茶谷蛾成虫触角感器超微结构观察

【目的】明确茶谷蛾成虫触角上感器的种类、数量、分布及形态结构。【方法】利用扫描电镜分别对茶谷蛾雌、雄成虫触角上各类感器的超微结构进行观察。【结果】茶谷蛾触角上共分布8种感器,类型分别为B?hm氏鬃毛(2种亚型)、鳞形感器、刺形感器(2种亚型)、腔锥形感器、栓锥形感器、锥形感器、毛形感器(4种亚型)、舌形感器。【结论】茶谷蛾雌、雄成虫触角感器存在性二型性,雌雄蛾感器种类相同,但在感器亚型和数量上,雄蛾多于雌蛾。研究结果将为茶谷蛾通讯及行为机制的研究提供理论基础。     

枣食芽象甲化学感受蛋白PyasCSP4的基因克隆、表达及配体结合特征

【目的】本研究为明确枣树Zizyphus jujuba主要害虫枣食芽象甲Scythropus yasumatsui化学感受蛋白4(chemosensory protein 4, CSP4)的表达特点及配体结合特性。【方法】基于枣食芽象甲成虫触角转录组数据,利用RT-PCR方法克隆了枣食芽象甲PyasCSP4 cDNA序列,并进行生物信息学分析。通过RT-qPCR方法测定PyasCSP4在枣食芽象甲成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足和翅)中的表 达水平。通过原核表达系统和镍柱纯化获得PyasCSP4重组蛋白,采用荧光竞争结合实验测定重组蛋白PyasCSP4与35种枣树挥发物的结合特性。【结果】克隆获得枣食芽象甲PyasCSP4的cDNA序列(GenBank 登录号: OK322362),其开放阅读框全长为366 bp,编码121个氨基酸,N末端有18个氨基酸组成的信号肽序列, PyasCSP4成熟蛋白序列具有4个保守的半胱氨酸残基。RT-qPCR结果表明, PyasCSP4基因在成虫不同组织中均有表达,在触角和翅中的表达量显著高于在其他组织中的表达量。重组蛋白PyasCSP4与25种配体具有结合活性,尤其与α-蒎烯、α-水芹烯和罗勒烯等的结合能力最强,解离常数(Ki)值分别为6.29, 6.58和6.69 μmol/L。【结论】PyasCSP4能够与多种枣树挥发物结合,推测其可能在枣食芽象甲定位寄主植物的过程中发挥重要作用。本研究的结果对阐明枣食芽象甲嗅觉机制和开展绿色防控研究具有重要意义。     

二点委夜蛾非典型嗅觉受体AlepOrco的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】非典型嗅觉受体(olfactory receptor co-receptor, Orco)与典型嗅觉受体共同形成离子通道,在昆虫嗅觉识别中具有至关重要的作用。本研究旨在克隆和表达二点委夜蛾Athetis lepigone Orco基因,明确其分子特性,为进一步研究该基因在二点委夜蛾中的功能奠定基础。【方法】将二点委夜蛾雌雄成虫触角转录组数据建立本地数据库,通过生物信息学分析获得二点委夜蛾Orco同源基因AlepOrco;利用RT-PCR方法克隆二点委夜蛾AlepOrco基因全长,并在pGEX-6P-1/BL21(DE3)系统中进行了该基因开放阅读框(ORF)的原核表达,制备多克隆抗体,用Western blot检测抗体特异性;利用qPCR技术检测该基因在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织(喙、触角、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅)中的表达谱。【结果】获得了二点委夜蛾AlepOrco的cDNA(GenBank登录号:MN583125)全长序列,开放阅读框长1 422 bp,编码473个氨基酸,序列中有7个跨膜结构区,预测等电点为8.59,分子量为53.40 kD。SDS-PAGE和We...     

绿盲蝽表皮蛋白基因AlCP17的克隆、多克隆抗体制备及表达谱分析

【目的】本研究旨在通过克隆绿盲蝽Apolygus lucorum表皮蛋白(cuticular protein, CP)基因AlCP17、制备其多克隆抗体和分析其时空表达特性,为AlCP17蛋白功能的研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽表皮发育过程中的信号通路图谱提供依据。【方法】基于前期转录组数据克隆绿盲蝽AlCP17的cDNA全长序列并进行生物信息学分析;构建AlCP17原核表达载体pCZN1-AlCP17并转化大肠杆菌Escherichia coli进行体外表达,利用纯化后的重组蛋白制备AlCP17蛋白多克隆抗体;qRT-PCR检测AlCP17在绿盲蝽不同发育阶段(1-5龄若虫和成虫)和3龄初期若虫不同组织(头、胸、足、中肠、脂肪体和表皮)中的表达谱。【结果】克隆获得绿盲蝽AlCP17全长cDNA序列(GenBank登录号：OM302231),其开放阅读框长594 bp,编码197个氨基酸,预测蛋白分子量为21.69 kD,理论等电点为6.11。编码的蛋白质具有典型的表皮蛋白结构特征,含有节肢动物表皮蛋白几丁质保守结合域(non-cysCBD),即Chitin＿bind＿4结构域;氨...     

花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的克隆、原核表达及组织表达谱分析

【目的】本研究克隆花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)基因AzanOBP3,并对其进行序列和表达分析,旨在更好地了解OBP基因在花椒窄吉丁成虫触角识别气味物质过程中的作用,为农林害虫的绿色防控提供理论依据。【方法】利用RT-PCR扩增花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的cDNA序列,采用生物信息学软件分析其核苷酸和氨基酸序列;构建重组表达载体pET-28a(+)/AzanOBP3,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中进行融合蛋白的IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定重组表达蛋白;基于qPCR技术分析AzanOBP3基因在花椒窄吉丁雌雄成虫不同组织(头、胸、腹、足和翅)中的表达情况。【结果】克隆获得了花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的cDNA全长序列(GenBank登录号:MT318832),预测到其开放阅读框长414 bp,共编码137个氨基酸,等电点为4.79,蛋白分子量为16.038 kD,N末端具有29个氨基...     

荔枝蒂蛀虫信息素结合蛋白基因序列及表达分析

【目的】获得荔枝蒂蛀虫Conopomorpha sinensis 3个信息素结合蛋白(PBP)基因的全长序列,并分析序列和表达特征,为更好地利用性信息素防治该虫提供必要的基础。【方法】提取荔枝蒂蛀虫触角总RNA,利用转录组测序结果和RACE-PCR技术获得3个PBP基因的全长序列;对序列进行生物信息学分析,用I-TASSER在线软件建立蛋白三维模型,用TM-align软件进行同源建模,用COACH软件推测蛋白的结合位点;用荧光定量PCR方法分析这3个基因在不同龄期(幼虫和蛹)和3日龄雌雄成虫不同组织[触角、头(去除触角)、胸、腹、足和翅]中的表达谱。【结果】从荔枝蒂蛀虫触角中克隆了3个PBP基因的全长序列,分别命名为Csin PBP1,Csin PBP2和Csin PBP3(Gen Bank登录号:MF093145,MF093146和MF093147)。序列分析结果表明,这3个基因的编码蛋白具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,并且Csin PBP1与紫色卷蛾Yponomeuta cagnagellus PBP的氨基酸序列一致性达72%,Csin PBP2与小菜蛾Plutella xylostella PBP1的氨基酸序列一致性达55%,Csin PBP3与水稻大螟Sesamia inferens PBP3的氨基酸序列一致性达39%。软件模拟分析表明,Csin PBP1,Csin PBP2和Csin PBP3蛋白的三维结构分别与家蚕Bombyx mori普通气味结合蛋白2(GOBP2)(PDB:2wc6A)、脐橙螟Amyetois transitetella PBP1(PDB:4inx A)和家蚕PBP(PDB:2p70A)相似度最高,分别预测得到10,7和8个结合位点。表达谱分析显示,3个基因均只在成虫触角中表达,在幼虫期和蛹期不表达,在成虫头(去除触角)、胸、腹、足和翅中也不表达,且在雄虫触角中的表达量分别是雌虫中表达量的1.94,28.19和32.94倍。【结论】获得荔枝蒂蛀虫3个PBP基因的全长序列,序列和表达分析结果提示这3个基因与雄虫感受性信息素有关。     

尼罗罗非鱼Ly75基因的克隆、原核表达和多克隆抗体制备

[目的]获得尼罗罗非鱼淋巴细胞抗原75(OnLy75)基因的cDNA序列和多克隆抗体。[方法]采用RACE技术克隆OnLy75基因的cDNA全序列,通过DNAMAN、MEGA等软件分析其序列特征;构建OnLy75的原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核诱导表达;将纯化后的OnLy75重组蛋白免疫新西兰大耳白兔,并通过Western Blot技术检测多克隆抗体的效果。[结果]OnLy75的cDNA序列全长为6 632 bp,开放阅读框5 199 bp,编码1 732个氨基酸。其OnLy75重组蛋白主要存在于包涵体中;将重组蛋白纯化后免疫新西兰大耳白兔,成功获得了兔抗OnLy75多克隆抗体。用该多抗对尼罗罗非鱼不同器官进行Western Blot内源性检测,结果显示该蛋白在精巢中有丰富的表达。[结论]兔抗OnLy75多克隆抗体的成功制备,为进一步深入研究OnLy75在尼罗罗非鱼组织中的定位及功能研究提供了工具。     

中华蜜蜂Orco嗅觉受体基因的克隆、表达及亚细胞定位

【目的】克隆鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana的Orco嗅觉受体基因, 并对其在工蜂触角上进行免疫荧光定位。【方法】利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂Orco基因, 并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 使用Real-time PCR技术鉴定其在中华蜜蜂不同发育时期及不同组织的表达谱; 利用免疫荧光定位技术在中华蜜蜂工蜂触角中对Orco进行亚细胞定位。【结果】获得中华蜜蜂Orco基因的全长cDNA序列, 命名为AcerOrco (GenBank登录号： JF968610.1), 其全长为1 434 bp, 编码477个氨基酸, 预测其含7个跨膜结构以及4个位于细胞膜外的亲水区。表达谱分析显示, AcerOrco在卵、 幼虫和蛹期呈低丰度表达, 1日龄及内勤蜂时期主要在触角和足中表达, 且在1日龄的触角中表达量最高; 采集蜂时期的触角、 头(去除触角)、 胸、 腹和翅中均有较高丰度的表达。亚细胞定位结果显示, AcerOrco不仅在采集蜂触角鞭节上大量表达（尤其在触角鞭节第1亚节中表达量较高）, 而且常成对出现, 并且发现AcerOrco可能主要在触角毛形感器的外部神经元(outer dendrite, OD)以及板形感器的树突神经元中表达。【结论】成功克隆了AcerOrco基因全长, 获得了其表达谱, 且将其定位于工蜂采集蜂的触角感器神经元上, 最终推测AcerOrco与中蜂嗅觉发育和触角感器功能密切相关。     

棉铃虫普通气味受体基因HarmOR9和HarmOR29的克隆和组织表达分析

【目的】对棉铃虫Helicoverpa armigera 2个普通气味受体基因的cDNA全长进行分析,明确这两个普通气味受体基因在不同组织中的表达分布,为进一步的功能研究奠定基础。【方法】利用PCR结合RACE技术克隆棉铃虫两条普通气味受体基因的cDNA全长;利用不同的生物信息学软件对序列进行结构预测、序列比对和进化树分析;利用半定量RT-PCR检测其在棉铃虫成虫不同组织中的表达。【结果】获得两条棉铃虫气味受体基因的全长序列,并命名为HarmOR9和HarmOR29（GenBank登录号分别为KJ188252和KJ188253）。序列分析显示,HarmOR9全长1 206 bp,编码401个氨基酸;HarmOR29全长1 188 bp,编码395个氨基酸。选择已报道的鳞翅目昆虫烟青虫Heliothis assulta、家蚕Bombyx mori、烟芽夜蛾Heliothis virescens和棉铃虫的气味受体与本实验克隆得到的两个气味受体基因的编码产物进行序列比对和进化树分析,结果显示这两个气味受体与性信息素受体区别明显,并与其他普通气味受体聚类在一起。半定量RT-PCR的结果显示HarmOR9与HarmOR29都主要在触角中高表达且无雌雄间差异,HarmOR29在其他组织中均不表达;而HarmOR9在雄虫下唇须中有微量表达,在其他组织中均不表达。【结论】本研究从棉铃虫中克隆得到2个气味受体基因HarmOR9和HarmOR29的cDNA全长,其编码产物具有气味受体的典型特征并且属于普通气味受体。明确了这两个气味受体基因都在棉铃虫成虫的触角中高表达,且无雌雄差异,推测其可能参与了棉铃虫普通气味的识别过程。     

棉铃虫离子型受体基因HarmIR8a的克隆及表达定位

【目的】昆虫离子型受体(ionotropic receptors, IRs)是新发现的一类化学感觉受体,对昆虫感受环境中酸类和胺类等物质发挥着重要作用。基因克隆、序列比对以及表达定位的研究将有助于初步解析棉铃虫Helicoverpa armigera离子型受体的功能。【方法】本研究在棉铃虫触角转录组测序和分析的基础上,利用PCR技术克隆了一个离子型受体基因的全长序列,并进行序列结构预测等分析;利用荧光定量PCR技术对该基因在棉铃虫雌、雄成虫不同组织中的表达量进行了分析;同时利用原位杂交技术检测了该基因在棉铃虫雄虫触角中的表达定位。【结果】克隆获得棉铃虫HarmIR8a基因全长cDNA序列(GenBank登录号:MH638313),开放阅读框为2 688 bp,编码895个氨基酸,预测有3个跨膜区域。HarmIR8a氨基酸序列包含了一个氨基末端区域(amino terminal domain, ATD),一个由S1和S2两部分构成的配体结合域(ligand binding domain, LBD),一个孔环(pore loop, P),3个跨膜区(M1, M2和M3)和一个胞内C末端(C terminus)。荧光定量PCR结果显示,HarmIR8a在棉铃虫雌、雄成虫头(除去附器)和触角等组织中均有表达,而且在触角中高表达。棉铃虫雄虫触角原位杂交结果表明,HarmIR8a主要在触角腔锥形感器下表达。【结论】本研究初步探析了HarmIR8a基因的转录水平和表达部位,为进一步研究棉铃虫离子型受体基因的功能和生理作用奠定了基础。     

松毛虫赤眼蜂一氧化氮合酶基因的克隆、原核表达及在不同滞育阶段的表达谱分析

【目的】本研究旨在克隆松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi一氧化氮合酶(NOS)基因,表达其编码蛋白,并探究其在松毛虫赤眼蜂滞育过程中的表达模式,为松毛虫赤眼蜂滞育研究提供新依据。【方法】通过转录组数据分析获得松毛虫赤眼蜂一氧化氮合酶基因TdNOS cDNA序列,使用qPCR方法检测其在松毛虫赤眼蜂不同滞育阶段预蛹和蛹中的表达量。使用RT-PCR方法扩增TdNOS cDNA序列并通过生物信息学方法分析其序列特征。构建TdNOS的原核表达载体,利用大肠杆菌Escherichia coli表达系统表达重组TdNOS蛋白,通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化,并用于制备多克隆抗体。利用Western blot进一步检测TdNOS在松毛虫赤眼蜂不同滞育阶段的表达量。通过质谱鉴定纯化的目标蛋白。【结果】qPCR分析表明,TdNOS在松毛虫赤眼蜂滞育解除后蛹期的相对表达量显著高于其他阶段的。克隆获得松毛虫赤眼蜂TdNOS cDNA序列(GenBank登录号:MN650600),开放阅读框(ORF)序列长1 014 bp,编码337个氨基酸,无信号肽序列,不含跨膜结构,预测有33...     

卡尼鄂拉蜂锌转运蛋白-7相似蛋白（ZnT-7-like）的基因克隆、 抗体制备及差异表达

【目的】本研究旨在克隆卡尼鄂拉蜂Apis mellifera carnica锌转运蛋白 7相似蛋白（zinc transporter 7-like, ZnT-7-like）基因, 制备ZnT-7-like多克隆抗体, 了解该基因在卡尼鄂拉蜂王浆腺中不同时期的差异表达情况。【方法】运用RT PCR法从卡尼鄂拉蜂王浆腺总RNA中扩增ZnT-7-like基因, 进行生物信息学分析, 为避开跨膜结构的干扰, 选择克隆其部分序列（273 bp）作为多肽免疫序列。将其亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1, 转入大肠杆菌Escherichia coli BL21 （DE3）中诱导表达获得融合蛋白, 然后将融合蛋白纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, 分别用间接ELISA和Western blot检测抗体的效价和特异性, 最后采用实时荧光定量RT-PCR以及Western blot技术检测该基因在不同日龄成虫王浆腺中的相对表达量。【结果】克隆得到卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因, 大小为1 065 bp。SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白成功表达; 制备的多克隆抗体效价高达1∶64 000, 且具有很高的特异性。ZnT-7-like在卡尼鄂拉蜂5个日龄成虫中的转录情况存在较大差异, 表现为3日龄成虫中的表达量极显著高于其他日龄（P<0.01）, 12日龄表达量最低, 其他日龄间表达量两两差异显著(P<0.05)或极显著（P<0.01）; ZnT-7-like蛋白表达与转录水平基本一致。【结论】成功克隆了卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因, 制备了兔抗蜂ZnT-7-like多克隆抗体, 并在转录和翻译两个水平上测定了ZnT-7-like在卡尼鄂拉蜂王浆腺中不同时期的相对表达量。这些结果为深入研究卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因的功能奠定了基础。     

中华按蚊气味结合蛋白AsinOBP2的基因克隆、表达谱及与人体气味物质的结合特性分析

[目的]克隆中华按蚊Anopheles sinensis气味结合蛋白2(odorant binding protein 2,OBP2)基因AsinOBP2,分析该基因的表达及其重组蛋白与人体气味物质的结合能力.[方法]采用RT-PCR和RACE技术克隆AsinOBP2的全长cDNA序列,通过qPCR分析AsinOBP2...     

白蜡窄吉丁气味结合蛋白AplaOBP3的免疫定位及配体结合特性

[目的]本研究旨在解析白蜡窄吉丁Agrilusplanipennis气味结合蛋白AplaOBP3在触角中的定位及配体结合特性,同时比较AplaOBP3与已报道的AplaOBPl和AplaOBP2的功能异同.[方法]原核表达白蜡窄吉丁气味结合蛋白AplaOBP3,制备多克隆抗体并进行Western blot检测;采用免疫...     

琥珀蚕丝腺转录因子基因AaSGF-1的克隆、原核表达及组织表达分析

[目的]本研究旨在克隆琥珀蚕Antheraea assama丝腺转录因子基因AaSGF-1,分析其序列特征及表达模式并制备多克隆抗体,为探讨该基因的生理功能奠定基础.[方法]采用RT-PCR和RACE技术从琥珀蚕丝腺中克隆AaSGF-1的cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用qPCR检测AaSGF-1在琥珀蚕5龄第4...     

棉铃虫转录因子c-Myc基因在滞育和非滞育蛹脑中的表达分析及多克隆抗体制备

【目的】c-Myc是近年来研究较多的转录因子,也是受Wnt/β-catenin信号通路调节的重要靶标。本研究旨在克隆棉铃虫 Helicoverpa armigera c-Myc基因,从核酸水平初步调查 c-myc 在滞育和非滞育蛹脑中的表达情况,同时制备其蛋白的多克隆抗体。【方法】通过RACE方法克隆棉铃虫 c-myc 基因的cDNA,运用RT-PCR方法比较滞育和非滞育蛹脑中Har-c-myc基因的表达情况。根据获取的序列构建原核表达载体,在大肠杆菌 Escherichia coli 中进行表达,纯化后免疫新西兰兔,制备了多克隆抗体。【结果】克隆了棉铃虫 c-myc 基因,核酸水平的研究表明滞育蛹脑中 c-myc 表达水平明显低于非滞育蛹脑。成功地在大肠杆菌中表达了c-Myc部分肽段并通过镍柱纯化获得了较纯的重组蛋白。制备的c-Myc抗体效价达到了1:125 000。【结论】滞育蛹脑中 Har-c-myc 的表达下调。获得了抗棉铃虫c-Myc的多克隆抗体。本研究的成果为后续进一步深入研究棉铃虫Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫发育中的作用奠定了基础。