基于高通量测序的长穗偃麦草功能分子标记发掘和分析

长穗偃麦草是小麦重要的近源物种,含有丰富的抗逆基因,广泛地应用于小麦的遗传改良育种。本研究利用高通量测序,获得长穗偃麦草的转录组测序信息,利用比较基因组学方法研究其与小麦、水稻和玉米等作物的遗传关系,评估它们之间的亲缘关系。同时,将长穗偃麦草的高通量序列比对到小麦基因,利用软件Freebayes和SAMtools/Bcftools发掘功能基因的变异位点,并对这些含有变异位点的功能基因进行注释分析,揭示长穗偃麦草优异性状形成的分子机制,这将为长穗偃麦草优异基因资源的开发和应用奠定重要基础。     

长穗偃麦草优异基因的染色体定位及应用

长穗偃麦草比较公认的有2个种,即二倍体长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum,2n=2X)和十倍体长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum,2n=10X),是重要的小麦近缘种,具有抗病、抗寒、抗旱、耐盐碱等优良性状。因其基因组中蕴含许多对小麦品种改良极为有用的基因,且易与小麦杂交等优势,多年来长穗偃麦草一直作为小麦遗传改良的优良种质资源而备受关注。本文对长穗偃麦草的基因组研究及其在小麦的抗逆、抗病和提高光合能力、产量及高分子量谷蛋白(HMW-GS)含量等方面的应用做了综述,为其基因组中优异基因的进一步开发和利用提供了理论依据。     

小麦与彭梯卡偃麦草杂种及其衍生后代的细胞遗传学研究──Ⅱ．来自小麦和彭梯卡（长穗）偃麦草及中间偃麦草杂种后代11个八倍体小偃麦的比较研究

利用染色体配对分析和酯酶及种子醇溶蛋白电泳分析研究了我国育成的１１个八倍体小偃麦,结果表明：（ａ）来源于小麦和中间偃麦草杂交后代的６个部分双二倍体中,中１和中２的偃麦草染色体组不同于中３、中４、中５和小偃７８８２９的偃麦草染色体组;（ｂ）来源于小麦和长穗偃麦草杂交后代的５个部分双二倍体中,小偃７８４的偃麦草染色体组不同于小偃６９３和小偃７６３１中的偃麦草染色体组,表明在长穗偃麦草中有两个互不相同又不同于小麦的染色体组Ｅ和Ｆ,而小偃７４３０和小偃６８中的偃麦草染色体组很可能是Ｅ和Ｆ染色体组的重组体;（ｃ）小偃７８４中的长穗偃麦草染色体组和中５及小偃７８８２９中的中间偃麦草染色体组基本相同,而中２的中间偃麦草染色体组不同于小偃６９３和小偃７６３１中的长穗偃麦草染色体组Ｆ,这意味着在长穗偃麦草和中间偃麦草中可能只有一个共同的染色体组Ｅ。部分双二倍体中酯酶及醇溶蛋白偃麦草染色体特征带的存在和发现,为这些染色体或其片段导入小麦后的鉴定提供了方便。     

小麦亲缘种属添加系耐低磷胁迫性状鉴定与基因染色体定位

采用苗期缺磷和全营养对照处理,以70个中国春—野生亲缘种属二体添加系及中国春为材料,根据苗期表观遗传性状、磷吸收率和利用率相对生物量对其进行耐低磷胁迫能力筛选鉴定和基因染色体定位。结果表明:大麦4H和长穗偃麦草7E染色体上携带有耐低磷胁迫的优异基因;长穗偃麦草6E、黑麦1R和6R、卵穗山羊草4Ug和6Mg、易变山羊草4Sv染色体携带促进小麦根系生长发育的基因;拟斯比尔托山羊草5S和簇毛麦4V染色体分别携带高磷吸收率和磷利用率的基因。通过染色体工程技术,可以将携带耐低磷胁迫基因的外源染色体片段导入普通小麦,为小麦耐低磷胁迫育种和了解植物耐低磷胁迫的分子机理奠定基础。     

硬粒小麦 长穗偃麦草2E和4E附加系及E染色体传递

为探讨长穗偃麦草E染色体在硬粒小麦背景中的传递特点,利用染色体特异分子标记、基因组原位杂交(GISH)、非变性荧光原位杂交(ND FISH)等方法,对小偃麦8801(AABBEE)与硬粒小麦(AABB)杂交后代中选育的株系Du_No.2和Du_No.4进行了分析。结果表明：(1)分子标记检测株系Du_No.2及Du_No.4分别能扩增出长穗偃麦草2E、4E染色体特异条带。(2)GISH和ND FISH分析显示,株系Du_No.2和Du_No.4分别附加了1条2E和4E染色体,表明株系Du_No.2 和Du_No.4分别为硬粒小麦 长穗偃麦草2E和4E单体附加系。(3)2个株系的减数分裂过程观察发现,后期Ⅰ、Ⅱ和末期Ⅱ都有E染色体分离异常现象,且株系Du_No.2和 Du_No.4的异常率分别为22.24%和36.18%。(4)2个株系分别与硬粒小麦进行正反杂交的后代PCR分析表明, 2E和4E染色体经雄配子的传递率分别为4.41%和2.17%,而通过雌配子的传递率都为零,表明2E和4E染色体在硬粒小麦背景中能通过雄配子传递,但不通过雌配子的传递。该研究为创建全套硬粒小麦 长穗偃麦草双体附加系及代换系提供基础。     

小麦叶锈病新抗源筛选

小麦叶锈病是小麦生产的主要病害之一,发病严重时往往导致大幅度减产。叶锈菌生理小种的变异易导致抗病基因抗性的丧失,因此不断获得新抗源对小麦抗病育种至关重要。小麦近缘植物中含有丰富的小麦育种所需的抗病基因。本研究从小麦-近缘植物双二倍体、附加系、代换系或易位系等创新种质中筛选出小麦叶锈病新抗源,为利用这些新抗源打下基础。苗期对116份供试材料人工接种美国堪萨斯州流行的小麦叶锈菌混合生理小种 (Lrcomp) ,其中部分材料人工接种09-9-1441-1等5个中国当前流行的叶锈菌生理小种进行抗性鉴定,筛选获得新抗源。116份种质中,31份免疫、近免疫或高抗Lrcomp。含有希尔斯山羊草、尾状山羊草、拟斯卑尔脱山羊草、两芒山羊草、卵穗山羊草、沙融山羊草、柱穗山羊草、顶芒山羊草、小伞山羊草、偏凸山羊草、中间偃麦草、茸毛偃麦草、长穗偃麦草、粗穗披碱草、栽培黑麦、非洲黑麦、提莫菲维染色质的部分种质免疫或高抗Lrcomp,而含二角山羊草、无芒山羊草、沙生冰草、多年生簇毛麦和一年生簇毛麦染色质的种质表现中感至高感Lrcomp。希尔斯山羊草4S染色体、尾状山羊草C#1和D#1染色体和两芒山羊草、顶芒山羊草中可能含有未被报道的抗Lrcomp的新基因,值得进一步向小麦转育。小麦-粗穗披碱草1HtS.1BL罗伯逊易位系对Lrcomp及 09-9-1441-1和09-9-1426-1等5个中国当前流行叶锈菌生理小种近免疫,值得利用染色体工程等方法获得小片段抗病易位系应用于我国小麦抗叶锈育种。     

小麦与长穗偃麦草,中间偃麦草杂种及其衍生后代的细胞遗传学研究

十倍体长穗科草和六倍体中间偃麦草均含有一些基因促使部分同源的染色体之间发生配对,这些基因分布于不同的染色体组中,并具很强的传递力。小麦与长穗偃麦草杂种回交后代的部分植株在减少数分裂后期出现多条染色同时断裂现象,使不同染色体通过断口联结形成新的易位成为可能。上述二因素可能是造成小麦和偃麦草基因重组的主要原因之一。     

抗条锈病小偃麦双体异附加系山农87074-519的鉴定

综合利用抗性接种鉴定、细胞学分析、SSR分子标记和基因组原位杂交(GISH)技术相结合的方法,对从长穗偃麦草与小麦复合杂交后代中选育的抗条锈病种质系山农87074-519进行了鉴定。结果表明,山农87074-519的根尖细胞染色体数目2n=44,花粉母细胞减数分裂中期I(PMCMI)绝大多数细胞内可观察到22个二价体,平均染色体构型2n=44=21.82Ⅱ 0.36Ⅰ,它与普通小麦中国春杂种F1的多数花粉母细胞内染色体构型为2n=21Ⅱ 1Ⅰ,因此它是1个附加了1对长穗偃麦草染色体的双体异附加系;以假鹅冠草St基因组总DNA作探针进行原位杂交发现山农87074-519的44条染色体中有2条出现黄绿色杂交信号,且杂交信号遍布整条染色体,证明其附加的长穗偃麦草染色体为St基组;利用SSR分子标记技术,在170对SSR引物中筛选出特异引物BARC165,它能稳定地在山农87074-519中扩增出长穗偃麦草特异标记BARC165268;将长穗偃麦草中BARC165的特异扩增片段克隆测序后制备成探针进行原位杂交,可在山农87074-519的间期染色体和有丝分裂中期染色体检测到杂交信号。山农87074-519综合农艺性状较好,对条锈病免疫,其抗性基因为显性,且位于附加的长穗偃麦草St基组染色体上,暂将其表示为YrSt。该种质系在小麦的遗传改良中具有重要利用价值。     

八倍体小偃麦染色体组分析

本文对普通小麦与长穗偃麦草(Elytrigia elongata=Agropyron elongatum.2n=70)杂交选育出来的5个八倍体小偃麦的染色体组进行了研究。通过八倍体小偃麦与普通小麦杂交,八倍体小偃麦相互间杂交,观察了杂种F_1花粉母细胞减数分裂行为。根据观察结果,讨论了长穗偃麦草染色体组的构成,认为长穗偃麦草的染色体组为E_1E_2F_2F_2N较为合适。在此基础上,确定了5个八倍体小偃麦的染色体组:7430为ABDE_1,68为ABDF_1,693为ABDF_1,7631为ABDF_2,784为ABDN。另外,还讨论了八倍体小偃麦染色组的重组问题。     

1E~e染色体对小麦农艺和品质性状的影响研究

二倍体长穗偃麦草含有抗条锈病、抗赤霉病和耐盐碱等优异基因,是小麦遗传改良的重要基因源之一。为明确1E~e染色体片段对小麦农艺和品质性状的影响,利用1E~e(1A)代换系和中国春为试验材料,多年多点鉴定,农艺性状分析结果表明,1E~e取代1A染色体,不仅降低了旗叶长度和旗叶宽度等农艺性状,而且降低了粒长、粒宽、穗粒数、小穗数和千粒重等产量相关性状,但显著增加了穗长。品质相关性状分析结果表明,1E~e染色体可以显著增加面团最大峰值高度和8分钟带宽,但对蛋白质含量、SDS沉降值、湿面筋含量、面筋指数和峰值高度时间等5个指标上没有显著影响。另外,本研究开发了17个1E~e染色体特异分子标记。总之,1E~e染色体可提高小麦品质,但对产量相关性状有不利影响,本研究开发的分子标记对于进一步打破连锁累赘,创制小麦-长穗偃麦草Glu-Ee1短片段易位系具有重要意义。     

普通小麦与长穗偃麦草杂种及其衍生材料的细胞遗传学特性

对十倍体长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum)与普通小麦杂交F1及其与普通小麦回交BC1F1的形态学和细胞学特性进行了分析。结果表明,长穗偃麦草与普通小麦‘兰考矮早八’衍生F1(‘兰考小偃麦’)的根尖细胞染色体数为56条;花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ染色体构型平均值为19.81Ⅰ+15.78Ⅱ+0.75Ⅲ+0.59Ⅳ;基因组荧光原位杂交(GISH)显示,兰考小偃麦中含有35条完整的长穗偃麦草和21条小麦染色体。‘兰考小偃麦’/‘科育818’和‘兰考小偃麦’/‘Cp02-3-5-5’杂交F1的根尖细胞染色体数及其所遗传的长穗偃麦草染色体数分别为50~52和16~22条,且存在染色体易位;花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ平均染色体构型为14.54Ⅰ+17.40Ⅱ+0.55Ⅲ+0.14Ⅳ,平均49.4%的细胞出现多价体(三价体或四价体)。这些材料为创造小麦-长穗偃麦草新种质奠定了基础。     

小麦抗赤霉病利器——他山之石

赤霉病是我国乃至世界小麦(Triticumaestivum)产区的重要病害,给农业生产和人畜健康造成重大威胁。分离鉴定优质抗病基因、培育抗病品种,是控制我国麦区赤霉病的重要手段。最近,山东农业大学孔令让团队完成了二倍体长穗偃麦草(Thinopyrumelongatum)基因组的组装,并在此基础上通过精细定位和图位克隆分离得到来自长穗偃麦草的抗赤霉病基因Fhb7。他们发现Fhb7编码1个谷胱甘肽转移酶,对禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)分泌的包括呕吐毒素等在内的多种毒素具有解毒作用,是1个广谱持久抗病基因。他们还发现Fhb7很可能最初源于内生真菌,经过基因水平转移进入到偃麦草基因组中。此外,Fhb7不影响其它农艺性状,且其抗性不受小麦遗传背景影响。这一系列工作揭示了作物抗病演化中的全新机制,对小麦抗赤霉病育种以及更好地利用长穗偃麦草的丰富基因资源都具有重要意义。     

小麦抗赤霉病利器——他山之石

赤霉病是我国乃至世界小麦(Triticum aestivum)产区的重要病害, 给农业生产和人畜健康造成重大威胁。分离鉴定优质抗病基因、培育抗病品种, 是控制我国麦区赤霉病的重要手段。最近, 山东农业大学孔令让团队完成了二倍体长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum)基因组的组装, 并在此基础上通过精细定位和图位克隆分离得到来自长穗偃麦草的抗赤霉病基因Fhb7。他们发现Fhb7编码1个谷胱甘肽转移酶, 对禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)分泌的包括呕吐毒素等在内的多种毒素具有解毒作用, 是1个广谱持久抗病基因。他们还发现Fhb7很可能最初源于内生真菌, 经过基因水平转移进入到偃麦草基因组中。此外, Fhb7不影响其它农艺性状, 且其抗性不受小麦遗传背景影响。这一系列工作揭示了作物抗病演化中的全新机制, 对小麦抗赤霉病育种以及更好地利用长穗偃麦草的丰富基因资源都具有重要意义。     

拟鹅观草St基因组ISSR特异标记的建立

以拟鹅观草(Pseudoroegneria spicata)、中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)、长穗偃麦草(Th.elonga-tum)、二倍体簇毛麦(Dasypyrum villosum)、澳冰草(Australopyrum retrofractum)等10份小麦族物种为材料,对100条ISSR引物进行分析,结果显示引物811可以在拟鹅观草(GenBank登录号为EU368859)和中间偃麦草中扩增出一条长441 bp的特异DNA片段命名为St441,而其它供试物种均未扩出.经序列比对、软件分析结合原位杂交结果认为St441为一类新的低拷贝重复序列.利用ISSR引物811对10份不同居群的中间偃麦草、20份披碱草属物种、4份小麦-偃麦草部分双二倍体、6份小麦-茸毛偃麦草后代和12份小麦对照进行扩增,结果发现除对照小麦外均能扩增出St441;进而对小麦-中间偃麦草两套附加系进行扩增,将St441初步定位于包括第四同源群在内的8条St染色体上.同时,发现只含有整条St染色体和St染色体片段的材料能扩增出St441,而仅有Js染色体的材料未扩增出St441.因此,该标记St441可以作为检测不同背景下St染色质的分子标记.     

普通小麦与长穗偃麦草的杂交育种及其遗传分析——小麦与偃麦草杂交的研究(三)

本文是普通小麦与长穗偃麦草杂交育种二十年的经验总结。内容介绍了长穗偃麦草的特性和染色体组型,克服杂交不育和杂种不育的方法,杂交育种的程序及其遗传分析和选出的小偃麦八倍体种、异附加系、异代换系与丰产抗病的小偃麦新品种。     

小麦属间杂种不同外植体的离体培养

幼胚或幼穗培养技术在克服远缘杂种生活力弱和不结实等方面得到广泛应用。已得到小麦、大麦、簇毛麦、黑麦、山羊草、冰草、偃麦草以及小黑麦等多种属间杂种幼胚或幼穗培养再生植株。近年来,我们对二倍体普通小麦、4D 缺体小麦与黑麦、小黑麦、山羊草、小偃麦杂种后代的幼胚或幼穗进行离体培养,获得大量再生植株。     

小麦与长穗偃麦草、中间偃麦草杂种及其衍生后代的细胞遗传学研究──Ⅲ．小麦和偃麦草基因重组的遗传基础浅析

十倍体长穗偃麦草和六倍体中间偃麦草均含有一些基因促使部分同源的染色体之间发生配对,这些基因分布于不同的染色体组中,并具很强的传递力。小麦与长穗偃麦草杂种回交后代的部分植株在减数分裂后期出现多条染色体同时断裂现象,使不同染色体通过断口联结形成新的易位成为可能。上述二因素可能是造成小麦和偃麦草基因重组的主要原因之一。     

小麦—中间偃麦草衍生材料农艺性状、HMW-GS及GISH鉴定

本研究分析了143个小麦—中间偃麦草种质材料的农艺性状、高分子量麦谷蛋白亚基及部分代表性材料的染色体构成,旨在为小麦育种中广泛有效地利用这些种质提供有用信息。结果表明,小麦—中间偃麦草种质主要农艺性状变异丰富,其在穗长、小穗数和分蘖数性状上明显优于主栽品种,分别有142(99.3%)、125(87.4%)和62(43.4%)个小麦—中间偃麦草材料的穗长、分蘖数和小穗数大于主栽品种的平均值。供试材料在Glu-1的3个基因位点上共检测到12个等位变异,形成15种亚基组合类型,以(2*,7+8,5+10)为主,占所有材料的25.7%;Glu-A1(1和2*)、Glu-B1(7+8)和Glu-D1(5+10)位点的优质亚基比例分别达到了68.4%、68.4%和52.0%,有102(71.3%)个材料在Glu-1的2或3个位点同时具有优质亚基;有17个材料的优质亚基组合为(2*,7+8,5+10)或(1,7+8,5+10),且在穗长、小穗数和分蘖数性状上均优于主栽品种。进一步对30个代表性材料GISH分析发现,8个为八倍体小偃麦,其他为非整倍体。研究结果表明这些材料可以作为改良普通小麦的有益基因资源。     

抗白粉病小偃麦异代换系的细胞学和RAPD鉴定

利用细胞学和RAPD方法,对从长穗偃麦草与普通小麦复合杂交后代中选育的抗白粉病小麦种质系山农87074－526和山农87074－551进行了鉴定。结果表明,两种质系的根尖细胞染色体数目均为2n=42,花粉母细胞减数分裂中期I（PMC MI）染色体构型为2n=21Ⅱ;二者杂交F1 PMC MI染色体构型亦为2n=21Ⅱ,两种质系分别与小麦中国春的杂种F1 PMC MI染色体构型均为2n=20Ⅱ 2I,说明两种质系为相同的双体异代系。在苗期和成株期两种质系对白粉病15号菌种均表现免疫,其白粉病抗性为显性,并且来自长穗偃麦草,抗白粉病基因位于它们所含的偃麦草染色体上。从80个随机引物中,筛选出2个引物OPE13和OPH15能在两种质系中稳定地扩增出长穗偃麦草亲本的特异DNA片段。     

一个异源胞质单体附加系小麦的遗传分析

以长穗偃麦草(Elytrigia elongata=Agropyron elongatum,2n=70)为母本,普通小麦为父本,进行核代换回交,在第九次回交的F_1(BC,F_1)代里,发现了一个异源胞质单体附加系小麦,代号E617。以E617做母本,普通小麦做父本进行杂交,杂种F_1出现正常株和弱株两种类型。正常株具有43条染色体,弱株具有42条染色体。反交,以普通小麦做母本,E617做父本,杂种F_1,无论是具有43条染色体还是具有42条染色体的植株,都是正常的。正反杂交结果表明,长穗偃麦草细胞质对普通小麦的细胞核产生了抑制作用,使核质杂种生长不正常,而附加一条特异的长穗偃麦草染色体(或端体),就能消除长穗偃麦草细胞质的抑制作用,使核质杂种恢复正常生长。