Red同源重组技术研究进展

伴随着分子生物学的发展,一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成:Exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链DNA的末端,从5′端向3′端降解DNA,产生3′突出端;Beta蛋白结合在单链DNA上,介导互补单链DNA退火;Gam蛋白可与RecBCD酶结合,抑制其降解外源DNA的活性。Red同源重组技术具有同源序列短(40～60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。     

《分子生物学实验室传真》

《分子生物学实验室传真》(Molecular biology lab Fax)由T.A.Brown编著,1991年,BIOS Scientific Publisher出版,332页。该书有以下章节:1.细菌与噬菌体;2.化学品和试剂;3.放射化学品;4.限制和甲基化;5.DNA和RNA修饰酶;6.克隆载体;7.基因组和基因;8.电泳;9.杂交分析;10.离心法;     

用无细胞克隆系统进行特异DNA扩增的技术—PCR

作为分子生物学基石之一的分子克隆技术,是一系列技术的总称,包括目的基因的提纯,选择有自主复制能力的载体DNA,选用不同的限制性内切酶,构建新的重组DNA,导入受体细胞,重组DNA的转化,转化后遗传物质和性状的转移及重新组合,重组DNA的纯化扩增等。该系列技术的操作相当复杂繁琐且耗时长。如何从极微量的生物材料中简便快速地得到大量特定的基因,或是在众多复杂的生物基因DNA中,     

分枝杆菌噬菌体重组系统及其应用

噬菌体是微生物遗传学研究的有力工具及源泉.分枝杆菌噬菌体也是构建分枝杆菌,尤其是结核分枝杆菌遗传研究工具的基础.目前,基于分枝杆菌噬菌体重组酶的重组系统是国际热点.总结了近年来基于分枝杆菌噬菌体Che9c重组酶gp60、gp61所构建的分枝杆菌重组工程体系及其在分枝杆菌基因组研究方面的应用,并结合实验室工作展望了其研究前景.该体系不依赖细菌自身的RecA系统,不需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶,不需要复杂的体外操作,只需表达分枝杆菌噬菌体重组酶,从而使结核分枝杆菌基因敲除、基因敲入及点突变和构建分枝杆菌噬菌体突变株更方便.这为分枝杆菌及其噬菌体基因诱变及基因功能研究提供了迅捷的新途径.     

新书介绍

本书在美国是一本遗传学实验室手册。书中介绍重组DNA的基本原理和应用以及一些具体实验室操作技术,如DNA提纯及分析等,并附有转化酶、连接酶、限制性内切酶等的使用说明,取材全面、新颖,是分子生物学、生物化学、遗传工程等有关的科研人员和教学人员很好的参考书。     

Red/ET重组及其在生物医学中的应用

通过应用Rac噬菌体的RecE RecT和λ噬菌体的RedαRedβ系统而建立的DNA工程平台———Red ET重组,是一种不依赖于限制性内切酶的分子克隆新技术。运用该技术能够介导PCR产物或寡核苷酸对目标基因进行剪切、插入、融合及突变等多种操作,在生物医学领域里具有广阔的应用前景,尤其在基因组功能研究中对BACs、PACs和细菌染色体的打靶修饰以及基因敲除动物DNA靶分子的快速构建等方面最有效。随着Red ET重组的推广与应用,该技术本身也在不断被改进,在工作效率得到显著提高的同时,其操作也变得更加简单、省时、省力。结合自身的一些研究结果,对Red ET重组的技术特点、发展现状和在生物医学中的应用进行了详细阐述。     

裂解型布鲁氏菌噬菌体的分子特征研究

目的:研究布鲁氏茵噬茵体Tb(Tbilisi)的形态学和分子生物学特征.方法:采用透射电镜观察噬茵体颗粒形态,双层琼脂法观察噬斑形态,梯度密度离心纯化噬茵体颗粒,提取噬茵体基因组,采用多种限制性内切酶(S1,DNase I,RNase A,BamHI)对基因组进行酶切琼脂糖凝胶电泳,SDS-PAGE观察噬茵体颗粒全蛋白片段.结果:Tb噬茵体电镜下显示头部直径为57±2nm,短尾(32±3mm长),分类学属于短尾噬茵体科.培养48小时后显示清晰噬斑,大小为2～3mm.核酸结构分析均表明Tb噬菌体基因组为线性dsDNA分子.基因组DNA经限制性内切酶BamHI酶切产生2条清晰条带,分子量在34.5kb左右.SDS-PAGE全蛋白电泳显示Tb噬菌体含有9条主要结构蛋白.结论:该研究证实了Tb噬菌体属于短尾病毒科噬菌体,对宿主菌存在裂解效应并产生2～3mm清晰透亮形态的噬斑,基因组为dsDNA分子,全蛋白包含9条主要的结构蛋白.该研究结果为布鲁氏菌噬菌体的分子水平的研究提供了新的研究基础.     

D-环丝氨酸浓缩重组质粒菌优选条件的研究

体外DNA重组技术是分子遗传学研究的有力工具。近年来,国内外已经报道了包括原核和真核基因组中DNA片段无性繁殖的许多有意义的实验。1976年Bernardi等利用限制性核酸内切酶EcoRI及粘着末端连接法,将λ噬菌体DNA片段与pSC101质粒在体外建成了含有所有λ-EcoRI片段的重组DNA,并在     

产生志贺样毒素的噬菌体ψ297整合酶基因(int) 的克隆和序列分析

目的克隆并分析细菌性噬菌体ψ297的整合酶基因(int).方法采用加接头的基因DNA片断为模板进行步移PCR,根据溶源性噬菌体ψ297的染色体DNA上类似于噬菌体933W的整合酶基因的一个40个核苷酸设计引物,进行扩增、克隆、亚克隆、测序和序列分析.结果得到了噬菌体ψ297编码的整合酶基因(int)的完整序列,它的长度是1287bp,编码了428个氨基酸的Int蛋白质.将它们的序列与λ噬菌体的整合酶家族其它成员进行了比较,发现噬菌体ψ297的整合酶基因(int)与噬菌体VT1-Sakai的整合酶基因有79%的同源性,噬菌体ψ297的Int蛋白与噬菌体VT1-Sakai的Int蛋白在氨基酸序列上有82%的同源性.N-末端的氨基酸区域是完全保守的,而中心区和C-末端则显示出较大差异.结论噬菌体ψ297与λ噬菌体的int基因来源于同一基因库,噬菌体ψ297可能属于λ噬菌体家族.     

一种快速简便的噬菌体DNA的抽提方法

噬菌体DNA的制备和纯化是分子生物学研究中极为重要的一环,在基因库和eDNA库的建立,以及DNA克隆和筛选等方面都是不可缺少的。噬菌体DNA的制备可以通过噬菌体感染细菌在琼脂板上繁殖(称为平板法),也可以在液体培养液中繁殖(称为液体法)。平板法多用     

DNA分子标记技术在濒危物种保护中的应用

近20年来,随着分子生物学技术的迅猛发展,涌现出一批高效、可靠的DNA分子标记技术.本文论述了限制性片段长度多态性、微卫星DNA、随机扩增多态性DNA、扩增片段长度多态性等DNA分子标记技术的基本原理及技术特点;同时,介绍了DNA分子标记在濒危物种种群遗传学研究、致危因素分析及保护策略的制定等保护生物学方面的应用.     

防止发酵细菌受噬菌体污染

有些运载体携带着保护发酵细菌不受噬菌体污染的基因,这些基因编码诸如溶血嗜血菌(Haemophilus haemolyticus)Hhall系统之类的细菌限制——修饰性的序列。它们产生限制性内切酶在限制性位点上消化噬菌体的DNA。     

DNA重组技术在水稻育种上的应用

七十年代相继发现的限制性内切酶、质粒、转形变异现象等已发展成为分子生物学研究的基础。微生物领域开发的DNA重组技术(基因操作),在高等植物上的应用正方兴未艾。 DNA重组技术是指用能识别、切断特定碱基序列的限制酶,切出担当遗传信息的DNA,用DNA连接酶与在寄主内自动增殖具有双连结构的DNA质粒接合,形成重组DNA,再将重组DNA返回寄主细胞所进行的操作。转移进来的外源DNA与质粒DNA在寄主内同时增殖,来发现目的性状。在水稻等多种高等植物上,即使能鉴定、分离出目的基因,但运载其基因的有效媒介体,还大部分未被开发出来。     

噬菌体重组酶介导的DNA同源重组工程

来源于噬菌体的遗传操作工具在基因工程中具有非常重要的地位,例如位点特异性重组酶、柯斯质粒DNA文库及同源重组酶等。其中,来源于Lambda噬菌体的同源重组酶Redα/Redβ和来源于Rac原噬菌体的同源重组酶RecE/RecT能够高效地介导35–50bp短同源臂之间的重组。基于噬菌体同源重组酶Redα/Redβ和RecE/RecT开发的DNA同源重组工程(Recombineering)能够对靶标DNA分子进行快速、精准、高效的修饰,不受限制性内切酶识别位点和DNA分子大小限制,已发展成为一种新型的基因工程技术。本文主要综述了噬菌体同源重组酶及其作用机制、在大肠杆菌及其他细菌中的应用和开发,以及在微生物次级代谢产物的挖掘、动植物转基因、病毒基因组克隆和修饰等方面的应用。原位激活沉默基因簇需要宿主特异性的DNA同源重组工程进行启动子和调控元件的修饰;异源表达次级代谢产物的首要步骤一般是通过RecET直接克隆大的DNA片段;动植物转基因复杂载体的构建效率在有了Red同源重组系统以后有了革命性的发展;RecET直接克隆和Red同源重组介导的感染性克隆构建和修饰方法,不仅有利于病毒基因组功能研究...     

《基础分子生物学》

《基础分子生物学》(Essential molecular biology)第1卷,由T. A. Brown编著,1991年IRL出版社出版,299页。该书是《The Practical approach series》丛书中的一种。它提供了重组DNA基本分析技术的理论和实用指南,对于这些技术新手和有经验的科研人员都感兴趣。第1卷主要叙述了核酸制备、提纯和操作。其它内容还有微生物程序、重组DNA分子的构建和应用。每章由该领域有经验的专家用清楚易懂的文笔写成,重点在于提供正确的理论指导,结合必要的背景材料以及辅以解难释疑。该书所提到的分子生物学前沿技术对任何研究人员都有用。     

《细胞和分子植物生物学实验室指导》

《细胞和分子植物生物学实验室指导》(A laboratory guide for cellular and molecular plant biology)由I.Negrutiu和G.Gharti-Chhetri编著,1991年Birkhauser出版,386页。该书有下列章节。1.细胞技术;2.转化技术;3.提取技术;4.基因组和基因结构及功能分析领域;5.细胞学技术;6.附录;7.主题索引。索书号:58.82073/L123     

《DNA指纹法》

《DNA指纹法》(DNA fingerprinting)由Lorne T.Kirby著,1990年Stockton出版社出版,365页。该书是《分子生物学上突破》(Breakthroughs in molecular biology)系列丛书中的一种。这套丛书以其高质量在分子生物学和免疫学上占有一席之地,它以快速出版,向读者提供最新突破,边缘技术和合成,以及分子生物学的主要进展。《DNA指纹法》是种创新技术,它能使科学家去鉴别极微小组织样品,能对动物及植物种群的组成、生殖、进化加以科学研究。在法医学中可用做工具,对犯罪施行精确鉴定,发挥着重要作用。该书出版可     

基因重组与基因合成实验设计软件系统的建立

本文报导了用于基因重组与基因合成实验设计的软件系统的建立.此系统由30个功能模块组成,为研究者提供了包括在DNA分子上寻找限制性内切酶位点、核酸分子片段之间同源性比较,基因化学合成的实验设计、特定顺序分析引物及核酸杂交探针的设计、阅读框的查找等功能.此外,本系统可以对外来数据库的资料进行援引和进一步分析,为分子生物学的研究提供有价值的信息.     

产Shiga毒素噬菌体ψ297在大肠杆菌K12染色体上整合位点的定位研究

鉴定大肠杆菌O157产生Shiga毒素(Stx)的噬菌体ψ297在大肠杆菌K12染色体上的插入位点.采用加接头PCR方法从与噬菌体933W的整合酶基因int同源的核苷酸开始向未知区域进行步移测序,寻找目的基因.将获得的DNA序列与核苷酸数据库进行比较,确定了细菌性噬菌体ψ297的attL、attR和中心序列位于大肠杆菌K12的yecE基因内.噬菌体ψ297在宿主细胞E.coliK12染色体上的整合位点是yecE基因.     

苔藓植物分子系统学研究概况

结合同工酶分析技术及随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)和DNA序列测序3种分子生物学技术,对苔藓植物的分子系统学研究概况进行了介绍,并指出了在苔藓植物分子系统学研究中存在的一些问题.