人RHD基因的克隆和鉴定

目的克隆人RHD基因,并对其进行鉴定。方法以RhD阳性志愿者骨髓为材料,用TRIzol试剂提取总RNA;设计、合成人RHD基因扩增引物,RT-PCR方法扩增RHD基因片段;T／A克隆后将其亚克隆人pET28a（＋）载体中,经酶切、PCR和测序对重组质粒进行鉴定。结果骨髓总RNA被成功提取;RT-PCR成功扩增出RHD基因片段,其大小与预期约509bp基本一致;T／A克隆后再将其亚克隆,通过酶切和PCR证明RHD基因成功亚克隆入pET28a（＋）载体中;基因测序结果比对显示,与已公布的RHD基因（GenBank登录号为NM016124）序列基本一致,同源性为98％。结论成功克隆了RHD基因,这将为进一步研究奠定基础。     

高粱可溶性酸性转化酶基因(SAI-1)PCR克隆方法

可溶性酸性转化酶(SAI)是蔗糖代谢途径中的关键酶,对植物生长发育起着至关重要的调节作用,研究简捷快速克隆可溶性酸性转化酶基因方法,对于育种材料和品种资源的基因分型具有重要意义。本研究通过已知的高粱可溶性酸性转化酶基因序列及高粱基因组中该基因序列片段,设计引物,比较了分段克隆、基因全长克隆、巢式PCR克隆等方法克隆高粱SAI-1基因的效果,结果表明,直接扩增全长,扩增产物极其不稳定且扩增产物纯化、连接,转化后得不到阳性克隆;采用均等分段克隆,前半段扩增产物纯化、连接转化后得不到阳性克隆,但后半段克隆成功;针对高粱基因组信息中SAI-1基因上游的未知序列部分设计引物,进行单独克隆(635 bp),再单独克隆其其余序列,两段序列拼接后得到SAI-1基因全长。序列分析发现,SAI-1前段635 bp的扩增片段GC含量高达69.6%,而其后GC含量急剧下降至30%以下,所以推测全长克隆、均等片段克隆以及巢式PCR克隆失败的原因可能是SAI-1基因中GC分布不均匀,克隆高粱SAI-1基因较为适宜的方法为利用2对引物进行不均等分段扩增克隆,前段PCR退火温度较后段高1℃。该方法将为其他研究人员提供有益参考。     

人脂联素重组克隆载体构建

目的：构建含有人脂联素（adiponectin,ad）基因的重组克隆载体pEGFP-N1-AD,为进一步研究AD与脂质代谢及代谢综合征关系奠定基础。方法：根据Gene-Bank中已经公布的AD设计引物,从含有目的基因的质粒克隆模板中,利用PCR方法钓取目的基因。将AD基因克隆到真核表达载体pEGFP-N1中。酶切、PCR、及测序鉴定。结果：PCR、酶切及测序鉴定证实目的基因正确克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,测序结果与Gene—Bank报道一致。结论：成功构建了AD重组克隆真核表达载体。     

一种启动子克隆的改良Adaptor-PCR方法及在橡胶树上的应用实例

真核生物通过顺式作用元件和反式作用因子相互作用实现基因的转录调控,而启动子区域含有多种顺式元件,作为基因表达调控网络的枢纽控制着基因转录的起始与效率,一直是基因表达调控研究的重点[1]。本文提供了一种改良的基于Adaptor-PCR启动子克隆方法,改进了接头序列,设计了适合两步法PCR的接头引物。选取了25种限制性内切酶对橡胶树基因组DNA进行酶切,在所有酶切产物都平端化后,与改进的接头连接,成功构建了以Adaptor-PCR为基础的橡胶树基因启动子克隆文库,并利用此文库成功克隆了橡胶树6个蔗糖转运蛋白基因、1个转化酶基因和1个海藻糖合酶基因的启动子。本文研究结果为橡胶树基因启动子克隆提供了一个高效平台,也为其他生物基因启动子克隆提供了有益的参考。     

光叶楮肌动蛋白基因片段的克隆及其序列分析

目的:克隆构树Actin基因,为在分子生物学中研究外源基因在构树中的表达提供内参,为克隆和分析桑科其它植物的actin基因提供参考。方法:根据GenBank中一桑科植物桑树Actin基因的EST序列,设计引物,提取构树叶片总RNA,通过RT-PCR克隆目标片段。结果:获得一段大小为238bp的基因片段,经测序、同源性比较,这条片段的EST序列与桑树Actin基因、巴旦杏Actin基因的核苷酸同源性分别为96%、92%;氨基酸序列的同源性则分别为100%、98.73%。结论:通过实验结果分析表明获得了构树actin基因EST序列。     

人脂联素重组克隆载体构建

目的:构建含有人脂联素(adiponectin,ad)基因的重组克隆载体pEGFP-N1-AD,为进一步研究AD与脂质代谢及代谢综合征关系奠定基础。方法:根据Gene-Bank中已经公布的AD设计引物,从含有目的基因的质粒克隆模板中,利用PCR方法钓取目的基因。将AD基因克隆到真核表达载体pEGFP-N1中。酶切、PCR、及测序鉴定。结果:PCR、酶切及测序鉴定证实目的基因正确克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,测序结果与Gene-Bank报道一致。结论:成功构建了AD重组克隆真核表达载体。     

用同源序列的染色体定位寻找水稻抗病基因DNA片段

根据已知植物抗病基因的序列以及蛋白激酶序列中的高保守区域设计合成了特异性和简并引物,用聚合酶链反应从水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）ＤＮＡ中扩增同源片段,获约１００个大小不同的克隆。以这些克隆作探针进行限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析,已将２６个克隆定位在两个水稻分子标记连锁图１２条染色体的３４个位点上。其中１０个克隆与８个已定位的水稻抗病基因在分子标记连锁图上的位置对应或毗邻。用其中部分与抗稻瘟病基因在染色体位置相对应的克隆作探针,分析抗稻瘟病近等基因系,ＲＦＬＰ带型在抗性基因系和感病亲本间表现出多态性,表明这些克隆与抗病基因在染色体位置上有较好的对应关系。     

用基因组DNA剪接技术克隆SIgA相关基因

目的：克隆分泌型IgA（SIgA）相关基因--J链基因(IgJ)、多聚免疫球蛋白受体基因（pIgR）和IgA重链恒定区基因（IGHA）,为进一步构建SIgA真核表达质粒奠定基础。方法：采用本室建立的"基因组DNA剪接"技术,根据已发表的IgJ、pIgR和IGHA的核苷酸序列,通过计算机软件分别设计各个基因片段外显子的优化引物,从人外周血基因组DNA中直接扩增各基因的外显子序列;然后人工设计融合相邻外显子的融合引物,采用重叠PCR技术,把各基因片段的外显子串联起来形成全长编码序列,完成基因组DNA的体外剪接。扩增的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector中,通过DNA测序对阳性克隆进行分析鉴定。结果：PCR扩增的IgJ、pIgR和IGHA基因与预期大小一致;测序结果表明本实验获得的上述基因与GenBank中的目标基因序列完全一致。结论：本文通过基因组DNA剪接技术成功克隆人类SIgA三个相关基因,提示此技术是合成多外显子cDNA的有效手段。     

小麦尿卟啉原Ⅲ合成酶基因克隆及序列分析

根据水稻已公布的尿卟啉原Ⅲ合成酶(UROS)基因和小麦EST的保守序列,设计特异性引物对小麦尿卟啉原Ⅲ合成酶基因的部分片段进行克隆,得到了364 bp的cDNA(命名为UROS1)。以UROS1作为种子进行电子克隆,得到一段长为1210 bp的cDNA序列,并设计特异性引物克隆到1个1077 bp cDNA序列。对该片段分析结果表明,克隆得到的小麦UROS基因包含了信号肽区和全长的成熟肽区。小麦UROS基因与水稻UROS基因的同源性为86%左右,其推导氨基酸序列与水稻和拟南芥蛋白序列同源性分别约91%和79%。动物、植物以及微生物间核酸序列的保守性较低,氨基酸序列保守性也不高,但都存在UROS保守结构域(Hem D)。进化分析显示,该酶在不同物种间的进化速度差异较大。     

人PRKAG2全长基因的体外拼接及TA克隆载体的构建

目的:应用体外基因拼接及TA克隆技术构建含PRKAG2基因的载体.方法:通过商业途径购得PRKAG2基因的一个转录变体cDNA质粒(GenBank登记号BC 068598),其在N端缺失了44个氨基酸,根据已知的PRKAG2基因序列(GenBank登记号NM_016203),设计搭桥引物及序列扩增引物,通过PCR搭桥方法,合成完整全序列的PRKAG2基因,并将其克隆到TA载体,将得到的阳性克隆测序鉴定.结果:拼接出全长1759bp的PRKAG2基因,目的基因连接到载体后测序与设计的PRKAG2基因完全一致.结论:成功的构建了全长人PRKAG2基因的TA克隆,为进一步研究PRKAG2基因的功能提供了模板.     

无核荔枝花发育相关MADS-box基因的克隆及结构分析

目的：克隆与尢核荔枝花发百相关的MADS-box基因。方法：根据多种植物的MADS-box保守区及其C-端序列设计一对简并性引物,利用RT-PCR及3′-RACE的方法分离目的基因。结果：经同源分析,昕克隆到的基因的c-DNA序列包含有完整的MADS-box保守区与半保守的K区,是典型的MADS-box家族基因,命名为LMADSI。结论：成功地克隆到一个与无核荔枝花发育相关的MADS-box基因,以便进一步研究其对无核荔枝花发育的凋控作用。     

人参多肽基因的化学合成和克隆

 本文报道了具有降血糖作用的人参多肽基因的设计及用固相亚磷酰胺法的合成。再以质粒pUC19作为克隆载体,以大肠杆菌JM101为受体菌,克隆了人参多肽基因,并成功地获得了克隆菌株。     

小菜蛾羧酸酯酶基因的克隆及其序列分析

利用CODEHOP设计简并引物,通过反转录多聚酶链式反应(RTPCR)克隆小菜蛾Plutellaxylostella抗性种群中抗性相关的羧酸酯酶基因,随机挑取测序5个阳性克隆进行测序,测序结果经过blastx比较,发现所获得的大约420bp的基因片断均为羧酸酯酶基因,与双翅目昆虫蚊子的氨基酸序列同源性达85%以上 。     

含有分裂型内含肽DnaE基因的表达盒设计、合成及高效表达载体的构建

目的:建立一种简便、快捷的基因从头设计、优化与合成策略,进行含有分裂型内含肽DnaE基因的表达盒全合成并构建高效表达载体。方法:以免费软件GeneDesign 3.0为主要平台,同时结合Tandem Repeats Finder、UNAFold等不同生物信息学软件,对含有DnaE基因、合适酶切位点的表达盒进行设计与分段合成;合成寡核苷酸片段通过重叠PCR进行组装与克隆。结果:利用建立的设计流程,合成了大小为44～64 nt的14段寡核苷酸片段,通过重叠PCR,实现了14段寡核苷酸片段的一次性组装,经过克隆、酶切鉴定、序列分析得到了序列完全正确的表达载体。结论:建立了一套有效的、基于免费软件的基因从头设计与合成的策略,构建了可以用于环肽小分子文库表达与筛选的表达载体。     

小粒野生稻STK类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类(serine-threonine kinase,STK)抗病基因结构中保守结构域,设计引物,以小粒野生稻基因组DNA为模板,扩增获得10条STK类抗病基因同源序列.同源性分析表明其都具有STK保守结构域,与已克隆的STK类抗病基因有不同程度的相似性,为进一步克隆小粒野生稻中的STK类抗病基因提供依据.     

草莓G6PDH基因片段的克隆与序列分析

根据不同植物G6PDH同源基因的保守区设计合成简并引物,采用PCR技术从草莓基因组中分离出一个DNA片段并克隆到pMD18-T载体中。序列测定和分析表明,该片段长717 bp,与拟南芥等植物的G6PDH基因的核酸序列具有83%-87%的同源性。结果表明,克隆的片段为草莓G6PDH基因片段。     

厚藤Actin基因片段的克隆及序列分析

为研究功能基因在厚藤(Ipomoea pes-caprae L)中的表达和调控提供内参基因,本文根据Actin基因的保守区设计简并性引物,采用RT-PCR克隆厚藤的Actin基因片段,然后将获得的片段连接于克隆载体上进行测序,并运用分子生物学软件对该基因序列进行分析。结果表明,该基因片段大小为554bp,编码184个氨基酸;该序列与其他植物Actin基因的cDNA序列的同源性均在80%以上,与氨基酸序列的同源性在94%以上。由此得出,本研究克隆的基因序列为Actin基因片段,将其命名为IpActin1,并登录在GenBank,登录号为KU564627。     

小菜蛾碱性磷酸酶基因cDNA片段的克隆及其序列分析

利用DNAman设计简并引物,通过反转录一多聚酶链式反应(RT-PCR)克隆小菜蛾Plutella xylostella(L.)抗性、敏感种群中可能与苏云金芽孢杆菌(Bt)抗性相关的碱性磷酸酶基因。琼脂糖电泳结果显示扩增条带与预期片段长度一致,阳性克隆经测序获得了403bp的基因片断。经blast比较得出所克隆基因属于碱性磷酸酶基因。与敏感种群相比,抗性种群中该基因片段有18个碱基发生变化,有1个氨基酸发生替换(缬氨酸转变为苏氨酸)。研究结果对于进一步研究小菜蛾全基因结构、功能有重要的意义。     

抗菌肽AD基因的合成

设计并合成了一种新型抗菌肽基因,合成的抗菌肽(cecropin)AD基因全长140个碱基对,克隆于pCR^TM2.1载体上,经DNA序列分析证实,合成的cecropin AD基因的碱基序列与设计序列完全一致.     

甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体轻链和重链可变区基因的巢式PCR扩增及序列分析

目的：采用巢式PCR对甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链基因进行扩增,对获得的基因进行序列分析,并找出克隆鼠Igκ轻链和重链可变区基因的通用方法。方法：设计22对扩增鼠Igκ轻链可变区和重链可变区基因的引物,对6株鼠抗人甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链可变区基因进行克隆并测序,与NCBI公布的鼠免疫球蛋白序列比对分析。结果：巢式PCR方法可以有效避免单克隆抗体克隆过程的假基因,并且得到的单克隆抗体的氨基酸序列均符合鼠免疫球蛋白可变区特征。结论：建立了克隆鼠免疫球蛋白轻链和重链可变区基因的通用方法,为后期克隆鼠源性单克隆抗体的可变区基因提供了基础,并为研究甲型H1N1流感病毒血凝素与抗体的结合位点提供了实验数据。