牛生长激素cDNA的分子克隆

我们克隆了与牛生长激素Poly(A)⁺RNA互补的DNA(cDNA)。首先从小牛垂体中提纯总的Pply(A)⁺RNA,用AMV逆转录酶合成单链cDNA,以单链cDNA为模板合成双链cDNA,用多聚G及多聚c谱尾法将双链cDNA克隆到pBR322质粒的Pst I位点上,构建成牛垂体PoIy(A)⁺RNA的cDNA文库。以牛生长激素基因为探针,筛选出7个阳性菌落,经电泳鉴定有两个菌落(1号和2号)含有大于500bp的插入片段。1号克隆经酶切图谱、southeTn blot 杂交及序列分析证实含有牛生长激素的编码序列。     

利用改进的cDNA RDA技术分离胡萝卜(Daucus carota L.)体细胞胚根发育相关的基因

根据链霉亲和素与生物素之间的结合作用及磁性吸附分离的原理,发展出改进的cDNA代表性差式分析(representational difference analysis,RDA)技术,并用来检测在调控和解调控培养12h的胡萝卜体细胞胚中特异表达的基因.结果显示,在解调控12h的胡萝卜体细胞胚中,存在4条特异表达的cDNA片段,命名为NR-1,NR-2,NR-3和NR-4.将这些片段分别克隆在pBS噬菌粒载体中.DNA序列同源性比较表明,片段NR-3和NR-4分别与植物的DnaJ和木质葡聚糖内转糖基化酶(xyloglucan endo-transglycosylase)的编码基因有很高的同源性,而片段NR-2中有一段序列与LEA蛋白(late embryogenesis abundant proteins)基因有一定的同源性.NR-1则可能来自新基因.用32P标记NR-1作探针,与cDNA片段群体进行杂交证实,从解调控12h的胡萝卜体细胞胚中克隆到一种与胚根发育相关的新基因序列.Southern杂交表明,此基因在胡萝卜基因组中可能以单拷贝或低拷贝的形式存在.     

ht-Pam基因在山羊β-酪蛋白基因座定位整合的研究

利用体细胞基因打靶与核移植技术制备动物乳腺生物反应器是当今转基因定位整合表达的一种新技术。分别克隆山羊的β-酪蛋白基因5′调控区的6.3kb片段,外显子7、外显子8和9三个基因片段,并与克隆的人tPA突变体cDNA一起构建了含有neo和tk正负筛选标记基因的β-酪蛋白基因打靶载体P^GBC4tPA,并验证了neo基因、tk基因以及Cre-LoxP系统的有效性。将线性化的P^GBC4tPA通过电转染整合到山羊胎儿成纤维细胞基因组中,利用G418和GANC进行抗性细胞克隆的药物筛选,初步获得抗性细胞克隆244个,PCR检测后获得阳性细胞克隆31个,其中初步验证2个细胞克隆转植基因整合位点重组后的基因序列正确,并且该细胞克隆能够有效扩增。这为下一步基因打靶体细胞核移植制备山羊乳腺生物反应器奠定了基础。     

日本鬼鲉毒腺cDNA表达文库的构建和初步分析

以海洋生物日本鬼鲉毒腺为材料,应用SMART^TM cDNA Library Construction技术,构建以真核表达载体pcDNA3.0为基础的日本鬼鲉毒腺cDNA表达文库.通过对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,获得94个日本鬼鲉毒腺新表达序列标签（ESTs）,其中已确定全长cDNA的克隆有35个,包括溶细胞素基因、类短链神经毒素蛋白、C型凝集素、巨噬细胞迁移抑制因子、致病相关基因等,这些基因在日本鬼鲉中绝大多数为首次发现.日本鬼鲉毒腺cDNA表达文库的成功构建,为深入研究日本鬼鲉毒腺的组分及其分子作用机理奠定了基础.     

中国林蛙皮cDNA文库的构建

目的：为研究林蛙皮抗菌肽,筛选、克隆及表达相关抗菌功能基因,构建林蛙皮cDNA文库。方法：提取林蛙皮总RNA后,利用V—gene纯化试剂盒纯化mRNA,RT-PCR合成双链cDNA;取10ng／μLcDNA按照不同比例连接到入噬菌体载体,以选择最佳连接比例。结果：获得克隆总数为1．2×10^5的林蛙皮cDNA文库,重组率为99．4％。结论：所建立的cDNA文库可用于进一步筛选、克隆抗菌功能新基因。     

抗松材线虫纤维素酶单链抗体库的构建及筛选

构建鼠源性松材线虫纤维素酶（Bursaphelenchus xylophilus cellulase, BXC）的噬菌体单链抗体库,从中筛选特异性BXC的单链抗体。以BXC为抗原免疫BALB/C小鼠,从脾脏提取总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链（V_H）和轻链(V_L)可变区基因。经重叠PCR(SOE-PCR)在体外将V_H和V_L连接成单链抗体(scFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,成功构建了库容为5×10⁴的Anti-BXC单链抗体库,并从该抗体库中初步筛选到了特异性识别BXC的噬菌体单链抗体scFv。将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌HB2151进行可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,可溶性scFv获得表达,且与BXC具有结合活性,为松材线虫的检验检疫以及病理学研究奠定了基础。     

中国人γ－干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达

应用RT-PCR技术从中国人淋巴细胞mRNA反转录产物中克隆了IFN-γcDNA,序列分析证实了分子进化规律对IFN-γcDNA序列存在多态性的推论.在此基础上应用DNA重组技术,将去信号肽中国人IFN-γcDNA克隆到原核表达质粒pBV220 P_RP_L启动子下游,转化大肠杆菌DH5α,通过温度诱导表达,成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人IFN-γcDNA,其表达水平占全菌可溶性总蛋白的44.4%,初步复性后生物学活性测定结果表明γ-IFN表达量为0.45×10⁷～2.34×10⁷单位/L.     

日本血吸虫中国大陆株雌、雄成虫cDNA文库的构建

用TRIZOL试剂盒分别提取日本血吸虫中国大陆株雌、雄成虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA,完成第二链cDNA合成后,凝胶电泳回收500bp以上的片段并过柱纯化后,与载体λZipLox连接。体外包装后分别得到雌、雄成虫cDNA噬菌体表达文库。经测定雌、雄文库容量分别为3.74×10⁶、3.28×10⁶,重组比率均在96%以上,插入片段长度多在1kb左右。通过PCR技术,我们从文库中钓取到EGP、23kD膜蛋白、Actin和GCP的cDNA,其中GCP基因为低丰度表达基因。各项指标表明,我们成功构建了高质量的cDNA文库,可作为研究雌雄成虫基因差异及筛选保护性抗原基因的重要资源。     

小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

克隆小鼠IL-33基因构建其真核表达质粒,并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA,经反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因,酶切后插入pcDNA^TM3.1/myc HisA构建其真核表达质粒pcDNA-3.1-IL-33,重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR和免疫印迹法（western blotting）检测目的基因表达。结果显示,pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33cDNA序列一致,重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

噬菌体显示法克隆RNA结合蛋白cDNA——表达文库的构建

试图用噬菌体显示法(phage display)克隆编码与人白细胞介素6核转录因子的3′非翻译区(NF-IL6 3′UTR)特异结合的蛋白的cDNA.构建了回复系RR细胞的cDNA的噬粒(phagemid)表达文库,并设法除去了cDNA的大部分终止密码子.鉴定表明,该文库中含有各种大小的cDNA插入片段,并能够表达外源cDNA,为用噬菌体显示法克隆RNA结合蛋白基因或cDNA做好了准备.     

与胡萝卜胚胎发生相关的胚性细胞蛋白63cDNA分离及其基因表达研究

以胡萝卜(Daucus carota L.)鱼雷形胚状体为材料,以λgt10噬菌体为载体,构建了一个含有6.0×10~8个重组子的cDNA文库。用PCR法扩增的长度为1.1kb的胚性细胞蛋白(ECP)63 DNA片段作探针,从cDNA文库中筛选出一个完整的ECP63 cDNA克隆。ECP63 cDNA核苷酸序列总长为1989bp,编码1个含569个氨基酸残基的蛋白质,分子量为62kD。以ECP63 cDNA全长作探针的Northern分子杂交结果表明,ECP63基因在胚性细胞和不同发育时期的胚状体中高度表达,但在幼苗和非胚性细胞中不表达。在转录水平上,ECP63基因在合子胚胎发生后期大量表达。     

蜂毒溶血肽(melittin)cDNA在大肠杆菌高表达质粒中的克隆(英文)

本项研究从新羽化的蜜蜂蜂王毒腺中提取了总mRNA,用逆转录的方法,合成了cDNA,并将其克隆到了噬菌体质粒λgtll的EcoRI位点,建立了melittin的cDNA文库。用PCR扩增技术从cDNA文库中产生了长度为87bp的melittin基因,并将其插入到高表达载体pBV220的EcoRI和pstI位点构成重组质粒PBM95,并转化到大肠杆菌JM101的感受态细胞中。经过在含氨苄青霉素的LB平板上对转化子进行筛选和对来自转化子中的重组质粒PBM95的酶切分析及melittin基因的测序,证明melit－tincDNA克隆成功。     

人Leptin基因的cDNA的克隆和表达

克隆人Leptin基因的cDNA并获取表达的Leptin蛋白,为进一步研究新的Leptin相关蛋白打下基础。以人基因组DNA为模板,用引物悬挂延伸PCR法,克隆与6个组氨酸（6×His）密码子相连的人Leptin基因的cDNA,并将其克隆到体外表达载体pIVEX23MCS上,通过体外快速翻译系统(Roche公司的RTS500环状模板试剂盒和RTS500 ProteoMaster仪器)在体外表达了带有6×His的Leptin融合蛋白。经SDSPAGE及Western blot方法鉴定,融合蛋白大小正确,有172个氨基酸,分子量为1946kD,具有特异的抗原性,且主要以可溶形式存在于反应液上清中。     

抗呼吸道合胞病毒融合蛋白单链抗体的筛选及初步鉴定

目的：从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗呼吸道合胞病毒F蛋白的单链抗体。方法：以RSV F蛋白为靶抗原,通过“吸附-洗涤-洗脱-扩增”过程从天然人源性噬菌体抗体库中筛选特异性抗F蛋白单链抗体。5轮筛选后,单克隆经ELISA检测,阳性克隆进行核酸序列分析,并将阳性克隆噬菌体感染E.coli HB2151,经IPTG诱导,制备抗RSV F蛋白的可溶性单链抗体,并进行Western及Dot blot分析。结果：经过筛选,获得了18株能与F蛋白特异性结合的阳性克隆,取OD值最高的克隆E4经测序并检索Kabat数据库分析,显示其基因与人免疫球蛋白可变区基因具有高度同源性,Western及Dot blot分析表明为单链抗体。结论：利用天然人源性噬菌体抗体库技术制备出高特异性的人源性抗RSV F蛋白单链抗体。     

酵母单杂交系统分离胡萝卜生长素应答元件结合因子

高等植物胚根发育过程中, 生长素是植物细胞进行分裂、延伸和分化的信号, 对根的形成等起着不可缺少的促进作用. 生长素应答元件(AuxRE)存在于很多生长素诱导基因的启动子中, 并具有对生长素作用的应答活性. 本研究构建了特定发育时期的胡萝卜体细胞胚cDNA-AD融合表达文库, 同时构建了含有生长素应答元件的重组报告质粒. 以生长素应答元件为诱饵, 通过酵母单杂交系统筛选获得1个阳性克隆, 该阳性克隆在酵母中表达的AxRF1蛋白能够在体外结合实验中与生长素应答元件结合, 对AxRF1是否有可能参与胡萝卜体细胞胚中生长素诱导基因的表达调控进行了讨论.     

CglI基因在大肠杆菌中的功能活性分析

通过PCR技术从谷氨酸棒杆菌基因组中扩增CglI基因,克隆到载体pMD18-T Simple后测序。将CglI基因亚克隆到表达载体pJL23,构建重组质粒pJL23-CglI,转化大肠杆菌HB101菌株,通过PCR反应筛选鉴定阳性克隆。通过噬菌体感染实验,初步分析了CglI基因在大肠杆菌中的功能活性。     

人癌胚抗原单链抗体基因的构建和筛选

从分泌抗癌胚抗原(carcinoembryoni antigen, CEA)单抗的杂交瘤细胞株C50中提取总RNA, 逆转录成cDNA, PCR扩增分别得到抗体轻、重链可变区基因, 再利用两对PCR引物合成和扩增得到全单链抗体基因. 将含轻、重链可变区序列的DNA片段克隆于含噬菌体基因Ⅲ的噬菌粒pCANTAB5. 重组克隆在噬菌体表面表达基因Ⅲ与单链抗体的融合蛋白. 表达具抗原结合活性的单链抗体的重组噬菌体可以通过亲和筛选的方法筛选得到并富集. 利用该方法我们可以从许多分泌不同抗体的杂交瘤细胞RNA中快速克隆和筛选功能性抗体可变区基因.     

恒河猴大脑前额叶cDNA文库的构建

为筛选出与认知、记忆相关的脑部表达基因及基因家族，利用TRIzol试剂从恒河猴大脑前额叶组织抽提总RNA，再用纯化试剂盒从总RNA中成功纯化出mRNA。按照Stratagene公司的cDNA Synthesis Kit(200401)、ZAP-cDNA Synthesis Kit(200400)和ZAP-cDNA GigapackⅢ Gold Cloning Kit(200450)三个试剂盒的操作说明，构建了恒河猴大脑前额叶组织的cDNA文库。文库总库容为2.0×10 ⁶克隆；绝大多数的cDNA插入片段≥0.5 kb，平均长度≈1.0 kb；cDNA片段与噬菌体载体重组率为97.3%。文库各项指标均达要求，为克隆大脑PFC区表达基因、测定基因编码区序列、揭示具有多种剪切组合模式等提供了可靠资源，也为相关基因表达调控的研究提供了方便。     

抗冻蛋白(afp)基因表达载体的构建及对香蕉胚性细胞悬浮系的转化

通过PCR从‘京都七寸人参'胡萝卜基因组DNA中扩增抗冻蛋白基因,测序结果表明该基因的核苷酸序列与从宁夏‘吴忠'胡萝卜中克隆的完全一致。先后将获得的胡萝卜afp基因克隆和亚克隆至pMD18-T和pBI121,构建植物表达载体pBI121-afp。通过冻融法将pBI121-afp导入根癌农杆菌EHA105中。以香蕉栽培品种‘北大矮蕉'的胚性细胞悬浮系为受体,采用农杆菌介导法将胡萝卜afp基因导入其中,然后在Kanamycin的选择压力下通过体细胞胚发生途径进行植株再生。共获得抗性再生植株9株,其中两株经PCR检测呈阳性,可初步确定目的基因已经整合到这两株转基因香蕉植株的基因组中。