开发使用DNA探针结合粒子的检体DNA浓缩法

日本合成橡胶公司和日本罗氏公司小组使用结合了DNA探针的胶乳粒子,开发了简便且高灵敏地提取、浓缩检体中的病原菌和病毒DNA的技术。与神奈川县卫生研究所病毒部部长今井光信等合作使用这项技术用AIDS患者的血液进行检测实验。结果表明,比用普通聚合酶链反应法(PCR)的检测灵敏度高数十倍。 PCR反应是用基因扩增法扩增检测对象——基因高效率地检测的方法。但是,PCR反应的试剂量限于数十微升,所以其界限为数十微升。一旦不含检测对象就检测不出来。如果使用日本合成橡胶公司和日本罗氏开发的技术,在PCR前就能浓缩标记DNA(约330倍),据说在1ml血液中有1个分子,使用PCR     

正在开发猪呼吸器官病诊断药盒

日本制粉公司与全农共同开发猪慢性呼吸器官病的DNA探针诊断药,打算今年进入治疗试验。如果产品化,使用DNA探针的动物用诊断药将是首创产品。利用邻近夹层杂交法(AHM)检测病原菌的核酶RNA(rRNA)的诊断药仅用碱中和处理菌液,不需要进行特别处理,在2～3小时就能检测出10~4～10~5菌。特异性高,容易识别。     

日本氨基酸生产研究又获进展

在1987年日本农艺化学会年会上,协和发酵工业公司防府工厂技术研究所报告说,仅通过突变育种技术就能大幅度提高L-苏氨酸产生菌(大肠杆菌)的产酸量。原株一旦积累苏氨酸,回复变异就易发生,发酵生产24次中正常生产只能维持5次,产酸浓度为20g/L左右。现在只通过突变育种获得了发酵68小时可稳产58g/L的菌种,达到工业化     

用重组大肠杆菌生产的Bt杀虫蛋白

住友化学工业公司宝塚综合研究所使用基因重组大肠杆菌,经24小时培养生产20 g/1的苏云金杆菌杀虫蛋白.该小组曾开发了用大肠杆菌JM103株的基因重组大量生产IP的方法.这次以繁殖速度快而菌体产率高的大肠杆菌K12株为寄主,确立了高效率的TP制造法.这项成果于4月1日在京都召开的日本农艺化学会上发表. 这次生产的是对粉蛾的杀虫效果强但对蚕无毒性的IP(130 kD).如使用基因重组技术,能生产出不含对蚕有害的135kD的IP.但是比医药品附加价值低的农药,应用基因重组     

日本首次批准引进国外动物药品

日本全国农业协同组合联合会(以下简称全农)1989年8月获准引进美国ViralAntigens公司研制的猪伪狂犬病诊断药,决定9月下旬开始输入.全农获准从国外买进动物药品还是第一次.这种诊断药采用了胶乳凝集法.它和传统的中和试验和ELISA法比,诊断速度快,并能早期发现感染猪.价格是100次价4万日元.由日本疫苗公司引进,科学饲料研究所销售.     

日本首次销售食品检验用的DNA探针

(氮)公司最近在日本正式销售食品检验用DNA探针检查药盒.产品是从美国Gene Track Systems公司引进的.三种药盒分别用于检查沙门氏菌、李斯特氏菌和大肠杆菌.还打算在年内销售金黄色葡萄球菌,其后销售??的检查药,检查药盒的销售价格还不明确,但据说比酶免疫测定法(ELISA)的价格高5倍.用集落培养确     

禽大肠杆菌、肠炎、鼠伤寒、鸡白痢及鸡伤寒沙门菌多重PCR方法的建立及应用

【背景】大肠杆菌病和沙门菌病是最常见的家禽细菌性疾病,给养禽业造成严重经济损失。另外,禽大肠杆菌和沙门菌也是重要的人畜共患病原菌,可通过禽类及其产品传播给人类,对人类健康造成严重威胁。加强禽大肠杆菌和沙门菌的快速鉴别检测,对养禽业和公共卫生都具有重要意义。【目的】建立禽大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的多重PCR检测方法。【方法】通过比较分析确定禽致病性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的特异靶标基因,设计5对特异性引物,通过条件优化建立多重PCR方法,分析该多重PCR方法的特异性、敏感性及可靠性。【结果】该方法能特异性地鉴定禽致病性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌,每个PCR反应的最低检出限分别为103 CFU细菌和100 pg基因组DNA。临床分离菌株检测显示,多重PCR与传统血清学方法结果一致。【结论】建立的多重PCR方法能够快速鉴别禽致病性大肠杆菌和不同血清型沙门菌,对禽大肠杆菌病和沙门菌病的流行病学调查及临床检测具有重要意义。     

9月在欧美销售诊断衣原体属用PCR药盒

瑞士Hoffmann-La Roche 公司从9月开始在欧洲、美国销售使用聚合酶链反应法(PCR 法)的检查衣原体属用的DNA 探针诊断药盒。使用PCR 法的DNA 诊断药盒的开发为世界首创。DNA 诊断药已到新阶段。估计在日本93年下半年以后销售。DNA 探针诊断药包括在日本销售的东雷、中外制药公司等的产品;即使不扩增也能检测出基因本身     

鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用

根据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列,用OLIGO6.0设计PCR引物,从鸭源致病性大肠杆菌GH1.2中扩增到pilA基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将鸭源致病性大肠杆菌pilA基因正向插入原核表达载体pET-32a( )的BamHⅠ和HindⅢ位点间,成功构建了重组表达质粒pET-32a-pilA。重组表达质粒pET-32a-pilA转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导,表达出了大小约为36kD的pilA重组蛋白。表达产物用镍柱亲和层析纯化,与等量弗氏佐剂混合制备pilA重组蛋白疫苗,分别在1日龄、8日龄时两次对雏鸭进行免疫,二免后2周测定鸭血清中的ELISA抗体效价,并以109PFU同源菌株GH1.2攻毒,根据攻毒后鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变等级来判定pilA重组蛋白的免疫保护效果。结果pilA重组蛋白免疫鸭的血清中ELISA抗体效价为1∶12800,全菌灭活苗免疫组的血清ELISA抗体效价为1∶200;同源菌株攻毒后,pilA重组蛋白免疫保护组鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变程度均比攻毒对照组下降且差异显著或极显著,与全菌灭活苗免组比较差异不显著。表明pilA重组蛋白对同源菌株GH1.2的感染具有一定的保护效果。     

病原菌多糖基因簇在大肠杆菌中的克隆

目的:构建稳定的外源病原菌多糖基因簇克隆载体,为在糖基工程大肠杆菌中利用外源性多糖O-糖基化修饰靶标蛋白奠定基础。方法:PCR扩增大肠杆菌O157、甲型副伤寒沙门菌CMCC50973和铜绿假单胞杆菌CMCC10110的O-多糖合成基因簇,将多糖基因簇与细菌人工染色体p CC1BAC连接后,分别转化O-多糖合成缺陷的大肠杆菌W3110,并用相应多糖抗血清ELISA检测重组大肠杆菌是否利用外源O-多糖生成脂多糖(LPS),从而验证外源多糖基因簇克隆载体在大肠杆菌内是否能够生成相应的O-多糖;在此基础上,将构建的3种外源多糖基因簇克隆载体分别转化表达O-寡糖转移酶和蛋白底物菌毛蛋白Pil E的糖基工程大肠杆菌,用相应的抗血清进行Western印迹检测,以验证克隆的O-多糖能否修饰蛋白底物Pil E。结果:与阴性对照菌相比,带有大肠杆菌O157的O-多糖合成基因簇克隆载体和带有甲型副伤寒沙门菌CMCC50973的O-多糖合成基因簇克隆载体的重组菌ELISA呈阳性,提示大肠杆菌O157和甲型副伤寒沙门菌CMCC50973的O-多糖合成基因簇在大肠杆菌中被利用生成了相应的LPS;而带有铜绿假单胞杆菌CMCC10110的O-多糖合成基因簇克隆载体的重组菌W3110/BAC-10110则ELISA呈阴性。West-ern印迹结果显示,只有带有O157型大肠杆菌O-多糖合成基因簇克隆载体的糖基工程大肠杆菌CLM24/p MMB66EH-pil E-his/p ETtac28-pgl L/BAC-O157在相对分子质量40×103~58×103处出现了特异条带,表明菌毛蛋白Pil E被大肠杆菌O157型O-多糖O-糖基化修饰。结论:建立了大肠杆菌O157、甲型副伤寒沙门菌CMCC50973的O-多糖合成基因簇大片段的克隆载体,克隆的O157型O-多糖合成基因簇可实现O157型多糖对菌毛蛋白Pil E的修饰,从而为在大肠杆菌中建立稳定的利用外源病原菌多糖修饰靶标蛋白的糖基工程大肠杆菌提供了技术基础。     

麒麟公司克隆了类胡萝卜素的合成酶

麒麟啤酒公司与八千代国际大学教授原岛圭二在世界上首次成功地克隆了?? (ohrtrans)型的β-胡萝卜素和菌脂色素等黄色和橙黄色类胡萝卜素合成酶基因组.该公司用大肠杆菌和乙醇产生菌运动发酵单胞菌等微生物生产出类胡萝卜素.该公司计划导入基因组,培育出黄色花.因为β胡萝卜素是维生素A的前体,希望将来能发展成开发维生素A的发酵生产法,克隆的详细内容在11月京都召开的日本分子生物学会上发表.论文刊载在Journal of Bacteriology杂志1990年12月号上.     

变性高效液相色谱检测沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌

应用多重PCR 反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测方法.以编码沙门氏菌的fimY基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码肠出血性大肠杆菌O157:H7的rfbE基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了快速鉴别沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系,扩增产物分别为284、159和499 bp,并验证了该多重PCR具有特异性.沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.试验结果表明该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到:沙门氏菌1.5 CFU/ml、空肠弯曲菌15 CFU/ml、肠出血性大肠杆菌O157:H7 15 CFU/ml.在随机采集的226份冷冻鸡肉类样品中,检出了7份样品为沙门氏菌阳性、10份为空肠弯曲菌阳性、1份为肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性.研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测.     

结核分枝杆菌Rv3425蛋白的原核表达纯化及其血清学诊断价值

目的：用原核系统表达结核分枝杆菌Rv3425蛋白并纯化,评价该重组蛋白在结核病血清学诊断方面的价值。方法：以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板,PCR扩增得到Rv3425基因序列,克隆至表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导、表达后纯化,用Western印迹和ELISA法进行抗原性初步评价。结果：在原核系统内经IPTG诱导表达后,Rv3425蛋白主要以包涵体形式存在,经复性和镍柱层析纯化后,纯度达95%以上;Western印迹和ELISA结果证明重组Rv3425具有较强的抗原活性;用纯化的Rv3425蛋白做抗原,临床诊断结核病人血清,阳性率达50%。结论：高纯度的Rv3425蛋白在结核病诊断方面具有很高的应用价值,可作为结核病诊断的备选抗原。     

抗HBsAg-碱性磷酸酶双功能抗体分子的构建

为构建带有碱性磷酸酶活性的双功能基因工程抗体, 用PCR方法克隆大肠杆菌碱性磷酸酶基因, 通过酶切分析和DNA序列测定核实后,将其重组到抗乙肝表面抗原(HBsAg) Fab段的Fd羧基端,构建重组融合蛋白表达载体pHBFAP, 转化大肠杆菌XL1-Blue, 经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达后, 采用ELISA法检测到培养上清中存在与HBsAg的结合活性和碱性磷酸酶的催化活性, 显示抗HBsAg-碱性磷酸酶双功能抗体分子在大肠杆菌中获得了表达.     

蜱传脑炎病毒E抗原蛋白的原核表达及鉴定

目的:构建蜱传脑炎病毒(TBEV)结构蛋白E的原核表达载体,表达重组蛋白。方法:PCR扩增E蛋白全长基因片段,插入原核表达载体pET-32a并转化大肠杆菌进行诱导表达,镍柱纯化、复性。结果:E蛋白在大肠杆菌中获得表达,表达量达60 mg/L;重组E蛋白能与人抗TBEV多克隆抗体产生特异反应;用重组E抗原免疫家兔后,能检测到较高的抗体水平。结论:原核表达的E抗原蛋白具有抗体结合活性,可用于制备ELISA诊断试剂。     

胡萝卜软腐欧文氏菌中信号分子合成酶expI基因的克隆、表达及其分析

用PCR方法从胡萝卜软腐欧文氏菌的基因组DNA中扩增出信号分子合成酶expI基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28α(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达expI基因的重组大肠杆菌BL21(pET28α-expI).重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为24.8kD,与预期分子量相符.经薄层层析和高效液相色谱分析发现该重组菌产生的信号分子种类为N-3-羰基己酰高丝氨酸内酯和N-己酰高丝氨酸内酯与胡萝卜软腐欧文氏菌产生的一致.     

开发了鉴别啤酒用大麦、麦芽品种的DNA分析法

扎幌啤酒酿造技术研究所开发了以在啤酒酿造时重要的大麦基因为靶子的DNA分析法,鉴别啤酒用大麦和麦芽品种。该法是用PCR方法扩增DNA片段,用电泳带观察。由一粒大麦和麦芽能鉴别品种,且再现性好。从DNA的提取到电泳完成合计11个小时就能鉴别出品种。可鉴别出世界各地区的代表性品种(10余种)。目前使用的品种鉴别法存在需要熟练掌握,而且易受栽培条件的影响,以及改用麦芽进行品种鉴别困难等问题。不能充分地进行品种核对也是实情。找出能鉴别更接近的品种的标记,就能简便地进     

禽源大肠杆菌耶尔森氏菌强毒力岛核心基因的检测及其irp2和int基因同源性

【目的】为了提高禽源大肠杆菌中耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)的检测效率, 了解高分子量铁调节蛋白2基因(irp2)和整合酶基因(int)在不同株禽源HPI+大肠杆菌间的同源性, 进一步揭示禽源大肠杆菌HPI的转移规律。【方法】利用L16(44)正交试验设计, 建立针对HPI核心基因irp2和fyuA的双重PCR, 运用双重PCR方法检测禽源大肠杆菌临床分离株, 并对检出的7株HPI阳性(HPI+)大肠杆菌进行irp2和int基因测序及同源性分析, 同时结合这7株大肠杆菌的ERIC-PCR分析结果, 对比分析int基因的分布特点。【结果】结果显示, 新建立的双重PCR能特异性扩增出HPI核心基因; ERIC-PCR分析显示, HPI+大肠杆菌间差异均大于5%; HPI+大肠杆菌irp2基因高度保守(同源性大于99%), 而int基因虽然都位于asn-tRNA位点, 但基因序列在部分菌株间存在较大差异。【结论】建立了一种可以用于HPI的流行病学调查和实验室诊断的双重PCR方法, 并推测区域外同源重组可能是HPI基因在大肠杆菌间水平转移的主要方式。     

儿童呼吸道肺炎支原体感染的实验室诊断

目的同时用目前常用的几种诊断肺炎支原体（MP）感染的实验方法检测MP,相互比较,得出适于常规诊断MP感染的方法或组合。方法搜集我院于2006年10月至2007年5月间以呼吸道感染入院儿童病例75例,采集其咽拭子和双份血清标本,以多种方法检测有无MP感染：培养法、EIA法测抗原、PCR法测MP-DNA,ELISA法测MP特异性IgG、IgA型抗体以及捕获法ELISA测MP特异性IgM型抗体。结果上述75例儿童中,共计有12例感染MP。以此为基础,上述各方法的敏感度分别是：培养法（25％）、EIA法测抗原（8．3％）、PCR法测MP-DNA（75．0％）、ELISA法测MP特异性IgA型抗体（单份血清为0,双份血清为33．3％）、捕获法ELISA测MP特异性IgM型抗体（单份血清为66．7％,双份血清为100％）。特异度分别是：100％、96．8％、93．7％（93．7％）、98．4％（98．4％）。PCR法和捕获法ELISA测MP特异性IgM型抗体结合后敏感度和特异度分别达到100％和95．2％。结论PCR法测MP-DNA和捕获法ELISA测MP特异性IgM型抗体的组合可高效地诊断MP感染,因而可作为临床诊断MP感染的一个常规组合。     

大肠杆菌合成的HBcAg转化为HBeAg的研究及其应用

37℃用1％β-巯基乙醇处理大肠杆菌HBcAg2小时,可使其全部转化成HBeAg。以常规ELISA方法不能检出HBcAg活性。该制品能被抗-HBe阳性血清特异中和。4℃以液体形式存放稳定,-20℃经过冻融活性下降。HBcAg转化成HBeAg后聚丙烯酰胺凝胶电泳行为有所改变。分别用转化的大肠杆菌HBeAg和血浆HBeAg作为酶联反应的诊断试剂,检测35份HBsAg阳性乙肝病人血清标本的抗-HBe,符合率为91.4％。同用Abbott-HBe(RIA)试剂盒测定的17份HBsAg阳性血清标本的试验结果比较,符合率为100％。说明转化的大肠杆菌HBeAg可代替血浆HBeAg作为检测抗-HBe的诊断试剂应用。