二穗短柄草(Brachypodium distachyon)BdAD1基因的克隆、表达及功能分析

本研究利用生物信息学结合RT-PCR技术从二穗短柄草(Brachypodium distachyon)中克隆出BdAD1的c DNA基因,该基因编码一个包含500个氨基酸残基的乙醛脱氢酶家族蛋白。系统进化关系分析表明,该BdAD1蛋白序列与小麦(Triticum aestivum)、羊草(Leymus chinensis)和大麦(Hordeum vulgare)的同源蛋白具有较近的亲缘关系。BdAD1基因在植物细胞的细胞核和细胞质中均有表达,而且BdAD1蛋白兼具松柏醛脱氢酶和芥子醛脱氢酶的活性(CALDH/SALDH),可将松柏醛与芥子醛分别酶解生成阿魏酸和芥子酸,但它对松柏醛的催化效率显著高于芥子醛,因此推测BdAD1可能在苯丙烷代谢途径中对阿魏酸的合成具有重要的调控作用。     

二穗短柄草(Brachypodium distachyon)BdCO基因调控开花的转录组学分析

CONSTANS(CO)是植物光周期诱导开花途径中的关键基因之一。为探究BdCO在光周期途径中的分子调控机制,本研究对野生型二穗短柄草(Brachypodium distachyon)Bd21植株、过表达BdCO基因型二穗短柄草(CO＿OX)植株和BdCO基因敲除型二穗短柄草(CO＿A3)植株进行转录组测序分析,对差异表达基因进行GO和KEGG功能富集分析,最后观察三种植株的开花表型。结果表明,对比Bd21 vs CO＿OX和Bd21 vs CO＿A3的基因表达量,分别检测到1 382个和773个差异表达基因;GO功能富集分析发现,Bd21 vs CO＿OX的差异表达基因主要富集在小核仁核糖核蛋白复合物、 snoRNA结合和rRNA处理中,Bd21 vs CO＿A3的差异表达基因主要富集在类囊体、色素结合和光合作用中;KEGG通路富集分析发现,Bd21 vs CO＿OX的差异表达基因主要富集在植物激素信号转导、真核生物中的核糖体生物发生、光合作用-天线蛋白和昼夜节律-植物等通路,Bd21 vs CO＿A3的差异表达基因主要富集在MAPK信号通路-植物、真核生物中的核糖体生物发生和光合作...     

盐胁迫对二穗短柄草幼苗生长及不同器官中盐离子稳态的影响

采用4种浓度的NaCl溶液(50、100、150、200 mmol/L)处理二穗短柄草和拟南芥(对照)幼苗,测定不同浓度盐胁迫下2种植物幼苗的生长指标和离子分布,以探讨二穗短柄草在盐胁迫下主要阳离子平衡机制.结果表明:(1)盐胁迫显著抑制二穗短柄草根叶的生物量积累.(2)根冠比数据显示,在盐胁迫条件下二穗短柄草能够更好地维系地下部分的生物量积累.(3)在4种浓度盐胁迫下,二穗短柄草叶中Na+含量低于根系,而且K+、Cl-含量和K+/Na+比值始终高于根系,说明在二穗短柄草中Na+从地下到地上的转运受到抑制,但对Cl-的转运缺乏有效的调控.(4)回归分析发现,盐胁迫下二穗短柄草和拟南芥根部Na+与K+含量变化呈正相关关系,而在叶部则不相关,说明二穗短柄草和拟南芥Na+与K+在根部具有相同的离子通道,而在叶部却具有各自独立的转运途径.     

CRISPR/Cas9介导的二穗短柄草bdfls2敲除突变体的获得

FLS2是一类在植物中保守存在的可识别细菌鞭毛蛋白并激活位于植物先天免疫反应第一层面的重要的植物模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs).为了进一步研究草坪草植物的先天免疫,本研究以冷季型草坪草模式植物二穗短柄草(Brachypodium distachyon)为材料,利用C...     

小麦铝胁迫基因TaAIP的克隆表达分析及亚细胞定位

以小麦抗逆相关蛋白TaMAPK2作为诱饵,利用酵母双杂交系统进行筛库,获得互作蛋白TaAIP。氨基酸序列分析发现TaAIP具有wali保守区,并且与一些物种的铝诱导蛋白相似。实时荧光定量PCR分析显示,TaAIP基因受到铝、干旱以及高盐胁迫上调表达。半定量RT-PCR结果表明,TaAIP在小麦茎中表达,在根部、叶片以及花中没有表达。亚细胞定位实验发现,TaAIP定位在细胞膜上。这些结果为深入分析TaAIP的抗逆性作用机理打下基础。     

三个甘蓝WRKY基因的克隆及其对非生物胁迫的表达

WRKY蛋白质是一类参与植物生长发育、生物和非生物胁迫以及其他生物过程的转录因子。研究甘蓝WRKY基因在逆境胁迫下的响应机制,为进一步研究BoWRKYs的抗逆功能奠定基础。以甘蓝（Brassica oleracea var. capitata L.）幼苗为试材,RT-PCR克隆BoWRKY40(BolC02g035760.2J)、BoWRKY46(BolC04g031460.2J)和BoWRKY70(BolC04g035730.2J)3个BoWRKYs;采用同源重组法构建pSuper1300:BoWRKYs-GFP载体,进行亚细胞定位;实时荧光定量PCR检测BoWRKYs在ABA、PEG8000和NaCl胁迫下的响应模式。结果表明,BoWRKY40、BoWRKY46和BoWRKY70的cDNA全长分别为873、831和864 bp,分别编码290、276和287个氨基酸,预测蛋白分子量为32.41、32.08和32.52 kD,理论等电点为6.77、6.18和5.62;多重比对分析发现3个BoWRKY蛋白结构域与拟南芥、番茄、玉米和棉花的WRKY结构域高度相似;亚细胞定位显示,3个Bo...     

桑树MaGPX家族基因的克隆及表达分析

谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidases, GPXs)是植物细胞清除活性氧的重要酶类之一,与植物的抗逆性紧密相关。该研究以桑树(Morus alba L.)‘红果2号’为材料,利用RT PCR方法克隆了桑树MaGPX基因家族6个成员。生物信息学分析表明,MaGPX蛋白序列具有植物GPX的典型结构域和Cys残基,并与拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGPX蛋白序列具有较高的相似性。亚细胞定位结果表明,MaGPX1/2/3/6可能定位在细胞膜、细胞质和细胞核,MaGPX4定位在叶绿体,MaGPX5可能定位在细胞膜,暗示桑树MaGPX成员具有功能的分化。qRT PCR分析表明,MaGPX基因家族各成员在芽、叶、根、雄花、雌花以及果实中均有表达,其中MaGPX1/3/5在根以及雄花中高表达,MaGPX2在雄花中高表达,MaGPX4在叶和雄花中高表达,MaGPX6在果实中高表达;MaGPX各成员的表达受干旱胁迫诱导,各成员对干旱胁迫的响应随着处理时间和胁迫程度的变化而有所不同,其中MaGPX1、MaGPX2和MaGPX3可能在清除活性氧和维持细胞内氧化还原平衡中发挥重要作用。该研究结果为桑树MaGPX基因家族的生理功能研究奠定了良好基础。     

高粱磷脂酶D基因家族的鉴定和表达分析

磷脂酶D（PLD）是植物生长和胁迫反应过程中参与膜磷脂分解代谢的关键酶。PLD编码基因在高等植物中构成了一个大的基因家族,但是仍未对高粱PLD基因家族进行深入研究。本研究中,通过全基因组分析,鉴定了15个PLD基因,并分成6个亚组,初步揭示了SbPLDs的基因结构、保守结构域、染色体定位和系统发育关系等信息。基因复制的研究表明,片段复制在高粱PLD基因家族的扩展中发挥了重要作用,SbPLDs在进化过程中经历了强烈的纯化选择。此外,转录组数据表明,受启动子区上游顺式元件调控的PLD家族基因可能在高粱的生长发育中发挥重要作用。通过real-time PCR分析,显示部分SbPLDs参与非生物胁迫和激素途径的潜力。亚细胞定位表明,高粱PLD蛋白在细胞质中富集,可能具有抗逆胁迫的功能。本研究为了解高粱PLD基因的特征提供了理论参考,为研究高粱PLD基因家族的进化提供了新的视角,也为阐明高粱PLD基因家族的功能提供了基础信息。     

盐穗木HcPEAMT基因的克隆及表达分析

依据盐穗木编码PEAMT的EST序列设计引物,通过快速扩增cDNA末端技术,获得盐穗木磷酸乙醇胺甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)全长cDNA,命名为HcPEAMT。序列分析表明HcPEAMT基因开放阅读框为1 482bp,编码494个氨基酸,推测分子量为56.3kD,理论等电点为5.51。保守结构域分析表明,HcPEAMT含有2个独立的S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的保守结构域,每个结构域含有4个基序。系统进化树分析确认HcPEAMT与盐生植物盐角草的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,盐胁迫3h时,盐穗木同化枝和根中HcPEAMT基因的表达迅速上调并达到最大值,分别为对照的4.3倍和6.7倍。脱落酸(ABA)胁迫3h时,同化枝中HcPEAMT的表达量达到最高,而根中HcPEAMT的表达在12h才达到最高,表达量分别为对照的2.6和2.5倍。研究结果表明,HcPEAMT基因表达受盐胁迫的强烈诱导,也受ABA胁迫的诱导。该研究结果有助于阐明HcPEAMT基因表达与植物抗逆性的相关性。     

山茶CjMYB1基因的克隆及表达分析

该研究通过序列比对分析,以野生红山茶和不同花色品种山茶为材料,采用PCR方法克隆CjMYB1基因,并通过生物信息学和表达分析对其进行初步研究,为深入研究山茶CjMYB1基因在花色形成和花发育过程的调控机理奠定理论基础。结果表明：(1)成功克隆获得山茶CjMYB1基因(GenBank登录号为OL347930),其开放阅读框长为879 bp,编码292个氨基酸,相对分子质量为33.17 kD;CjMYB1基因属于R2R3-MYB转录因子,且与拟南芥MYB基因家族的第7亚组处于同一分支。(2)荧光定量PCR分析发现,山茶CjMYB1基因在野生红山茶花芽中表达量最高,在萼片、花瓣、雄蕊和心皮中都有较高的表达量,推测其在山茶花器官发育中发挥着重要作用;在红色山茶品种中表达量较高,而在粉色、淡黄色、白色山茶品种中表达量较低,说明CjMYB1基因可能在红色山茶品种的花色苷合成途径中起到了关键作用。(3)亚细胞定位实验表明,CjMYB1蛋白定位在细胞核。     

模式植物短柄草研究新进展

短柄草(Brachypodium distachyon)株型矮小,易于种植栽培,生长周期短,自花授粉,容易繁殖。另外,短柄草基因组比较小,易于转化,与小麦具有比较近的亲缘关系,是理想的草类特别是禾本科模式植物。近年来,短柄草的研究工作在细胞遗传学、基因组学、比较基因组学、植物-病原菌相互作用、功能基因组学等研究领域取得了许多进展,包括完成了Bd-21全基因组的测序工作、构建了T-DNA插入突变体库、用遗传学的方法首次研究短柄草基因的生物学功能等。本文综述了近年来特别是2009年以来短柄草的研究进展,并对未来的研究工作做了展望。     

桂花RAP2 12基因的克隆与表达模式分析

国家自然科学基金(31870695);     

Functional divergence of two duplicated D-lineage MADS-box genes BdMADS2 and BdMADS4 from Brachypodium distachyon

MADS-box genes are core members of the ABCDE model for flower development where D-lineage genes play essential roles in ovule identity determination. We report here the cloning and functional characterization of two duplicated MADS-box genes, BdMADS2 and BdMADS4 from Brachypodium distachyon, the model plant of temperate grasses. BdMADS2 and BdMADS4 were highly similar to grass D-lineage MADS-box genes on the protein level and they fell in a distinctive clade on the phylogenetic tree, with conserved intron/exon structures to their rice and maize orthologues. Quantitative real time PCR revealed comparable expression levels were detected in all floral organs of Brachypodium for both genes, except for the carpel where the expression level of BdMADS2 was five times higher than that of BdMADS4. Over expression of these two genes in Arabidopsis caused curly rosette leaves, small sepals and petals, and early flowering. However, BdMADS4 showed stronger phenotypic effects than BdMADS2, suggesting functional divergence between the two genes. Cis-regulatory element prediction showed that the promoter region (including the first intron) of BdMADS4 possesses much less class I BPC protein binding motifs than that of BdMADS2 which may be responsible for the specific expression in carpels. Yeast two-hybrid assays showed that both BdMADS2 and BdMADS4 can interact with BdSEP3, but BdMADS2 can additionally interact with the putative APETALA1 orthologue (BdAP1), suggesting a deviation in their protein interaction patterns. Taken together, our data demonstrate a significant divergence between the two Brachypodium D-lineage MADS-box genes and provide evidences for their sub-functionalization.     

茶树CsCIGR基因克隆及表达特性分析

该研究以茶树基因组数据库为基础,采用RT-PCR技术,从茶树‘龙井43’中克隆得到基因CsCIGR。序列分析显示,CsCIGR基因开放阅读框长度为1 677 bp,编码588个氨基酸。进化分析表明,CsCIGR属于GRAS家族的PAT1亚家族。多序列比对显示,茶树CsCIGR蛋白与其他植物的GRAS蛋白氨基酸序列具有很高的相似性。氨基酸理化性质分析显示,CsCIGR转录因子属于亲水性蛋白。亚细胞定位预测显示,CsCIGR可能位于细胞核中。启动子预测分析发现,CsCIGR启动子区域包含胁迫响应元件(STRE)、干旱应答元件(MYC)、厌氧诱导元件(ARE)等多种与逆境响应相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析结果显示,CsCIGR基因在低温(4℃)、高温(38℃)、干旱(200 g·L~(-1) PEG)、高盐(200 mmol·L~(-1) NaCl)胁迫下均能诱导表达,且对高盐,低温和高温胁迫响应更为明显,推测CsCIGR基因在茶树响应逆境胁迫中发挥重要作用。该研究为茶树抗性育种筛选基因提供了重要理论依据。     

龙眼组蛋白去乙酰化酶基因DlHDT1的克隆与特性分析

组蛋白去乙酰化是植物表观遗传调控的重要组成部分,对染色体结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。为深入探究组蛋白去乙酰化酶基因(histone deacetylase 1,HDT1)在龙眼体胚发生过程中的功能,该研究结合龙眼基因组数据,采用RT-PCR方法克隆得到龙眼组蛋白去乙酰化酶基因(DlHDT1),对其进行生物信息学分析及亚细胞定位观察,同时结合转录组数据分析DlHDT1在体胚发生过程中的FPKM值,并利用qRT-PCR技术检测PEG6000和NaCl处理下DlHDT1的表达模式。结果表明:(1)DlHDT1基因CDS序列全长918 bp,编码305个氨基酸,该蛋白为不稳定亲水性蛋白,不含信号肽和跨膜结构,共含43个磷酸化位点,相对分子量为32 585.54 Da,等电点为4.65;进化树分析显示龙眼DlHDT1与漾濞槭亲缘关系最近(78.76%)。(2)亚细胞定位显示,DlHDT1蛋白定位于细胞核中;顺式作用元件分析发现DlHDT1基因含有大量光响应元件和脱落酸、茉莉酸甲酯等激素及逆境胁迫响应元件;转录组数据显示,DlHDT1在龙眼体胚发生不同时期均有表达,在胚性愈伤组织(EC)阶段表达最低,在球形胚(GE)阶段表达最高。(3)qRT-PCR显示,在PEG6000和NaCl处理下DlHDT1基因,呈下调表达趋势,推测DlHDT1可能参与调控龙眼对干旱及盐胁迫的响应,并存在负调控关系。研究认为,DlHDT1为核定位基因,可能参与龙眼体胚形态建成并在龙眼响应非生物逆境胁迫过程中发挥重要作用。     

茶树CsCBF1基因克隆和转录活性分析

采用RACE技术克隆了一个受冷诱导的茶树CBF基因全长cDNA,命名为CsCBF1(GenBank登录号为EU563238)。CsCBF1cDNA全长序列为1 211bp,开放阅读框编码259个氨基酸。氨基酸序列分析表明,CsCBF1具有CBF家族典型的保守结构域,与其他植物的CBF具有较高的相似性;与拟南芥、辣椒和橡胶树编码的CBF相似性分别为56%、63%和56%。亚细胞定位结果表明,CsCBF1位于细胞核内。分别将10个CsCBF1缺失突变体与GAL4DNA结合域融合的结果显示,CsCBF1的羧基末端酸性结构域(第137位氨基酸至259位氨基酸)在酵母中具有转录激活活性。实时定量RT-PCR分析表明,CsCBF1基因受低温的快速诱导表达。     

长穗偃麦草EeSKOR启动子的克隆及功能分析

为了研究外整流钾通道蛋白(stelar K⁺ outward rectifier channels,SKOR)基因SKOR在长穗偃麦草中的功能,利用热不对称交错PCR(Tail PCR)技术,克隆了长穗偃麦草EeSKOR启动子,并进行启动子顺式作用元件及基因表达分析。结果表明：(1)成功获得长穗偃麦草EeSKOR基因起始密码子上游798 bp启动子序列,命名为pEeSKOR。 (2)EeSKOR启动子除必须具备的核心启动元件外,还含有特异转录因子结合位点、植物激素响应元件、光响应元件、组织特异的启动元件和胁迫响应元件。(3)成功构建植物表达载体pEeSKOR∷GUS,经农杆菌介导的瞬时转化,EeSKOR启动子驱动GUS报告基因可在拟南芥的叶、叶柄和根中表达。(4)实时定量PCR检测显示,在NaCl、PEG、ABA和SA处理下长穗偃麦草EeSKOR基因在根中呈现不同的表达模式,NaCl处理下EeSKOR的表达量呈先下调后上调趋势;PEG处理下EeSKOR的表达量呈上调趋势,且随着时间的延长显著上调;ABA处理下EeSKOR的表达受到抑制且随处理时间延长呈显著下调趋势;SA处理下EeSKOR表现出先上调后下调趋势,且在处理72 h时表达量显著低于正常表达水平。研究认为,EeSKOR基因的表达受NaCl、PEG、ABA和SA的诱导调节。该研究结果为进一步系统研究长穗偃麦草EeSKOR基因功能提供重要理论依据。