miR-505-3p对GT1-7细胞株基因表达谱的影响

目的了解微小RNA 505-3p(miR-505-3p)对下丘脑GnRH神经元GT1-7稳转细胞株表达谱的影响。方法用慢病毒转染GT1-7细胞获得稳定表达miR-505-3p的细胞株,感染实验分为3组:空白对照组(未经处理的GT1-7细胞),阴性对照组(感染pLenti6.3-nc空病毒),实验组(感染pLenti6.3-miR-505-3p病毒)。采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术检测稳定细胞株中miR-505-3p的表达丰度,并进一步利用芯片检测对照组和实验组细胞的表达谱结合生物信息学方法探寻差异表达基因。采用GO分析和Pathway分析差异表达基因,解析miR-505-3p的功能。结果在稳定表达miR-505-3p的GT1-7细胞中,165个基因的表达量变化在2倍以上,这些基因主要参与细胞粘附、GTP分解代谢、神经系统发育等生物过程。结论 miR-505-3p可能通过影响下丘脑GnRH神经元中相应靶基因的表达调控细胞粘附、GTP分解代谢、神经系统发育等生物过程,和间隙连接、轴突导向和胃酸分泌等信号通路。     

神经胶质瘤中前体mRNA可变剪接研究进展

胶质瘤是最常见的脑肿瘤,前体mRNA可变剪接可能在不同类型胶质瘤的发生、恶化以及侵入中发挥作用.参与调控胶质瘤中前体mRNA可变剪接的因素包括顺式元件如内含子剪接抑制序列(ISS)、外显子剪接抑制序列(ESS)等,反式因子包括SRp55、SC35、SF2/ASF、PTB等剪接调节因子.近期的研究进展发现,有多种与胶质瘤相关的基因受到可变剪接的调控,包括肿瘤抑制因子、肿瘤促进因子、酶、受体、离子通道等.因此,研究胶质瘤中的前体mRNA可变剪接将有利于深入了解胶质瘤发生的分子机制、有利于为胶质瘤的早期诊断和治疗提供新的潜在靶点.     

细胞信号转导与可变剪接调控

大多数真核基因能够发生可变剪接,其调控对于生理和病理状态下细胞功能的实现至关重要,而异常可变剪接则可导致多种疾病。虽然已知可变剪接能够在转录后水平调节基因表达,然而目前仍不清楚特定的可变剪接模式是如何被调控的。越来越多的研究发现细胞信号和外界环境刺激能够调控靶基因的剪接模式,并且已发现一些与可变剪接调控有关的信号转导通路,而后者能够通过修饰剪接因子进而改变剪接因子的亚细胞定位或者活性,从而实现对靶基因可变剪接模式的调控。由细胞信号转导通路所构成的网络能够灵活多样地调控基因剪接,一条信号通路可调控多个基因剪接,而多条信号通路也可调控同一基因剪接,对于理解信号转导过程的分子机制具有重要意义。     

PTB蛋白:一种调控肿瘤代谢的RNA可变剪接调节因子

多聚嘧啶区结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein,PTB或hnRNP I)是一种在细胞内部参与mRNA代谢过程的蛋白质。PTB蛋白可结合于核酸分子上富含嘧啶碱基的序列,对mRNA前体的剪接进行调控。如在部分肿瘤细胞中,PTB的表达量升高可对肿瘤代谢过程中关键的丙酮酸激酶M(pyruvate kinase M,PKM)基因的表达进行调控,通过抑制PKM基因的可变剪接的方式上调PKM2(pyruvate kinase M2,PKM2)的表达,进而强化肿瘤细胞的有氧糖酵解过程并促进肿瘤的发展。本文结合PTB蛋白的结构及其在PKM可变剪接过程中的调节机制,简要综述了PTB蛋白对肿瘤代谢的调控作用。     

MiR-324-5p可能通过靶向淀粉样前体蛋白抑制棕榈酸诱导的3T3-L1脂肪细胞凋亡

miRNAs是一种非编码的小RNA,通过靶向mRNA的3′UTR调控基因的转录后翻译。为明确miR-324-5p对棕榈酸诱导的3T3-L1脂肪细胞凋亡的作用和机制,体外培养3T3-L1脂肪细胞,利用棕榈酸诱导细胞凋亡的同时过表达或抑制miR-324-5p,通过Annexin-V/FITC染色、RT-qPCR等方法检测miR-324-5p对3T3-L1脂肪细胞凋亡的作用。通过在线软件预测miR-324-5p的靶基因并进行验证。结果显示,过表达miR-324-5p能够显著抑制凋亡相关基因BCL-2相关X蛋白(BCL2-associated X protein, Bax)和胱天蛋白酶3(caspase3)的表达水平(P0.05);而抑制miR-324-5p后能够显著促进这些基因的表达(P0.05);靶基因预测及验证结果表明,miR-324-5p能够显著降低淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)的表达水平(P0.05)。本研究认为,miR-324-5p可能通过靶定APP抑制棕榈酸诱导的3T3-L1脂肪细胞凋亡。     

miR-17-5p靶向自噬相关蛋白ATG7调控巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染作用的研究

目的:通过研究miR-17-5p对自噬相关基因ATG7的靶向调控机制和对细胞自噬的作用,探究miR-17-5p在结核分枝杆菌介导的自噬途径中的作用及其机制。方法:生物信息学分析得到miR17-5p的靶基因ATG7,通过成功构建载体ATG7野生型(p Mir GLO-ATG7-3'UTR-WT)和突变型,利用双萤光素酶报告系统、Western blot验证miR-17-5p和ATG7的靶向关系,同时构建结核分枝杆菌(H37Ra)感染的人源性THP-1巨噬细胞模型,将做不同处理的细胞分为三组:miR-17-5p mimics、miR-17-5p inhibitor、miR-17-5p nc。通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测H37Ra感染对miR-17-5p表达量的影响,并且进一步通过Western blot、免疫荧光观察检测LC3蛋白的表达量和自噬小体的数量。结果:MTB感染能够引起miR-17-5p的下调,随着感染复数的增加有明显的降低。而生物信息学预测结果显示miR-17-5p与ATG7具有靶向性,双萤光素酶报告实验、Western blot验证miR-17-5p能够和ATG7靶向结合,并对其进行负调控。进一步通过Western blot、免疫荧光观察发现miR-17-5p mimics组LC3Ⅱ的表达下调,自噬小体表达降低,而miR-17-5p inhibitor组相反。其中对H37Ra感染组与未感染组之间比较,ATG7和LC3Ⅱ蛋白表达明显增强。结论:miR-17-5p直接靶向结合ATG7 3'UTR抑制自噬,在巨噬细胞抗MTB过程中发挥作用。     

miR-24-3p对宫颈癌细胞增殖与迁移的作用及机制研究

该文探讨了miR-24-3p对宫颈癌细胞增殖和迁移的促进作用及其机制。采用miR-24-3p抑制剂下调宫颈癌细胞中miR-24-3p的表达后,通过MTT、Transwell实验和Western blot检测细胞增殖、迁移和PCNA蛋白水平;采用生物信息学方法预测miR-24-3p的靶基因并进行功能注释和筛选;双荧光素酶报告实验和Western blot验证靶基因类血管动蛋白-2(angiomotin-like 2,AMOTL2),并通过siRNA抑制AMOTL2检测其对宫颈癌细胞迁移的影响。结果显示,下调miR-24-3p能抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移能力并减少PCNA蛋白表达;其靶基因主要存在细胞与细胞连接组分中,显著富集于蛋白激酶活性分子功能、蛋白质自身磷酸化生物学过程和癌症中microRNA信号通路;miR-24-3p能靶向负调控最佳靶基因AMOTL2,下调AMOTL2可促进宫颈癌细胞CaSki的迁移。总之,miR-24-3p可调控多靶基因参与多个生物学过程和多条信号通路,在宫颈癌中可促进细胞增殖且通过靶向AMOTL2促进迁移。     

基于PCR 技术的人脑基因可变剪接差异性研究

目的:对人脑的基因可变剪接位点差异性进行分析。方法:通过RNA-Seq得到的转录组数据,分析推测出在不同年龄的7对样本的大脑前额叶皮层(prefrontal cortex,PFC)表达的某些基因具有可变剪接位点的差异性;为验证此推测,设计7对引物,提取不同年龄样本的RNA,通过反转录合成cDNA,采用PCR技术扩增目的序列。结果:在已剪接和(或)未剪接产物预期片段处有明显的条带。结论:通过Quantity One软件分析后,确定在不同年龄间存在可变剪接差异。基于PCR技术的基因可变剪接分析对RNA-seq数据集的预测结果进行验证是一种有效新颖的PCR新应用。     

癌症与可变剪接

可变剪接在发育、分化和癌症等过程中发挥着非常重要的作用。近年来,越来越多的研究表明可变剪接与癌症有着密切的关系,许多癌症相关基因受可变剪接调控。由于癌症特异性的剪接变体具有明显的诊断价值,使得对癌症与可变剪接的研究成为热点。简要概述了癌症相关基因的可变剪接、可变剪接变体的鉴定方法、可变剪接与癌症治疗等研究进展。     

糖原合酶激酶-3β调节9G8介导的tau外显子10的可变剪接

Tau外显子10的可变剪接产生含3个微管结合片段或4个微管结合片段的tau蛋白变异体(3R-tau和4R-tau).正常成年人脑中,3R-tau和4R-tau的表达水平相近,这种比例对于维持正常脑功能非常重要.9G8是剪接因子SR蛋白家族中的成员之一,参与多种基因转录产物的剪接调控,它的功能和活性受磷酸化高度调节.糖原合酶激酶(GSK)-3β是体内重要的蛋白激酶,已有研究显示它参与调节tau外显子10的可变剪接.利用微型tau基因研究了9G8在不同细胞系中对tau外显子10可变剪接的作用以及GSK-3β对9G8介导的tau外显子10可变剪接的影响.结果显示,过表达9G8抑制tau外显子10的表达,GSK-3β在体外可催化9G8的磷酸化,GSK-3β可以被9G8从大鼠脑匀浆中沉降(pull-down),提示它们之间可能存在相互作用,在培养的细胞中,GSK-3β与9G8之间存在共定位,过表达GSK-3β抑制9G8对外显子10可变剪接的作用,有利于4R-tau的产生.这些结果显示GSK-3β影响9G8介导的tau外显子10的剪接.     

真核基因可变剪接研究现状与展望

mRNA前体(pre-mRNA)的可变剪接是控制基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制,是功能基因组时代的研究重点之一。生物信息学在识别可变剪接基因及其结构、分析可变剪接的功能和调控方式等方面具有重要作用。除了耗时的实验研究,识别可变剪接基因及其结构主要通过EST、mRNA等转录数据与基因组序列进行比对,获得同一基因的不同结构方式。分析蛋白质产物可对可变剪接的功能进行预测;潜在调控元件的统计分析则可为可变剪接调控机制的研究提供必要的数据。转录数据的时空信息以及比较基因组学对理解可变剪接信息的精确调控将提供重要资料。可变剪接及其调控机制的深入研究将为基因组和蛋白质组之间的对接提供重要的桥梁。     

中华猕猴桃基因组可变剪接事件鉴定及分析

可变剪接使一个基因能产生多种m RNA成熟体,极大地增加蛋白多样性.采用中华猕猴桃基因组数据做参考数据,利用中华猕猴桃叶片和果实3个不同发育时期(未成熟、半成熟和成熟期)的转录组数据,从中华猕猴桃基因组(39040个基因)中共鉴定出11651个基因(占总基因数的29%)对应的32180个可变剪接事件.在可变剪接不同类型中,内含子保留类型的发生频率最高,占50%以上;3′可变位点类型频率约为5′端可变类型的2倍.GO富集分析结果表明,可变剪接的基因主要富集于酶调控及核苷酸结合相关功能的GO类别中,而组织特有可变剪接基因功能富集热点与组织的重要功能关联,叶片多为肌动蛋白及微管相关;未成熟果实与双组分信号系统相关;半成熟果实多与磷脂合成过程相关;成熟果实多与信号传递过程相关.另外,55.6%的维生素合成相关基因发生可变剪接事件,显著高于基因组水平的29.6%,暗示着可变剪接参与维生素合成相关基因代谢过程中的重要作用.通过对中华猕猴桃全基因组可变剪接的分析,为解析中华猕猴桃基因组及进一步开展相关分子育种工作提供依据.     

拟南芥不同组织基因表达及可变剪接差异分析

可变剪接是转录后重要的基因表达调控方式,也是转录组和蛋白质组多样性的重要来源. 近年来随着拟南芥、水稻、玉米等植物转录组测序的完成,研究人员发现植物pre-mRNA可变剪接的发生与组织分化、发育等生物学过程密切相关. 本工作基于GEO数据库的RNA-seq数据,使用高通量测序数据分析常用的Trimmomatic、Salmon、DESeq2、SUPPA2等工具,识别了拟南芥的种子、根、叶、花、花梗、节间、长角果共7种组织的表达基因和可变剪接事件,以及7种组织间的差异表达基因和差异可变剪接事件,并以叶和花为例展示了相应的生物学功能分析. 该工作系统地研究了拟南芥基因表达和可变剪接发生的组织特异性,有助于进一步阐明植物基因组的基因表达调控机制.     

SRp38基因在小鼠视网膜细胞中的表达以及对GluR-B小基因可变剪接的调控

SR蛋白在前体mRNA可变剪接调控中发挥重要作用.SRp38作为一种新近发现的具有神经及生殖组织特异性的SR蛋白,能够调控一些在神经组织中起重要作用的基因(如GluR-B,Trk-C,NCAML1等)的前体mRNA可变剪接,同时还可以在有丝分裂M期及热休克时抑制前体mRNA剪接的发生.利用Western blot以及免疫组织化学方法研究了SRp38蛋白在小鼠视网膜中的表达以及分布情况,结果显示,SRp38蛋白在视网膜中的表达具有区域特异性,在外网层、内核层、内网层以及节细胞层中均有表达,而在外核层无表达.对分离培养的小鼠视网膜细胞进行免疫双标记分析的结果表明,SRp38蛋白在视杆-双极细胞的胞体、轴突、树突中表达.通过瞬时共转染以及RT_PCR分析,发现在R28细胞中,SRp38过表达可以促进GluR-B小基囚Flip亚型的剪接.结果提示SRp38蛋白可能通过调控小鼠视网膜内前体mRNA可变剪接、进而在小鼠视网膜功能中发挥重要作用.     

秀丽隐杆线虫肠发育过程中的基因表达和可变剪接动态时序分析

本工作从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取了秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)自胚胎分离的120 min到分离后480 min共5个时序点(T0、T1、T2、T3、T4)的10个肠组织样本的RNA-seq测序数据,质控后平均读段数1.3×10⁷;构建了秀丽隐杆线虫肠组织发育过程中的基因表达矩阵(20191/基因数×10/样本数),识别了不同时序点间的差异表达基因;建立了每个时序点的可变剪接图谱,并识别了不同时序点间的差异可变剪接事件。结果表明,随着原肠形成的进行,源于内胚层的肠组织中大量基因的表达量上调,保证了原肠运动过程中细胞大量增殖的精准调控。可变3′在肠组织5个时序点中的平均占比最高,外显子跳跃、可变5′、内含子保留的平均占比相近。相较其他4个时序点,T1时序点的可变剪接丰度最大,表明可变剪接在原肠运动起始阶段有着重要的调控作用。肠组织增殖期的起始阶段(T0)与增殖期后期(T3)和型态形成期(T4)间的差异可变剪接事件丰度较高,表明部分基因通过形成不同的异构体参与秀丽隐杆线虫肠发育调控。...     

miR-490-3p通过靶向调控TGFBR1抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭

目的:以非小细胞肺癌A549细胞为模型,探讨miR-490-3p在肺癌发生发展过程中的作用及其调控机制。方法:通过miRBase数据库获得miR-490-3p序列,设计miR-490-3pmimics并转染A549细胞,CCK8、细胞划痕及Transwell实验分别检测miR-490-3p过表达对A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;使用miRwalk在线工具预测miR-490-3p可能的调控基因,通过实时荧光定量PCR及Western印迹对候选调控基因进行筛选,最后通过双萤光素酶报告基因实验验证miR-490-3p与调控基因之间的靶向关系。结果:过表达miR-490-3p可显著抑制A549细胞的增殖、侵袭和迁移能力;在预测的miR-490-3p候选靶基因中,选择与细胞增殖、迁移等表型相关的RASAL2、TGFBR1、PAPPA、HMGA2、TGFA靶基因进行实时荧光定量PCR及Western印迹筛选,结果仅TGFBR1基因在mRNA和蛋白水平的表达与miR-490-3p水平呈负相关,且双萤光素酶报告实验证实miR-490-3p可直接与TGFBR1的3'-UTR结合并抑制其表达。结论:miR-490-3p通过靶向调控TGFBR1的表达抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖和侵袭。     

miR-186-5p在酒精诱导的心肌细胞中高表达并通过靶基因XIAP调控细胞凋亡水平

目的:证实酒精可诱导AC16心肌细胞凋亡及其与酒精浓度和作用时间的关系,研究不同浓度酒精干预下AC16心肌细胞中miR-186-5p与X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达水平以及心肌细胞凋亡水平的改变,探究miR-186-5p以XIAP为靶基因调控酒精诱导的心肌细胞凋亡。方法:流式细胞术检测细胞凋亡水平,Western blot、实时定量PCR技术分别在蛋白质及基因水平检测细胞miR-186-5p与XIAP表达水平的变化,双萤光素酶报告基因靶基因荧光检测miR-186-5p与XIAP的靶际关系。结果:酒精诱导AC16心肌细胞发生凋亡,且与酒精浓度及作用时间呈正相关;酒精摄入上调AC16心肌细胞中miR-186-5p表达,下调XIAP表达; miR-186-5p参与酒精诱导的AC16心肌细胞凋亡过程,XIAP抑制酒精诱导的AC16心肌细胞凋亡; miR-186-5p以XIAP为靶基因调控酒精诱导的心肌细胞凋亡。结论:AC16心肌细胞经过酒精处理后,细胞的凋亡水平升高,并且随着酒精作用浓度和作用时间的延长,凋亡水平进一步升高;酒精处理后心肌细胞中miR-186-5p表达量上调,XIAP表达量下调,miR-186-5p以XIAP为靶基因,调控酒精处理后心肌细胞的凋亡。     

丙酮酸激酶前mRNA可变剪接的调控在肿瘤代谢中的作用和意义

丙酮酸激酶是糖酵解的关键酶之一,丙酮酸激酶m基因前mRNA(pre-mRNA)通过可变剪接产生M1和M2型两种丙酮酸激酶异构体,2种异构体的选择性表达决定肿瘤细胞的代谢表型,改变肿瘤细胞的增殖和生长。因此,调控丙酮酸激酶可变剪接,对于控制肿瘤细胞的生长代谢十分重要。研究发现,核不均一核糖核蛋白(hnRNP)A1/A2及多聚嘧啶结合蛋白(PTB,又称hnRNPⅠ)具有调控丙酮酸激酶前mRNA可变剪接的作用,并且致癌转录因子c-Myc与hnRNP A1/A2及PTB在肿瘤细胞中的过表达密切相关。我们结合相关研究进展,简要综述丙酮酸激酶可变剪接调控机制。     

miR-129-5p调节小鼠乳腺上皮细胞内Igf-1的表达

MicroRNAs(miRNAs)是一类大约22个核苷酸的非编码RNA.它能通过调控生长因子表达,引发肿瘤形成、细胞增殖和组织器官发育.本文通过构建miR-129-5p靶基因序列的双荧光素酶报告载体分析了miR-129-5p与靶基因之间的关系,应用脂质体转染技术和实时荧光定量技术观察了miR-129-5p在小鼠乳腺上皮细胞中的表达量及其变化,通过CASY细胞活力仪检测转染后的细胞增殖与活力变化,采用Western 印迹方法检Igf-1的变化.结果表明：miR-129-5p在小鼠乳腺青春期表达最高,成功构建了Igf-1基因 3′UTR荧光素酶报告载体, miR-129-5p抑制其荧光素酶活性（P <0.01）,转染抑制子后miR-129-5p表达降低（P < 0.01）,胰岛素样生长因子（Igf-1)表达增强（P <0.05）,细胞增殖和活力增强（P <0.01）,结果提示：miR-129-5p可能通过抑制靶基因蛋白Igf 1的表达,进而抑制小鼠乳腺上皮细胞增殖和活力.     

可变剪接调控因子SRSF2的研究进展

RNA剪接是指从mRNA前体中去除内含子、连接外显子形成成熟mRNA的过程。由于选择不同的剪接位点,可变剪接控制着从单一前体mRNA生成多种成熟mRNA的过程,因此是真核生物中转录后调控基因表达和决定蛋白质多样性的重要层次。SR蛋白家族是参与调控可变剪接的一类重要的剪接因子。SRSF2是SR蛋白家族的一员,具有经典的SR蛋白结构域。SRSF2不仅能够调控可变剪接,还能调控基因的转录过程,在维持胸腺、骨髓等造血系统的正常发育以及维持肝脏代谢稳态中是非常关键的调控因子。大量的研究表明:SRSF2的突变与骨髓增生异常综合征等造血系统疾病密切相关。本文总结了SRSF2最近的研究进展,以期对SRSF2在体内的功能有更全面和深入的理解,并为相关疾病的研究和治疗提供一定的思路。