利用扰动角关联研究固氮酶反应的机理

结合新颖而敏感的受扰角关联(PAC)技术,初步利用了~(99)Mo,~(111)In 作为研究固氮酶及其模型系统反应机理的探针。~(99)Mo,~(111)In 发射的γ射线的角关联,当它们与化合物或生物大分子配位形成络合物时,就被强烈地干扰。实验指出:当~(99)MoO_4~-与半胱氢酲形成络合物时,~(99)Mo 的角关联受扰,衰减因子G_2值降低。加入ATP,G_2值进一步降低,说明ATP 对Mo-SH 催化剂的Mo 活性中心发生作用。在pH≌9.0左右的溶液中,只有那些具催化活性的固氮酶模型系统,G_2值降低。In~(+++)能代替Mg~(++)参与固氮酶反应,因此,~(111)In 的PAC 技术有助于阐明固氮酶的反应机理,特别是有关ATP 的作用问题。     

光合细菌(Rhodopseudomonas capsulata)固氮活性与钼的吸收

利用紫色非硫细菌能在厌气光照下和好气黑暗下交替生长的特点和同位素~(99)Mo示踪,来探讨Rhodopseudomonas capsulata中Mo的积累与固氮酶合成的关系。 用硫酸铵和谷氨酸盐作为氮源,把Rps. capsulata置于厌气光照下生长。由于硫酸铵阻遏固氮酶,所以菌体内既无固氮酶活性也无~(99)Mo积累。而谷氨酸盐解遏固氮酶的合成,菌体则显示固氮活性并有~(99)Mo积累。 黑暗好气生长的Rps. capsulata菌体既无固氮活性,也没有~(99)Mo的积累。将这样的菌体转移到含~(99)Mo(无谷氨酸)的培养液进行光照,固氮酶活性迅速出现,同时有~(99)Mo的积累。在Rps. capsulata中钼的吸收与固氮酶的合成及活性是紧密偶联的。     

利用扰动角关联方法研究络合物中钼的氧化态及其配位体

扰动角关联方法是一种超精细相互作用的核技术,用于测定生物大分子在溶液中的旋转关联时间,也可用来研究溶液中生物大分子构型的变化、金属离子的介离常数及金属离子在生物体内的化学状态等等。本文利用~(99)Mo作为扰动角关联测量的探针核,以不同的价态分别与EDTA,酒石酸、半胱氨酸等络合。通过不同的扰动角关联衰减因子,分别研究了~(99)Mo周围不同的电场梯度,为金属离子在化合物中的价态和配位结构的微观研究开辟了一条新的途径。     

钨酸盐去阻遏的棕色固氮菌提取液中无机钼酸对固氮酶的活化

钨酸盐中培养并去阻遏的棕色固氮菌(W-Av)只有极微弱的固氮酶活性(0.3～0.5 nmole C_2H_4/分/毫克W-Av蛋白)。当以部分纯化的钼铁蛋白补入W-Av的提取液中,后者的固氮酶活性能够上百倍地提高。当有适量保险粉及ATP和ATP发生系统存在时,W-Av提取液与钼酸钠在30℃下保温,固氮酶得到活化。在本实验的最适条件下,固氮酶的活性可达5～8nmole C_2H_4/分/毫克W-Av蛋白或25～40n mole C_2H_4/分/n mole Mo。就固氮酶的活化来说,W-Av提取液是比较稳定的,在-15℃下冻存可维持二十天以上,60℃加热5分钟,总活性约降低一半。W-Av提取液与钼酸钠保温后在-15℃下保存四天,已活化的固氮酶活性也只比对照略为降低。钨酸盐抑制固氮酶的活化,但不抑制已活化的固氮酶活性。     

ATP,Fe-S原子簇在固氮酶催化反应中的作用——模型研究

由无机钼盐与某些巯基化合物或巯基蛋白组成的固氮酶模型系统,以NaBH_4作还原剂,催化还原固氮酶的底物乙炔为乙烯。催化活性受ATP显著的促进。ATP的作用不能完全用质子酸来解释,因为催化活性的促进受ATP浓度、不同种类缓冲液和不同离子强度的影响。 在所有Mo-SH催化剂中,Mo-Fd催化活性最高。并且,在PH≌9.0左右的条件下,与固氮酶相仿,也能利用Na_2S_2O_4为还原剂,催化还原乙炔。当除去天然Fd的Fe-S辅基以后,剩下的蛋白部分再与无机钼盐配位络合,催化活性下降,而且不再能利用Na_2S_2O_4为还原剂。因此,Fd的特殊作用与它分子中含Fe-S原子簇相关。     

生物固氮

912334 肺炎克氏杆菌固氮酶水解ATP机制的动力学研究[会,英]/Thorneley,R.N.F.…∥8th Internatl.Cong. Nitrogen Fixation.-1991,5,Abs.-A-07 应用截流光谱,截流热量法,稳态H_2和Pi形成测定和质谱分析~(18)O-Pi中~(18)O的损失等研究了纯化的固氮酶组分蛋白在6℃、pH7.0和在23℃、pH7.4下需还原剂和不需还原剂ATP水解的机理.MgATP裂解产生的固氮酶结合的MgADP+Pi是可逆的,与释放一个质子偶联,吸热并在6℃下推动电子从Fe蛋白传递至     

Mo-s结构在含钼酶中的作用——含钼酶模型研究

微量元素钼,在许多氧化还原酶的活性中,起很重要的作用。目前已知有固氮酶、NADH脱氢酶、硝酸还原酶、亚硫酸氧化酶、醛氧化酶、黄嘌呤脱氢酶、黄嘌呤氧化酶等七种含钼酶,它们的共同特点是分子量大,底物专一性差,转换率低。除了酶蛋白以外,还含有其它辅基成分,每分子含1—2个钼原子,金属铁或细胞色素b和黄素。 Schrauzer的钼一半胱氨酸络合物(图1),能够模拟固氮酶的许多功能,我们曾利用它作为固氮酶模型,探讨固氮酶反应中ATP和Fe-S原子簇的作用,初步认为Mo-SH结构参与固氮酶的活性中心,Fe-S原子簇与电子     

无机钼酸在棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)体内的累积和转化

醋酸铵培养的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii),经超声击碎高速离心制备粗提取液、DEAE-纤维素柱层析表明,体内~(99)MoFe蛋白合成受到阻遏,在0.15 M NaGl洗脱分部中,除~(99)Mo储存蛋白峰外,还存在一个无机~(99)MoO_4~=组分。醋酸铵培养的棕色固氮菌经去阻遏后,在体内固氮活性出现的同时,可观察到原先菌体内累积的~(99)Mo储存蛋白峰降低,无机~(99)MoO_4~=的组分几乎消失以及~(99)MoFe蛋白合成。若去阻遏过程存在氯霉素,则菌体不显示固氮活性,(99)MoFe蛋白不再合成,储存蛋白和无机铝酸组分中~(99)Mo的转移停止。     

棕色固氮菌固氮酶复合体的分离提纯及其某些特性

用DEAE-纤维素柱层析及凝胶过滤获得了有活性的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandiiOP)固氮酶复合体。聚丙烯酸胺凝胶电泳鉴定复合体的纯度为91％。Mo:Fe克原子含量比为1:20。吸收光谱在420 nm处有一个吸收肩,暴露于空气后,可见光谱区吸光度略有增加,加入Mg ATP后,在310nm处出现吸收肩。圆二色散光谱在360nm处有一负吸收峰,随滴定Mg ATP克分子当量增加,吸收值向负方向递增。328nm处荧光退偏振随 Mg ATP克分子当量增加而递增,两种光谱滴定曲线均在 ATP/复合体充分子比为2时达到饱和。     

固氮作用

<正>棕色固氮菌(Azorobacter。 vinelan dii)的固氮酶含有钼,它在N_2培养下需要钼,但在NH_3培养下不需要钼。本综述中讨论了有关固氮酶中钼的重要性质,特别是Fe一Mo辅因子和Mo辅因子的关系。用突变种和钼对固氮酶的调节研究了     

离体绿豆胚轴在吸胀过程中蛋白质合成与ATP水平及能荷值的关系

绿豆胚轴吸胀过程中 ATP 水平及能荷(E.C.)值的上升伴随着蛋白质合成速率的增加。用5×10~(-5)M 和5×10~(-4)DNP 处理后,组织中 ATP 水平及能荷值降低,同时也抑制了~3H-亮氨酸参入 TCA 不溶性蛋白质的量。并观察到 CCCP(1×10~(-3)M 和1×10~(-4)M)有类似作用。以0.2μg/ml 亚胺环己酮处理,蛋白质合成下降69%,ATP 和 E.C.都略有增加;用1μg/ml 和5μg/ml 处理,蛋白质合成接近停止(占总合成量的6—7%),ATP 水平稍有下降,E.C.值仍保持不变。用每毫升含1μg 和10μg 放线菌素 D 处理,使蛋白质合成分别降低23%和48%,而 ATP 水平及 E.C.值不受任何影响。这些结果表明绿豆胚轴吸胀初期,其蛋白质合成受 ATP 水平及能荷值的调节,而腺苷酸库和能荷变化都不受放线菌素 D 的影响。     

雌激素对兔子宫内膜细胞EGF受体和细胞周期的调控

 由受体放射配基结合分析证明家兔子宫内膜细胞的EGF受体Kd值为0.53nmol/L,每个细胞的最大结合容量为1.11×10~4结合位点。10~(-10)mol/L雌二醇处理24h,细胞的最大结合容量增至2.75×10~4结合位点数/细胞,而Kd值无明显变化,可是,当10~(-5)mol/L雌二醇处理24h,细胞的EGF受体结合率,DNA合成速度率均下降。G_0/G_1期细胞比值明显下降,而G_2+M期和S期细胞明显上升。     

ATP功能及固氮酶催化机理

一、引言固氮酶能够催化N_2及其它底物(N~-_3、N_2O,C_2H_2,HCN,RCN,RNC,H~ ,丙二烯、环丙烯)的还原反应,ATP水解反应以及Na_2S_2O_4氧化反应。固氮酶究竟是钼铁蛋白,还是由钼铁蛋白     

Mo-Fe-S模型化合物模拟甲基紫精-硝酸还原酶促反应的研究

对黄嘌呤氧化酶中甲基紫精-硝酸(MVH-NO_3~-)还原酶促反应所必须的活性组分研究表明:具有 MVH-NO_3~-还原活性的含钼因子与固氮酶铁铝辅因子(FeMo-Co)相类似,除 Mo 外还有 Fe 和 S 的参加。卢嘉锡蔡启瑞根据固氮酶钼活性位置的结构和功能,分别提出了具有独特见解的“福州模型”和“厦门模型”。它们都是含有 Mo、Fe、S 的原子簇化合物。根据该模型合成出的模型化合物与棕色固氮菌缺钼铁辅基的突变种 UW45的粗提物互补,显示了它们的乙炔还原乙烯和固氮的活性。本文报道用这些模型化合     

在有无结合态氮的培养条件下棕色固氮菌对钼的吸收和转化

在尿素中培养的棕色固氮菌,从培养液中吸收。~(99)MoO_4~-的量与N_2下培养的菌基本上是相同的。凝胶过滤实验指出,有尿素时掺入菌体内的~(99)Mo也主要与蛋白质结合,而不是以无机(99)MoO_4~-的状态存在。在尿素和N_2下生长的棕色固氮菌体内的。~(99)Mo-蛋白质可以用DEAE-纤维素柱层析区别开来。     

腺苷酸库及能荷变化与白菜种子萌发的关系

我们测定了大白菜种子萌发时 ATP、ADP、AMP 及E.C.值的变化。结果表明,干种子中 ATP 的含量很低,大量的是 AMP,E.C.值很低。吸胀1小时后 AMP 迅速转变成ATP,E.C.值急速地上升。吸胀2小时后 ATP 增加为干种子时的35倍多,E.C.值超过0.5。24小时仍未萌发的种子,其 ATP 含量比24小时内已萌发的种子低4倍,E.C.值也明显低。在3%O_2中萌发的种子内源 ATP 水平下降,只有将种子再转入空气继续萌发,ATP 恢复到对照(在空气中萌发)的水平时,发芽率才提高到76%。最初1至2小时在3%O_2中或在5×10~(-4)M DNP、1×10~(-5)M CCCP、5×10~3 M IAC 中浸种,ATP 的合成受到抑制,E.C.值也显著降低,其中尤以碘代乙酸处理为甚。实验表明种子萌发与 ATP 水平、E.C.及能库的大小有密切的关系。     

第二种固氮酶系统的确证与研究进展

生物固氮是由固氮微生物中的固氮酶系统催化的。棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)是一种自生固氮菌。许多研究表明:它含有人们所熟知的固氮酶系统。此系统由固氮酶(一种含Fe和Mo的蛋白)和固氮酶还原酶(一种含Fe蛋白)组成。固氮酶是一种分子量约245000的四亚基蛋白。它含有分子量约61000的α、β两种不同的亚基各两个,并含有4个4Fe-4S原子簇和2分子FeMo辅因子。固氮酶还原酶是一个分     

含铬固氮酶组分Ⅰ蛋白的纯化和特性(英文)

在含Mo固氮培养基中不能生长而在无Mo条件下可固氮生长的固氮菌 (AzotobactervinelandiiLipmann)突变种UW3 ,能在无Mo而含Cr的无氮培养基中生长。从菌体中分离得到的部分纯固氮酶组分Ⅰ蛋白含有Cr和Fe原子 (Fe/Mo/Cr为 11.6 0∶0 .41∶1.0 0 ) ,并能表达相当于棕色固氮菌野生型固氮菌MoFe蛋白对乙炔和质子还原的 70 %的活性。与从Mn中生长的UW3 菌体中所提取纯化的MnFe蛋白不同 ,这种含铬蛋白与MoFe蛋白 (α2 β2 )一样 ,是由两种亚基组成的四聚体。初步结果表明 ,这种含Cr蛋白可能是一种固氮酶组分Ⅰ蛋白。     

含铬固氮酶组分Ⅰ蛋白的纯化和特性

在含Mo固氮培养基中不能生长而在无Mo条件下可固氮生长的固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种UW3, 能在无Mo而含Cr的无氮培养基中生长.从菌体中分离得到的部分纯固氮酶组分Ⅰ蛋白含有Cr和Fe 原子(Fe/Mo/Cr为11.60∶0.41∶1.00),并能表达相当于棕色固氮菌野生型固氮菌MoFe蛋白对乙炔和质子还原的70%的活性.与从Mn中生长的UW3菌体中所提取纯化的MnFe蛋白不同,这种含铬蛋白与MoFe蛋白(α2β2)一样,是由两种亚基组成的四聚体.初步结果表明,这种含Cr蛋白可能是一种固氮酶组分Ⅰ蛋白.     

P15INK4B高表达对人黑色素瘤细胞G1/S进程的阻滞及与MAPK信号相关性之初探

利用TdR-N_2O同步法分别获得P15高表达的MLIK6和表达空载体的MLC2的M期细胞和G_1期细胞,~3H-TdR掺入结果显示,与对照组细胞MLC2相比,实验组细胞MLIK6从G_1期进入S期时间延长2h,并且掺入强度明显减弱,DNA合成被抑制。进一步观察了P15~(INK4B)对G_1/S相关调控蛋白的影响,在M期细胞释放8h(晚G_1期细胞)后,与对照组MLC2细胞相比,实验组MLIK6细胞中CyclinD1,CyclinE,Cdk4,C-Myc蛋白水平均降低。相反,P27~(KIP1)的表达却上升。同时探讨了MAPK信号在P15~(INK4B)阻抑A375细胞G_1/S转换中的作用与相关性,结果显示晚G_1期的MLIK6细胞中ERK1,ERK2水平变化不大,而具有活性的P-ERK1和P-ERK2均表现出下降。上述实验表明,P15~(INK4B)可能通过作用于G_1期相关的周期调节蛋白和抑制ERK1和ERK2活性,阻滞G_1/S转换与抑制DNA合成。