甜极碱醛脱氢酶（BADH）基因转化小麦及其表达

采用基因枪法将山菠菜甜菜碱醛脱氢酶（ＢＡＤＨ）基因导入小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）品种,并且得以表达。该基因由玉米Ｕｂｉｌ启动子控制。在盐胁迫条件下,多数转基因植株叶片的ＢＡＤＨ活性比受体亲本提高１￣３倍,部分植株相对电导率比亲本明显低,表明转基因植株的细胞膜在胁迫时有受损较轻倾向。ＰＣＲ和Ｓｏｔｈｅｍ杂交分析证实外源ＢＡＤＨ基因已插入小麦基因组,平均转化频率为４．１％。     

甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因转化小麦及其表达

Betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) cDNA cloned from Atriplex hortensis L. in the plasmid pABH9 containing maize ubiquitin promoter and bar gene was transferred into wheat (Triticum aestivum L.) by microprojectile bombardment with 4.1% of average frequency of transformation. From 300 young embryo calli bombarded with the plasmid, 24 transgenic plants were obtained showing BADH gene integration by both PCR and Southern blotting analysis. Among the 24 transgenic plants, 13 exhibited higher BADH activity than the control. Some transgenic plants grew normally with healthy roots on the medium containing 0.7% NaCl while the control plants had very poor roots and finally died.     

转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因水稻第三叶气孔长度、宽度和密度及其相关性的研究

用扫描电镜对转BADH基因水稻52-7及其亲本受体中8第三叶气孔长度、宽度、密度及其相关性进行了研究。结果表明,52-7第三叶叶背面和叶腹面的气孔长度与密度分布的差异都小于中8,而两者宽度的分布都较均匀;52-7气孔长度和密度的平均值都大于中8;52-7叶背面和叶腹面3／5气孔长度存在显著件差异．气孔密度差异达到极显著;52-7第三叶叶背面气孔长度分别与气孔宽度和密度呈不显著负相关,而叶腹面气孔长度分别与气孔宽度和密度的相关性不显著。这些说明BADH基因的转入可能对第三叶气孔的某些性状产生了一定的影响。     

用天花粉蛋白基因转化小麦获得转基因植株

取普通小麦品种京411未成熟胚诱导愈伤组织,10天左右,对820个胚性愈伤组织用含有35S启动子的天花粉蛋白（trichosanthin,TCS)基因轰击。2周后,将这些被轰击的愈伤组织转到含潮霉素50mg/L的筛选培养基上,经分化和生根,获得了33棵再生植株,经接饲毒蚜虫抗病性鉴定和PCR,Southern杂交分析,从中筛选出4株含有编码TCS的转基因小麦植株,转化频率为0．49％。     

农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因转化甘蓝的研究

为获得抗旱和耐盐性提高的甘蓝植株,通过农杆菌介导法将来自菠菜的甜菜碱醛脱氢酶（Betaine Aldehyde Dehydrogenase,BADH）基因导人甘蓝品系03079,并采用正交设计优化影响转化效率的参数,建立了甘蓝高效转化体系,即以侵染液为AA液体培养基、乙酰丁香酮200μmol L^-1、侵染时间20min、共培养天数2d为最佳转化参数,在该条件下转化率可达54．26％。转基因甘蓝植株经PCR检测初步说明BADH基因已导入甘蓝中,Southern杂交证明BADH基因已稳定整合到甘蓝基因组中。甜菜碱脱氢酶活性测定结果表明,经过聚乙二醇（PEG）、NaCI和干旱处理的转基因甘蓝植株的BADH酶的平均比活力范围在2．1Umg^-1～3．6Umg^-1之间,不同处理的转基因株系酶比活力显著高于相应的未转基因株系。膜的相对电导率测定结果说明,经过PEG、NaCl和干旱处理的转基因植株平均相对电导率在16．2％～32．6％之间,耐逆境胁迫处理后的绝大多数转基因株系相对电导率显著低于相应对照。多数转BADH基因甘蓝植株在干旱、盐胁迫和PEG胁迫条件下生长势强于未转基因植株,表现为大多数转基因株系株高增幅显著高于对照,说明BADH基因的导入能提高转基因甘蓝植株的抗旱和耐盐性。我们获得的抗旱和耐盐能力明显提高的转基因甘蓝植株,可作为培育耐盐、抗旱甘蓝品种的种质材料。     

通过基因枪轰击转化获得转基因小麦植株的研究

利用ＪＱ－７００型高速基因枪将ｐＤＭ３０２质粒ＤＮＡ上的ｂａｒ基因即ＰＡＴ酶基因导入了冬小麦品种“农大１４６”的幼胚中。经过在含有的选择培养基上筛选,得到了９块具有ｐｐｔ抗性的愈伤组织。ＰＣＲ电泳检测与ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ发要交结果显示,外源ｂａｒ基因已转化进了由其中４块愈伤组织再生出的转基因的小麦植株中。     

抗除草剂草甘膦EPSPs基因在小麦中的转化

通过基因枪法,用抗除草剂草甘膦的ＥＰＳＰｓ基因转化小麦京花１号的幼穗约１０００个,及幼胚约８００个,经草甘膦选择后分别获得３８株和４株再生植株。这些再生植株经ＰＣＲ和（或）Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明,其中有部分再生植株的基因组中稳定整合了外源ＥＰＳＰｓ基因,并且转化体中部分是可育的。首次用实验证明,抗除草剂草甘膦的ＥＰＳＰｓ基因作为单子叶禾谷类作物小麦基因转化的选择标记是行之有效的。     

小麦甜菜碱醛脱氢酶基因WBADH序列

1　Ｓｏｕｒｃｅ　ＴｈｅｇｅｎｅｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉ ｖｕｍｃｖ.Ｈａｎｆｅｎｇ 970 3ｌｅａｖｅｓｃＤＮＡｂｙＰＣＲ .2　Ｎａｍｅａｎｄｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ＴｈｅＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍｂｅ ｔａｉｎｅａｌｄｅｈ     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析

以耐盐的菠菜mRNA为模板,经反转录合成甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因第一链cDNA。在人工合成的两端引物引导下,通过多聚酶链式反应(PCR),扩增获得双链cDNA。把重组有BADH基因的pUC19转化至E.coli DH5α菌株,亚克隆后测定了基因的全序列。所得到的BADH基因全长序列为1491bp,编码497个氨基酸。与文献报道的相比较,核苷酸序列同源性99.8％,氨基酸序列同源性达99.6％。在此基础上,构建了BADH基因的高等植物表达载体。     

用天花粉蛋白基因转化小麦获得转基因植株

取普通小麦品种京411未成熟胚诱导愈伤组织,10天左右,对820个胚性愈伤组织用含有35S启动子的天花粉蛋白（trichosanthin,TCS）基因轰击。2周后,将这些被轰击的愈伤组织转到含潮霉素50mg/L的筛选培养基上,经分化和生根,获得了33棵再生植株,经接饲毒蚜虫抗病性鉴定和PCR、Southern杂交分析,从中筛选出4株含有编码TCS的转基因小麦植株。转化频率为0.49%。 Abstract：Wheat immature embryo calli of 10 days culture from Jing 411,a common wheat variety, Triticum aestivum, were used as the receptor of Trichosanthin gene droven by 35S promotor to be bombardmented.Two weeks after bombardment, 820 embryonic calli were transferred onto selection medium containing 50mg/L hygromycin,and 33 plantlets with healthy roots were regenerated finaly from the calli. By the barley yellow dwarf virus resistance test of inoculating the wheat aphids carrying the virus on the plants, PCR analysis, and Southern blotting analysis, 4 plants were identified to be the transgenic wheats, containing the alien DNA that ecodes TCS gene. The transformed efficiency was around 0.12 percent.     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的表达

质粒pLS9含有1．5kb的编码菠菜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因。经限制酶切后克隆到植物表达载体的35S启动子和PolyA终止子之间。经农杆菌介导转化烟草,获得90多株抗卡那霉素再生植株。经PCR检测证明60％以上再生植株含有BADH基因。转基因植株经Western blot,BADH酶活性测定,BADH酶活性特异性染色法检查和耐盐性分析,证明菠菜BADH基因在烟草正常表达。在叶绿体和胞液中均有BADH酶存在。转基因植株能耐较高浓度盐。     

转甜菜碱醛脱氢酶基因豆瓣菜的耐盐性

将山菠菜甜苹碱醛脱氢酶（ＢＡＤＨ）基因经根癌土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ （Ｓｍｉｔｈ ｅｔ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）Ｃｏｎｎ）ＡＧＬ１介导转入豆瓣菜（Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ ｎｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｒ,Ｂｒ．）ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｊ ｂｌｏｔｉｎｇ检测呈阳性的再生植株有４６株,对６株再生植株的ＢＡＤＨ活性和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇ检测发现,有５株ＢＡＤＨ酶活性明     

基因枪法获得逆境诱导转录因子DREB1A转基因小麦的研究

以小麦品种H6756和藁城8901作为基因枪转化的靶材料,取其护颖至雌雄蕊原基形成期的幼穗,用含逆境诱导转录因子DREB1A和bar基因的质粒pAHC25轰击胚性愈伤组织,在分别含有5mgL和10mgLBasta溶液的培养基上进行筛选。得到的抗性愈伤组织在不含Basta溶液的培养基上再生培养,获得218棵再生植株。田间涂抹浓度为100mgL的Basta溶液检测后,对抗性植株作PCR检测,获得54棵再生植株。通过对其中20株T1代的PCR和Southern杂交分析,已获得14株含DREB1A和bar基因的转基因小麦植株,其中H675613株,藁城89011株。     

梭梭甜菜碱醛脱氢酶基因克隆及序列分析

采用RT-PCR、RACE等方法从超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中扩增出BADH基因的cDNA序列(命名为HaBADH),其开放阅读框为1 503 bp,推测的氨基酸序列全长为500个氨基酸残基,并含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽(VTLELGGKSP)以及与酶功能有关的半胱氨酸残基(C).其核苷酸序列与藜科几种盐生植物如盐爪爪(Kalidium foliatum)、中亚滨藜(Atriplex centralasiatica)、三角叶滨藜(Atriplex triangularis)、菠菜(Spinacia oleracea)、山菠菜(Atriplex hortensis)和甜菜(Beta vulgaris)等的相似性均在85%以上,推导编码蛋白的氨基酸序列一致性均在87%以上,表明BADH基因在藜科植物中是一种比较保守的基因.研究结果为进一步从分子水平探明梭梭的抗旱、耐盐机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定基础.     

中亚滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因的表达特性

根据已发表的几种植物的甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因的同源保守区设计了一对兼并引物,通过RT-PCR方法从中亚滨藜中扩增出BADH基因的近5′端序列,共395bp,与菠菜、山菠菜、甜菜、千穗谷、大麦的BADHcDNA相应片段的同源性较高。以此片段为探针,对中亚滨藜的基因组进行Southern杂交分析,证明该基因可能是单拷贝的。Northern印迹杂交结果表明NaCl250mmol/L处理的植株的BADHmRNA水平比对照植株约高2倍,说明中亚滨藜中BADH基因的表达受盐诱导。     

盐生植物中亚滨藜甜菜碱醛脱氢酶(AcBADH)基因的表达及其启动子的分离

克隆了盐生植物中亚滨藜 (Atriplexcentralasiat icaIljin)甜菜碱醛脱氢酶 (AcBADH)cDNA ,推测的氨基酸序列与其它物种的BADH有较高的同源性。Northern杂交结果表明 ,ABA 1 0 0 μmol L和NaCl40 0mmol L处理 48h后 ,BADH的表达增加 1 0倍左右。通过筛选中亚滨藜基因组文库 ,得到了AcBADH的基因组序列。它全长 7.7kb ,包含 1 5个外显子和 1 .2kb启动子区。除了TATA box和CAAT box以外 ,在AcBADH启动子区还发现了一些与胁迫有关的其它元件 ,如GC motif、EIRE、MRE、WUN motif、ABRE和HSE。