。从而验证了有效突变基因spt15-10对酿酒酵母共发酵木糖和葡萄糖产酒精的影响。     

gTME构建共发酵木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母

利用全转录工程（gTME）方法将全局转录因子spt15随机突变并克隆表达, 构建突变库。将突变基因连接到表达载体 pYX212上, 醋酸锂法转化入不利用木糖的酿酒酵母YPH499中, 经特定的培养基初筛获得高效利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌株。对获得的重组菌株进行了初步研究, 该菌株能够很好的利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖。在30oC, 200 r/min, 发酵96 h时, 50 g/L木糖和葡萄糖的利用率为94.0%和98.9%, 乙醇产率为32.4%和31.6%, 原始菌株乙醇产率为44.3%; 当木糖和葡萄糖以质量比1:1混合发酵时, 木糖和葡萄糖利用率分别为91.7%和85.9%, 乙醇产率为26%。木糖醇的含量极低。     

代谢木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母的构建

为使酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YS58代谢木糖产乙醇,采用PCR方法克隆得到树干毕赤酵母（Pichia stipitis）木糖醇脱氢酶基因xy12,并将该基因和克隆得到的休哈塔假丝酵母（Candida shehatae）缺终止子的木糖还原酶基因xyl1一起连接到酵母表达载体pYES2的强启动子GAL下,得到融合表达载体pYES2-P12。通过醋酸锂转化的方法将pY-ES2-P12转入S.cerevisiae YS58中,得到S.cerevisiae YS58-12。利用所构建的重组酿酒酵母进行术糖发酵实验,结果表明该重组酵母能发酵木糖,使木糖利用率得到进一步提高,最高达到81．3％,而且能代谢木糖产生乙醇。     

利用不同启动子控制木糖代谢关键酶基因构建可共代谢葡萄糖木糖重组酿酒酵母

利用不同强度的启动子调控木糖代谢关键酶活性,构建稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母。以本实验室专利菌株Saccharomyces cerevisiae Y5为宿主菌,将树干毕赤酵母Pichia stipitis CBS6054的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2置于磷酸甘油酸激酶基因启动子(PGKp)控制下,酿酒酵母Y5内源的木酮糖激酶基因XKS1分别由己糖激酶基因启动子(HXK2p)及其内源启动子(XKS1p)控制。这3个基因连同各自表达元件导入宿主细胞中,打通其木糖上游代谢途径。酶活测定结果显示,HXK2p对木酮糖激酶表现出更强的启动效率。重组菌Y5-X3-1中木糖还原酶/木糖醇脱氢酶/木酮糖激酶(XR/XDH/XK)的酶活比值为1∶5∶4,其木糖消耗量是宿主菌的5倍,最高乙醇产量为24.35 g/L,达到理论值的73%。结果表明,通过调节XYL1、XYL2及XKS1启动子的强度,调控其表达水平,进而改变3种酶的活性水平,对于提高重组酿酒酵母利用木糖发酵产乙醇有明显效果。     

马克斯克鲁维酵母GX-UN120糖转运蛋白基因的克隆及表征

【背景】马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)具有完整的木糖代谢途径,可以高效利用木质纤维素中的木糖,因此对其糖转运蛋白基因的研究或可有效解决酵母木糖转运的相关问题。【目的】根据马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042中KLMA＿70145和KLMA＿80101基因位点的功能预测,获得马克斯克鲁维酵母GX-UN120相应的糖转运蛋白基因序列并探究其功能。【方法】将转运蛋白基因分别克隆表达至酿酒酵母EBY.VW4000中考察重组菌株生长特性,以此间接评价对应转运蛋白的转运能力。【结果】Km＿SUT2基因编码的糖转运蛋白可有效提高宿主细胞转运木糖、阿拉伯糖、山梨糖、核糖、乳糖和葡萄糖的能力,但却不能转运甘露糖、果糖、蔗糖和半乳糖。类似地,Km＿SUT3基因编码的糖转运蛋白可提高细胞转运木糖、阿拉伯糖、山梨糖、半乳糖、核糖、乳糖和葡萄糖的能力,但却不能转运甘露糖和果糖。然而在葡萄糖存在的条件下,重组菌株对各种碳源的利用均受抑制,但Km＿SUT3转运木糖和核糖过程中受葡萄糖的抑制作用较小。【结论】马克斯克鲁维酵母GX-UN120中转运蛋白Km＿SUT2和Km＿SUT3可...     

gTME构建共发酵木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母

利用全转录工程（gTME）方法将全局转录因子spt15随机突变并克隆表达, 构建突变库。将突变基因连接到表达载体 pYX212上, 醋酸锂法转化入不利用木糖的酿酒酵母YPH499中, 经特定的培养基初筛获得高效利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌株。对获得的重组菌株进行了初步研究, 该菌株能够很好的利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖。在30oC, 200 r/min, 发酵96 h时, 50 g/L木糖和葡萄糖的利用率为94.0%和98.9%, 乙醇产率为32.4%和31.6%, 原始菌株乙醇产率为44.3%; 当木糖和葡萄糖以质量比1:1混合发酵时, 木糖和葡萄糖利用率分别为91.7%和85.9%, 乙醇产率为26%。木糖醇的含量极低。     

克隆木糖还原酶XYL1基因的工程菌YT发酵玉米芯水解液的研究

克隆毕赤氏酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶基因XYL1,将其连接到适用于酿酒酵母工业菌株的多拷贝载体pYMIKP中,构建得到表达质粒pYMIKY-XYL1,转化酿酒酵母工业菌株Saccharomyces cerevisiae 6508.利用G418筛选转化子,得到含高拷贝木糖还原酶基因的酿酒酵母重组菌YT,以YT发酵玉米芯工业水解液生产木糖醇,研究其发酵特性和规律,为工业上生物转化法生产木糖醇提供参考.     

酿酒酵母L-阿拉伯糖转化乙醇代谢工程的研究进展

L-阿拉伯糖是木质纤维素原料中一种重要的五碳糖组分,但传统的乙醇生产菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不能利用L-阿拉伯糖。通过代谢途径工程手段,在酿酒酵母中引入L-阿拉伯糖初始代谢途径可以获得能利用L-阿拉伯糖乙醇发酵的重组菌株。并且,通过代谢途径的疏通以及吸收系统的优化可以强化重组菌株代谢L-阿拉伯糖的能力。笔者从以上角度综述了近年来酿酒酵母转化L-阿拉伯糖生产乙醇的研究进展。     

亚硫酸盐甘蔗渣浆酶解液发酵制备乙醇

以亚硫酸盐甘蔗渣浆酶解液作为原料,利用C. shehatae发酵制取燃料乙醇。结果表明：还原糖最适初始质量浓度为葡萄糖140 g/L、木糖60 g/L、酶解液总糖80 g/L。利用初始葡萄糖55.06 g/L、木糖11.18 g/L、纤维二糖4.51 g/L的亚硫酸盐甘蔗渣浆酶解液发酵,经18 h获得乙醇22.98 g/L。乙醇得率为67.23%,葡萄糖利用率为99.27%,木糖利用率为32.96%,C. shehatae适合作为蔗渣为原料的乙醇发酵菌株。     

高效发酵木糖生产乙醇酵母菌株的构建

获得高效发酵木糖生产乙醇的酵母菌株是木质纤维素生物转化生产燃料乙醇的重要前提。在4%乙醇驯化的基础上,选择了乙醇耐性提高的休哈塔假丝酵母（Candida shehatae）CICC1766菌株进一步进行紫外诱变,得到了木糖发酵性能较强的呼吸缺陷型突变体,并与乙醇发酵性能良好的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ATCC4126进行原生质体融合。采用单亲灭活法对休哈塔假丝酵母原生质体进行紫外灭活,在聚乙二醇（PEG）诱导下融合,对得到的融合子进行木糖发酵能力测定,选择到了一株能够更好地利用木糖产乙醇,并且木糖发酵性能比亲本得到明显提高的融合子F6,此融合子发酵50 g/L木糖,最高乙醇浓度达到18.75g/L,乙醇得率为0.375,达到理论转化值0.511的73.4%。与原始出发菌株CICC1766相比,乙醇产量提高了28%。     

马克斯克鲁维酵母在工业生物技术中的应用

马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus是目前研究较为广泛的一种非传统酵母,因其耐高温、生长速率快、底物谱广等诸多优势而越来越多地应用于工业生物技术领域。马克斯克鲁维酵母可以分泌菊粉酶、β-半乳糖苷酶等多种应用广泛的水解酶类;还可以利用菊粉类原料、乳清、糖蜜以及木糖等多种非粮底物生产乙醇;其在外源蛋白的分泌以及基因工程操作等工业分子生物学领域也取得了突破。现主要对近年来马克斯克鲁维酵母在产酶、乙醇发酵、分泌外源蛋白等诸多工业生物技术领域的研究进展及存在的挑战进行综述,为进一步推动马克斯克鲁维酵母在工业生物技术中的应用奠定基础。     

多质粒共转化组合筛选方法构建木糖利用酿酒酵母的研究

快速得到目标代谢路径相关基因的大量组合以及实现组合库的高效筛选,是合成生物学领域中一个重要的研究内容。建立了三质粒共转化酵母菌株组合筛选方法并以XR-XDH木糖代谢路径在酿酒酵母中的应用为例进行阐释。首先利用Yeast Golden Gate连接法在三种不同表达载体上构建不同启动子控制下的XR、XDH、XK单个基因的表达盒,然后直接用三质粒共转化系统构建100种不同组合的重组酵母。经过木糖平板初筛筛选出16个能利用木糖的组合,将这16个组合对应的三基因表达模块组装至同一表达载体后转化底盘菌株,再通过限氧发酵进行复筛,最终筛选出木糖代谢能力、木糖醇和乙醇生成速率最优菌株Sc-LQH35（TDH3p-XR-ACS2t-FBA1p-XDH-ENO2t-PDC1p-XK-ASC1t）,在培养基中含有20 g/L木糖的条件下,其木糖醇产量为7.14 g/L,乙醇产量为5.92 g/L,而菌株Sc-LQH39（TDH3p-XR-ACS2t-FBA1p-XDH-ENO2t-ZEO1p-XK-ASC1t）则表现出较强的木糖醇生产能力,特别在限氧发酵时,其木糖醇得率可高达0.71 g/g。三质粒共转化组合筛选方法实现了木糖利用菌株的灵活构建和快速筛选,并成功得到具有优良木糖利用性能的酿酒酵母菌株,表明其在重组菌株的构建和筛选工作中有一定的应用价值。     

一种基因工程改造的NADH高亲和力木糖还原酶突变基因可促进酿酒酵母发酵木糖生成乙醇

在导入表达毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶(xylose reductase,XR)和木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)基因的重组酿酒酵母中,木糖还原酶活性主要依赖辅酶NADPH,木糖醇脱氢酶活性依赖辅酶 NAD+,两者的辅助因子不同导致细胞内电子氧化还原的不平衡,是造成木糖醇积累,影响木糖代谢和乙醇产量的主要原因之一.将经过基因工程改造获得的NADH高亲和力的木糖还原酶突变基因m1,与毕赤酵母木糖醇脱氢酶(PsXDH)基因xyl2共转染酿酒酵母AH109,以转染毕赤酵母木糖还原酶(PsXR)基因xyl1和xyl2重组质粒的酵母细胞为对照菌株,在SC/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基中进行筛选,获得的阳性转化子分别命名为AH-M-XDH和AH-XR-XDH.重组酵母在限制氧通气条件下对木糖和葡萄糖进行共发酵摇瓶培养,HPLC检测发酵底物的消耗和代谢产物的产出情况.结果显示,与对照菌株AH-XR-XDH相比,AH-M-XDH的木糖利用率明显提高,乙醇得率增加了16%,木糖醇产生下降了41.4%.结果证实,通过基因工程改造的木糖代谢关键酶,可用于酿酒酵母发酵木糖生产乙醇,其能通过改善酿酒酵母细胞内氧化还原失衡的问题,提高木糖利用率和乙醇产率.