利用大肠杆菌质粒检测与分离痘苗病毒的启动子

本文发现,痘苗病毒DNA一些巳知的启动子序列和一些功能尚不清楚的DNA片段,可以在大肠杆菌中起始氯霉素乙酰基转移酶(Chloramphenicol Acetyltrsnsferase,简称CAT)基因的转录和表达,使转化细菌呈现氯霉素抗性表型,这一结果证明,痘苗病毒的启动子可以被大肠杆菌的RNA多聚酶所识别并有效工作。同时发现不同启动子具有不同的强度,利用大肠杆菌质粒分离和检测痘苗病毒的启动子序列,不仅可以研究痘苗病毒基因组的表达调节特点,而且也为组建痘苗病毒表达载体提供了一个快速、简便可靠的方法。     

细菌自然转化的分子机制及生物学功能研究进展

基因的水平转移在细菌的进化中起着非常重要的作用。自然界中的细菌之间主要通过3种机制进行基因水平转移:由噬菌体介导的转导、接合转移和自然转化。自然转化是指自然感受态的细菌能够自发地从外界环境中摄取DNA分子并整合到自身基因组上的过程。该现象首先发现于肺炎链球菌,目前至少有83种细菌被发现具有发生自然转化的能力,其中革兰氏阳性菌以肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S. pneumoniae)为代表,革兰氏阴性菌以奈瑟氏菌(Neisseria)为代表,对其自然转化机制的研究和认识较为清楚,但不同细菌之间自然转化的机制有所差异。自然转化的生物学功能一直以来有以下几种推测:获取营养、修复DNA损伤、生物进化,而近年来对此认识争论不休。本文将详细描述细菌自然转化的分子机制,并对其主要的生物学功能争论焦点进行评述,以期对细菌自然转化有更深入的理解和认识。     

南极海冰中的一种细菌可提供一种新酶

在南极海冰中的一种常见的细菌能提供一种新的、较好的碱性磷酸酶。这种酶可用于基因合成和克隆,能从RNA和DNA中去掉一些磷酸基。从南极细菌中分离和纯化并用于酶标记免疫测定法的这种碱性磷酸酶(APase),其有效性较从目前用于基因合成和克隆的大肠杆菌中得到的APase高50倍。但是与从大肠杆菌中得到的酶(不受热的影响)的不同处是     

细菌自然转化的分子机制研究进展

自然环境中,具备自然转化能力的细菌可以自发地从外界获取DNA,从而获得新的遗传性状。为能够自然地被转化,细菌需首先建立一个被称作感受态的生理状态并在此状态下表达DNA摄取和加工相关的基因。DNA摄取基因的表达产物可组装一个能将外源DNA摄入细胞质的蛋白复合物。在细胞质中,进入的DNA可同基因组DNA发生同源重组或建立成一个独立的质粒。一般DNA摄入细胞的过程可分为两个阶段,即从外部基质到细胞周质和跨细胞内膜的转运。近年来,包括作者在内的研究人员发现大肠杆菌中存在新的自然质粒转化模式。本文将首先综述近年来细菌自然转化的分子机制,随后简要介绍大肠杆菌中独特的自然质粒转化模式。     

昆虫杆状病毒多角体基因在原核细胞中的表达

昆虫杆状病毒的多角体基因(ocu)主要用于构建转移载体。目前,已有许多利用此类载体表达外源基因的报道,但尚未见到ocu基因本身在原核细胞中表达的资料。 从大尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)DNA获得含有ocu基因的BamH I—H片段(2.3kb),将其与表达载体pDR540重组,从被检的转化菌落中发现两个阳性重组体(pBS7d和pBS31d),它们能在大肠杆菌细胞中表达多角体蛋白。     

病毒ki-ras表达质粒的构建

用重组DNA技术构建了病毒ki-ras表达质粒,用Eco R Ⅰ和Bam H Ⅰ酶解pUC-9DNA,小牛肠碱性磷酸酶脱磷酸,病毒ki-ras编码基因来源于Hi-Hi-3质粒DNA的Sat Ⅱ和Eco R Ⅰ酶切的0.6kb片段,用连接酶和DNA聚合酶Klenow片段将两个片段连接,转化大肠杆菌JM103,免疫筛选表达质粒,从156个转化克隆中得到两株表达质粒,其中一株pKras83的p21蛋白表达量为细菌总蛋白量的10％。     

细菌自然转化的机制及影响因素

水平基因转移对耐药基因传播、编码毒素基因质粒的扩散和毒力岛的转移等过程具有重要的生物学意义。自然转化是指具有感受态的细菌从外界摄取并整合裸露DNA,是水平基因转移的方式之一。细菌发生自然转化极大地促进了耐药基因在不同细菌间的播散,导致细菌对抗生素耐药,给临床治疗带来极大的困难。许多细菌具备自然转化能力,但不同细菌自然转化过程存在着差异。细菌自然感受及转化的诱发及效率亦受到多种因素的影响。文中着重于阐述不同细菌的自然转化机制及其影响因素。     

重组DNA技术(续)

四、DNA的体外重组 DNA重组技术,当用于干扰素、胰岛素、疫苗、免疫球蛋白等物质的生产时,目前多半采用从mRNA反转录成cDNA,然后和载体DNA重组,再转化至大肠杆菌内进行复制和表达。在某一基因结构已清楚的情况下,亦可人工合成该基因(如人胰岛素基因等),再将该基因嵌入载体引进大肠杆菌中。若从基因库中分离出的基因,由于已含有内含子(Intron),     

分子进化与中立说(续)

(五)基因重复与中立说 生物进化过程中,从低级到高级,构成基因组的DNA量一般也随着增加。例如病毒基因组只有几千个碱基对,而哺乳动物有3×10~9个碱基对,大致上增加50万倍。哺乳动物跟大肠杆菌那样的细菌相比,DNA量大致上增加一千倍。这样大量的DNA大部分是由遗传物质的重复而来的。象根井(M.Nei)所指出的那样,如DNA全部重复增加,     

线粒体DNA聚合酶的起源与演化

随着新的DNA聚合酶A家族成员的加入,家族内部的系统发育关系需要重新检查,来自大肠杆菌DNA聚合酶I(DNA Pol I)和它的细菌、噬菌体和真核细胞同源物被用来重建这个家族的系统发育史.分析显示:在真核生物演化的不同阶段,线粒体DNA聚合酶基因可能通过水平基因转移方式起源于不同类群的生物.原始真核生物线粒体DNA聚合酶基因可能来源于细菌,植物线粒体DNA聚合酶基因可能从质粒获得,而真菌和动物线粒体DNA聚合酶基因可能起源于T3/T7相关噬菌体.     

碱性磷酸单醋酶在DNA体外重组试验中的应用

在遗传工程中,目的基因与载体DNA进 行连接反应时,为确保这些DNA与载体重组成 功,通常需加人数倍于目的基因的载体DNA, 但是,大量加人载体DNA,由于连接反应使大 多数DNA分子自身环化［[31,在转化时产生大量 不含目的基因的转化子,而含重组DNA的转 化子则很少,需筛选大量菌落,才能得到含有重 组DNA的转化子,这样,载体的自身环化给筛 选工作带来很大的工作量。Ullich等141介绍了 一种减少载体DNA自身环化的简单方法,就是 用碱性磷酸单醋酶切除掉载体DNA 5’末端的 磷酸基151,然后再进行体外重组。经这样处理 后的载体分子,由于缺少连接酶作用的底物（5’ 磷酸基）,分子之间不能相互连接,但其3‘末端 的经基可与未脱磷的外源DNA连接成缺口环 状型的重组DNA分子。采用这种方法可以大 大减少筛选时的工作量,所以碱性磷酸单醋酶 在DNA体外重组中的应用日趋广泛。我们选 用质粒四R325为模式,用细菌碱性磷酸单醋酶 处理后,转化Ecoli RRI,获得了较为满意的 结果。我们采用此法顺利地完成了国内乙型肝 炎病毒基因组与pBR325的重组工作。     

大肠杆菌基因组图谱研究进展

大肠杆菌分布广泛,是微生物遗传学和分子遗传学重要的研究对象,对大肠杆菌遗传学研究的许多重要发现,加学了我们在分子水平上对生物遗传机制的理解;同时由于我们对大肠杆菌遗传背景有较深的了解,大肠杆菌在基因工程研究中占据着不可替代的重要地位。本文拟将大肠杆菌基因组图谱研究方向的进展作一简要综述。 大肠杆菌基因组是由超螺旋的环状DNA分子所组成,其长度为4710.4千碱基对(kb)。大肠杆菌基因组图谱有下列三种表现形式。     

盐生盐杆菌RM07 DNA片段在大肠杆菌中的定点诱变和启动子功能分析

将来源于嗜盐古生菌——盐生盐杆菌(Halobacterium halobium)基因组的RM07 DNA片段以正反两个方向分别插入大肠杆菌启动子探针载体pKK232-8携带的报告基因——氯霉素抗性基因(cat)的上游,得到RM07-cat融合的质粒pRM07-1( )和pRM07-1(-),将其分别转入大肠杆菌HB101,进而检测了不同转化子菌株的氯霉素抗性水平和细胞内氯霉素乙酰转移酶蛋白质浓度。结果表明：正向的RM07片段在真细菌(大肠杆菌)中具有启动子活性,能够驱动cat报告基因的表达;而反向的RM07片段在大肠杆菌中不具有启动子活性。对RM07片段进行了定点诱变分析,检测了特定核苷酸突变对启动子活性的影响,结果进一步精确定位了RM07片段中对在大肠杆菌中的启动子功能有重要作用的关键碱基,并且通过改造RM07片段的碱基组成成分大幅提高了其在大肠杆菌中的启动子活性。     

细菌基因在哺乳动物细胞中的表达

纯系繁殖的编码黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的大肠杆菌(E.coli)基因,同一系列的由SV40DNA衍生的不同载体构成重组体DNA。用这样的重组体DNA转染培养的猴肾细胞,结果产生的转化体能合成大量的易于测定的大肠杆菌黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。而且,把这种细菌基因引进到嘌呤核苷酸合成特性缺陷的人莱许—奈恩(Lesch-Nyhan)细胞,这些细胞的此种生理缺陷便得到了纠正。     

增强子与基因表达的调控

增强子(Enhanoer)又称活化子(Activator)、增强因子(Enhancerelement),是存在于许多真核基因组中的调控序列,它起着活化启动子从而增强转录起始的作用。增强子不只一种序列,而是一类序列,其长度和组成不同。例如,在SV40中,它位于基因上游区-113——257bp之间,是72bp的重复序列;而在多瘤病毒中则是一个244bp的序列。增强子不仅是许多真核基因有效转录不可缺少,而且在一些病毒的感染中也起着重要作用。增强子于1981年首先在猿猴病毒SV40     

在大肠杆菌中人腺病毒5型及昆虫核多角体病毒晚期启动子表达CAT基因

本文证明,含有人5型腺病毒及苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AutograPha californica Nuclear Polyhedrosis Virus, AcNPV)启动子的DNA片段,可在大肠杆菌中起始氯霉素乙酰基转移酶(Chloramphenicol Acetyltransferase,CAT)基因的转录和表达,使转化宿主菌表现为氯霉素抗性型。这说明,除痘苗病毒启动子外,其它人类病毒及昆虫病毒的启动子也能有效地在大肠杆菌中工作。     

向植物转移基因的新方法

应用花椰菜花叶病毒(CaMV)作为载体,已将细菌的基因成功地转移到萝卜植株,并得到成功表达。Friedrich Miescher研究所(瑞士巴塞尔)的科学家应用大肠杆菌的抗氨甲蝶呤的基因替换了病毒DNA中开放读码框,并且用改变的DNA对萝卜进行了接种。4个星期以后,对处理植株和对照植株的叶片,在有氨甲蝶呤和没有氨甲蝶呤情况下,对DNA合成进行试验。对照植株在加氨甲蝶呤情况下,DNA合成受到抑制,但处理植株却未受抑制,这表明外来基因得到     

猪瘟DNA疫苗在猪体及环境的生物安全性研究

DNA疫苗生物安全性是其走向临床所须解决的关键问题之一。以猪瘟DNA疫苗为研究对象 ,探讨了其两个方面的生物安全性问题。一方面 ,将两种不同的猪瘟DNA疫苗质粒免疫猪后 ,利用PCR技术分析了其与猪细胞基因组整合的可能性 ,结果在灵敏度为 30拷贝的检测条件下 ,未发现猪瘟DNA疫苗整合到细胞基因组 ;另一方面 ,以PCR技术检测了免疫现场环境样品 ,以分析猪瘟DNA疫苗上的E2基因、CMV启动子基因和抗性基因是否在环境细菌中发生转移和扩散。结果未发现DNA疫苗转化环境细菌的直接证据。因此认为DNA疫苗对猪体和环境是安全的。     

基因分子扩增的操作方法(续二)

<正> D.扩增用 DNA的分离和提取 绝大部分DNA的纯化提取,可用去污剂使细菌溶解,用石炭酸和/或旦白水解酶处理除去旦白,用核糖核酸酶除去RNA以及乙醇沉淀等操作进行。许多来源的SDS去污剂含有能破坏DNA生物学活性的物质。 Matheson、 Coleman 和 Bell的 SDS质量合乎要求。能破坏DNA或带有颜色的SDS在使用前应通过炭柱或用乙醇再沉淀。用Marmur 法在有机溶媒中振摇,能引起DNA的极大破坏,应防止。 提取细胞质中细胞器的DNA,应从提纯过的细胞器中分离以防染色体DNA的污染。超螺旋DNA如细胞器中存在的或许多病毒的中间复制体,可用染料浮力密度离心法提取。和提取全部DNA或细胞器DNA不同,从混合DNA中分离特异基因则较为困难。 1.藉物理学上的差异从混合DNA中分离特异基因 有些基因的硷基组成与混合DNA存在     

山梨醇脱氢酶的克隆、表达及活性检测

目的:从氧化葡糖杆菌H24中克隆山梨醇脱氢酶基因进行表达并检测其活性。方法:以氧化葡糖杆菌H24基因组DNA为模板,PCR扩增包括启动子、结构基因及其后的终止序列在内的山梨醇脱氢酶基因;将PCR产物插入pMD18T载体,转化大肠杆菌DH5α;通过活性电泳检测山梨醇脱氢酶在大肠杆菌中的表达及活性。结果:从氧化葡糖杆菌H24中扩增得到山梨醇脱氢酶基因并在大肠杆菌中实现表达,重组菌株经活性电泳检测具有醇糖转化活性。结论:原核表达的山梨醇脱氢酶具有很强的醇糖转化活性。