钙调素对细胞周期的调节

RC3细胞是一种用真核表达载体1~(CaM)转染NIH 3T3细胞建成的可调钙凋素(Calmodulin,CaM)高表达细胞模型。通过分子杂交及蛋白免疫印迹方法证实在地塞米松(Dexamethasome,DXM)作用下,RC3细胞可高表达CaM。CaM的过表达使G_1期细胞减少,S期细胞增加;CaM拮抗剂三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP)则使G_1期细胞增加,S期细胞减少。高表达CaM使细胞分裂指数提高,G_2期细胞减少,有丝分裂前期细胞增加,M中期细胞比例下降。而TFP处理则使分裂指数下降,G_2期细胞增加,M前期细胞减少,M中期细胞增加。实验结果表明CaM在G_1/S、G_2/M和M中期/M后期3个位点上对细胞周期进行调控;通过加速G_1至S期,G_2至M期和M中期至M后期的进程,使细胞倍增时间缩短,促进细胞增殖。本工作表明,RC3细胞作为CaM表达可调细胞模型,是研究细胞周期调控的有力工具。     

钙调蛋白的构效关系及其与药物的相互作用

钙调蛋白(calmodulin,CaM)作为环核苷酸磷酸二酯酸(PDE)的内源性活化因子,于六十年代后期由张怀耀首先发现,它是细胞内Ca~(2+)的重要受体,与Ca~(2+)结合后发生构象变化而激活,又调节着细胞内Ca~(2+)的浓度。它不具有酶的活性,却能通过激活细胞内广泛的酶谱,调控细胞的基本功能。二价阳离子竞争性地取代Ca~(2+)的结合后能影响CaM活性,组织内还存在有CaM的内源性抑制因子,竞争性地与CaM结合而抑制CaM的活性。CaM与靶酶的相互作用也能被很多药物所抑制,这或许与药物的作用机制有关。     

重金属离子对猪红细胞膜Ca~(2+)-ATP酶的作用

猪红细胞膜Ca~(2+)-ATP酶是一种钙调蛋白(CaM)依赖酶,其活力又依赖巯基的完整性。实验应用Ca~(2+)-ATP酶这一模型体系观察到重金属离子,Pb~(2+)、Cd~(2+)和Hg~(2+)都能替代Ca~(2+),激活CaM,从而激活Ca~(2+)-ATP酶;其最大刺激活力分别为85％、80％和30％,半刺激浓度分别为32、27和0.7μmol/L。当三种重金属离子的浓度增加时,则与Ca~(2+)-ATP酶的巯基结合,抑制酶的活力,Pb2~(2+)、Cd~(2+)和Hg~(2+)的半抑制浓度分别为370、440和2μmol/L。抑制作用为渐进性过程,而刺激作用为即时效应。抑制作用可为巯基化物,特别是二巯基化物所逆转。研究结果提示,CaM可能是重金属中毒最初作用的靶分子,而重金属中毒不仅使CaM“开关”失灵,还可能导致细胞内Ca~(2+)的调节全面失控。     

H_2S与Ca~(2+)互作提高黄瓜幼苗耐冷性

硫化氢(hydrogen sulfide,H_2S)是一种新型气体信号分子,钙离子(calcium,Ca~(2+))为重要的第二信使,两者在调控植物生长发育及多种逆境胁迫中分别起着重要作用。然而,H_2S和Ca~(2+)信号在调控植物耐冷性中的作用关系并不十分清楚。本研究针对以上问题以‘津优35号’黄瓜为试材进行研究,结果表明,低温胁迫可诱导H_2S信号的产生,且这种信号可被外源Ca~(2+)增强;低温胁迫可诱导Ca~(2+)信号转导相关基因CaM、CIPK5的mRNA表达,且外源H_2S能够上调低温下CaM、CIPK5的表达量;进一步研究发现,外源H_2S和Ca~(2+)可显著增强植株的抗氧化能力,减少活性氧积累,从而降低低温胁迫对黄瓜幼苗的损伤,且加入Ca~(2+)螯合剂乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)或钙调素拮抗剂氯丙嗪(chlorpromazine,CPZ)后,H_2S对黄瓜幼苗抗氧化能力的促进效应明显减弱,同样的,H_2S清除剂次牛磺酸(hypotaurine,HT)也会降低Ca~(2+)的作用。以上结果表明H_2S与Ca~(2+)信号间存在着复杂的联系,而且他们可以通过相互作用调控黄瓜幼苗的抗氧化系统,从而增强植株耐冷性。     

苄基异喹啉类化合物与钙调素相互作用的荧光光谱研究

 苄基异喹啉类化合物拮抗钙调素(CaM)并抑制依赖CaM的环核苷酸磷酸二酯酶(CaM-PDE)的活力;用荧光测定法可检测它们与钙调素的相互作用。 Ca~(2+)存在下蝙蝙葛碱(D_1)及其衍生物(D_(14))在激发波长340nm处最大发射波长分别为463和455nm,结合CaM后荧光量子产率增加两倍多。它们同CaM的结合均依赖于Ca~(2+)。 本文制备的丹磺酰基CaM(D-CaM)结合Ca~(2+)后荧光最大发射峰值兰移(518→508nm),荧光强度增加22％。在Ca~(2+)存在下小檗胺衍生物E_6能与CaM结合并淬灭Ca~(2+)-D-CaM荧光。 单苄基异喹啉类化合物86040、86045能淬灭CaM的酪氨酸残基的特征荧光。 实验表明,CaM结合D_(14)、E_6、86040和86045的kd值分别为1.3、1.8、9.5和15.7μmol/L,所观察的化合物与CaM的亲和力的大小与它们拮抗CaM,抑制CaM-PDE的酶活力相对应。     

粉防已碱与红细胞膜ATPase相互作用的研究

粉防已碱是一种新的钙调蛋白拮抗剂,专一性抑制人红细胞膜上依赖CaM的Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase。在较高浓度下,它也不同程度地抑制Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase基本活性、Na~+-K~+-ATPase和Mg~(2+)-ATPase的活性。 除CaM外,不饱和脂肪酸和有限水解均导致膜Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase的活化,所有这些活化作用被Tet在大约相同的浓度范围内抑制,表明Tet除与CaM结合外,也与膜Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase结合。 Tet具有抗抵渗溶血的性能,反映了拮抗CaM与药物的膜稳定性间存在相关性。     

红光对绿豆下胚轴线粒体Ca~(2+)积累、ATPase及NAD激酶活性的影响

绿豆下胚轴切段经红光处理后10min,其线粒体的Ca~(2+)积累下降15％,Ca~(2+)-ATPase 及 Mg~(2+)-ATPase活性也分别下降29％和10％,切段CaM含量增加近1倍。Ca~(2+)存在时,红光能促进线粒体NAD 激酶活性。说明Ca~(2+)-ATPase及一部分Mg~(2+)-ATPase可作为钙泵控制Ca~(2+)进入线粒体。     

Ca~(2+)在粟酒裂殖酵母细胞周期时相中的作用

以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)为研究材料,研究了Ca~(2+)在细胞周期时相中的作用。当外源Ca~(2+)浓度在0.5-20 mmol/L范围内,随Ca~(2+)浓度增加,细胞增殖速度加快,延滞期逐渐缩短。但SD-Ca（CaCl2省略）并不能终止Sch. pombe的细胞周期。采用缺氮对群体细胞进行同步化,并以EGTA 螯合培养介质中低浓度的Ca~(2+),Sch. pombe 细胞增殖被完全抑制,细胞流式法测定结果表明：细胞周期被终止在G1期。分析认为Ca~(2+) 对Sch. pombe 细胞增殖是必不可少的,外源Ca~(2+)在G1期向S期转化过程中起着关键性的作用。     

稀土元素Pr~(3+)、Nd~(3+)对蚕豆(Vicia feba)叶片原生质膜上Ca~(2+)·Mg~(2+)-ATPase活性的影响

本文介绍用二相分配法制备蚕豆叶片原生质膜上的Ca~(2+)·Mg~(2+)-ATPase,用以研究镧系,稀土离子对此酶活性的影响。初步证实Pr~(3+)、Nd~(3+)对依赖于CaM的以及不依赖于CaM的蚕豆叶片原生质膜上Ca~(2+)·Mg~(2+)-ATPase活性的抑制不是CaM专一的。     

高等真核细胞蛋白质磷酸化与细胞周期G1向S期过渡的调控

真核生物细胞周期运行涉及三个时期过渡(Phase transitions)的调控;1.G_0向G_1期过渡,2.G_1向S期过渡,3.G_2向M期过渡等的调控。近年来,对调控G_1向S期过渡的生化事件的研究结果表明,转录和转录后水平上的调控机制在其中起重要作用。通过磷酸化与去磷酸化而参与G_1向S期过渡调节的蛋白主要有:pRB(retinoblastoma gene product,视网膜母细胞瘤基因蛋白),p107(pRB related pro-tein,pRB相关蛋白),p53,RPA(replicati一     

乌头碱对依赖钙调蛋白的环核苷酸磷酸二酯酶的拮抗作用

钙调蛋白(CaM)是生物体中一种多功能调节蛋白。已发现多种药物如吩噻嗪、局部麻醉剂、Ca~(2+)通道阻断剂、化合物48/80、长春花生物碱以及粉防己碱和小檗胺等都对CaM有拮抗作用,抑制CaM活化的环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)、红细胞膜Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase等的活性。但是上述药物中,除后三种外,其余的多为合成药。为了进一步从分子水平上探     

钙调蛋白的结构与功能(下)

四、钙调蛋白的构象 CaM分子本身无酶的活性,在无Ca~(2+)情况下,也无生物活性。自从1973年Teo等人鉴定它是一种钙结合蛋白以来,人们用各种物理、化学手段发现Ca_(2+)的结合引起蛋白强烈的构象变化,Ca~(2+)·CaM复合物才能与靶蛋白结合形成一个活性全酶,因此CaM构象问题是其调控机制的中心问题。 1.研究构象的方法 (1)圆二色性与紫外差谱的研究 Klee测定CaM的远紫外CD谱,在EGTA存在下,椭圆度[Q]_(221nm)=-11500度·cm~2/分·克分子,相当35％螺旋,50％无规卷曲,20％β-折迭。而在0.3mM Ca~(2+)存在下,[Q]_(221nm)增加约20％,相当于α螺旋增加5—8％,无规卷曲相     

牛脑Ca~(2+)/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ的纯化和鉴定

通过一系列层析法,首次从牛脑纯化得到胶凝电泳匀一的Ca~(2+)/CaM PKⅡ。凝胶过滤法测定全酶分子量为550kD,SDS-PAGE法测定亚基分子量为55kD,推测牛脑Ca~(2+)/CaM PK Ⅱ由十个相同的亚基组成。该酶活性绝对依赖于Ca~(2+)和CaM,以63kD PDE同工酶为底物,其AC_(50)分别为0.85μmol/L和0.18μmol/L;以酪蛋白为底物,其AC_(50)分别为0.22μmol/L和0.06μmol/L。牛脑Ca~(2+)/CaM PK Ⅱ旣能催化63kD PDE同工酶等多种蛋白或酶磷酸化,又能进行自身磷酸化。该酶催化63kD PDE同工酶最大磷酸参入量为1mol/mol亚基。磷酸化型63kD PDE同工酶的Ca~(2+)的AC_(50)高于非磷酸化型。     

马兜铃酸与钙调素相互作用的荧光光谱分析——一种非钙离子依赖性钙调素拮抗剂的研究

本文报道我室近来发现的一种天然钙调素(Calmodulin,CaM)拮抗剂马兜铃酸(Aristolochic acid,ATA)的研究。利用丹磺酰标记的CaM(D-CaM)对马兜铃酸的研究表明,马兜铃酸是一种非钙离子依赖性钙调素拮抗剂,实验测得马兜铃酸与D-CaM结合的解离常数,有Ca~(2+)和无Ca~(2+)情况下分别为70μmol/L、77μmol/L。两种状况下马兜铃酸对D-CaM荧光强度的抑制分别为40％、41％。暗示马兜铃酸主要作用于CaM上Ca~(2+)诱导的疏水区之外。三氟啦嗪(TFP)引起的D-CaM荧光增强可被马兜铃酸明显降低,而TFP在达到马兜铃酸浓度的15倍以上仍未能逆转马兜铃酸对D-CaM荧光强度的降低作用,这为马兜铃酸主要作用于CaM上Ca~(2+)诱导的疏水区以外提供了又一佐证。     

钙调素(CaM)在中体上的分布及参与胞质分裂的调控

钙调素(CaM)是细胞内Ca~(2+)的主要受体,在细胞增殖、分化、凋亡、迁移等过程中都发挥着重要的调控作用。采用GFP标记技术,我们观察了GFP-CaM在胞质分裂期HeLa细胞中的动态分布,发现在胞质分裂后期,GFP-CaM与中体紧密相连。抑制CaM的活性会阻止中体的解聚。进一步观察发现,CaM与γ-微管蛋白共分布在中体两侧,抑制CaM活性也会引起中体γ-微管蛋白解离的延迟。本实验结果说明分布在中体上的CaM很可能通过影响中体微管的稳定,参与调控胞质分裂的完成。     

IAA和Ca^2＋对绿豆下胚轴切段伸长的影响及其相互关系

0.01 mmol/L IAA可以明显促进绿豆下胚轴切段的伸长,≤0.1 mmol/L CaCl_2也可促进其伸长,但当浓度为0.5 mmol/L时则有抑制作用。低浓度CaCl_2尚能加强IAA对绿豆下胚轴切段伸长的促进作用。Ca~(2+)专一性螯合剂EGTA、Ca~(2+)竞争性抑制剂LaCl_3及CaM拮抗剂CPZ均能抑制IAA促进绿豆下胚轴切段伸长的作用。增加培养介质中CaCl_2浓度可以逆转LaCl_3的抑制效应。     

钙离子调控樟芝深层发酵无性产孢及其分子机制

樟芝是原产于台湾的珍稀药用真菌,具有保肝、抗癌等活性。樟芝在深层发酵过程中能够产生大量无性孢子,但是目前对樟芝无性产孢的影响因素及其分子机制尚不明确。本研究报道了樟芝发酵培养基中Ca~(2+)浓度能够有效调控樟芝无性产孢的现象;采用双向电泳(2-DE)技术,对不添加Ca~(2+)培养(对照)的菌丝体、添加1 mmol/L Ca~(2+)培养(促进产孢)的菌丝体及添加200 mmol/L Ca~(2+)培养(抑制产孢)的菌丝体进行差异蛋白质组学分析,鉴定了参与Ca~(2+)/钙调素信号通路的CaM蛋白和HSP90蛋白,以及参与FluG调控产孢信号通路的AbaA蛋白;进一步通过生物信息学分析,预测了Ca~(2+)/钙调素和FluG介导的樟芝无性产孢信号通路模型图;采用实时定量PCR(RT-qPCR)技术,对该通路上23个功能基因的转录水平进行了分析,发现了受Ca~(2+)调控最为灵敏的7个产孢相关功能基因:crz1、hsp90、flbB、brlA、abaA、wetA及fadA。本研究结果为解析樟芝无性产孢机制提供了实验依据。     

Zn^2＋对植物光系统Ⅱ的影响及与钙调素的关系

研究发现2.0mmol/L Zn~(2+)对白兰瓜幼苗离体叶绿体PS Ⅱ电子传递,如DCIP光还原和光合放氧及叶绿素a荧光有抑制作用,而这种抑制作用能分别被外加的Ca~(2+)(10mmol/L)和CaM(10μg/ml)所逆转。同时还发现CaM拮抗剂CPZ对叶绿素a荧光具有抑制作用,并且这种抑制能被外源CaM所逆转。通过PDE法证实了CaM在PS Ⅱ中的存在。因此,我们认为Za~(2+)对植物光合作用的影响与CaM有关,而且Zn~(2+)对PS Ⅱ电子传递的抑制很可能是通过CaM来实现的。     

若干蝙蝠葛碱衍生物对人红细胞膜Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase活力的影响

本文测定了数种蝙蝠葛碱衍生物对钙调素(CaM)激活的人红细胞膜Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase活力的影响。结果表明,这些化合物对该酶都有不同程度的抑制作用,其机制表现为竞争性抑制,过量的CaM能完全逆转这些化合物所引起的抑制。当Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase被胰蛋白酶(trypsin)限制性酶解完全活化后,其活力不再受CaM激活,但仍被这些化合物所抑制。     

钙调蛋白的分布

钙调蛋白(Calmodulin.简写CaM),自从作为磷酸二酯酶的Ca~(2+)依赖性激活蛋白,被发现以来.现在已清楚CaM还是各种Ca~(2+)依赖性酶系的激活因子。据报道,在哺乳动物的各种组织以及蛙卵、章鱼、海胆卵、蚯蚓、扇贝、海葵、海蕈、藻类、霉菌、粘菌、四膜虫、大麦、人参、大豆、菠菜中都分离到了CaM或类CaM蛋白。显然CaM的广泛分布和作用是与其特有的多功能性分不开的。然而各种CaM的氨基酸组