抗克伦特罗单链抗体表达载体的构建与鉴定

为构建克伦特罗(Clenbuterol, CBL)单链抗体(scFv)表达载体, 实现其在大肠杆菌中的表达。以pCANTAB5E- CBL质粒为模板, 扩增CBL的scFv基因, 与pPICZaA载体重组, 然后以重组质粒pPICZaA-scFv为模板扩增scFv及其相连的6 个组氨酸(6×His)片段, 再与载体pBV220连接, 转化大肠杆菌DH5a, 阳性克隆质粒经酶切和PCR鉴定后进行目的片断的序列测定。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体, 并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用竞争ELISA检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒pBV220-scFv含有插入片段, 与原序列的同源性达99.8%。重组蛋白的分子量接近37 kD, 能够被抗His标签单克隆抗体特异性识别且可被游离的CBL竞争性抑制, IC50值为4.55 ng/mL。这说明我们成功构建了重组质粒pBV220-scFv并实现了其在大肠杆菌中的表达, 为进一步进行CBL免疫法快速检测奠定了一定的基础。     

EB病毒核抗原1羧基端的原核表达、纯化及其免疫学特性

为进一步研究EB病毒核抗原 1(EBNA1)的功能及提高EB病毒 (EBV)相关疾病辅助诊断的特异性 ,对EBNA1基因 3′端的部分片段进行了原核表达、纯化并初步研究其免疫学特性 .采用PCR法扩增了EBNA1基因编码区 ,经酶切鉴定、序列分析后 ,将其 3′端 5 73bp片段克隆至原核表达载体pET30a中 ,得到重组质粒pET30a SS5 80 .该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3)感受态细胞并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达出分子量约 2 5kD的融合蛋白 (2 5 kDEBNA1) .该蛋白以包涵体和可溶形式存在 ,均可用Ni2 + 离子亲和柱纯化 .Western印迹结果显示 ,该蛋白能与鼻咽癌 (NPC)病人血清发生特异性反应 .纯化的 2 5kDEBNA1蛋白免疫BALB c小鼠后 ,经ELISA检测获得了高效价的多克隆抗体 .免疫印迹和间接免疫荧光结果显示制备的免疫小鼠血清能够与HeLa细胞中瞬时表达的EBNA1蛋白发生特异性反应 ,且特异性优于鼻咽癌病人血清 .以上结果表明成功构建了EBNA1羧基端的原核表达质粒 ,并在大肠杆菌中高效表达了 2 5kDEBNA1蛋白 ,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性     

Epstein-Barr病毒包膜糖蛋白gp85的原核表达

目的:利用大肠杆菌BL21诱导表达GST-gp85融合蛋白,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:通过PCR反应从EB病毒转染的绒猴淋巴细胞系B95-8细胞中获得了gp85BXLF2基因,将此基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-5T,得到阳性克隆pGEX5T-85。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物经SDS-PAGE分析、尿素变性、复性和亲和层析纯化,并用初步纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠。结果:SDS-PAGE可见在相对分子质量约100000处有蛋白条带,Western印迹表明该蛋白可与免疫的BALB/c小鼠血清及鼻咽癌血清起特异性反应。结论:在大肠杆菌细胞中成功表达了GST-gp85融合蛋白,该蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。     

人血清Q型对氧磷酶在大肠杆菌中的表达

目的:应用大肠杆菌原核表达系统高效表达人血清Q型对氧磷酶(PON1)。方法:从pBlueScript-PON1重组质粒中通过PCR扩增得到了人PON1基因,将其亚克隆至原核表达载体pBV220中,构建了重组表达质粒pBV220-PON1,转化大肠杆菌,获得表达菌株。结果:rhPON1重组蛋白以不溶形式存在于包涵体中。凝胶扫描分析表明,重组蛋白表达量约占菌体总蛋白的18%。包涵体经分离、变性、复性等步骤处理后,产物未显示酶活性。结论:原核表达的rhPON1以包涵体形式存在,实现了人PON1在大肠杆菌中的高效表达。     

用重组痘苗病毒感染动物细胞表达的Epstein-Barr病毒膜抗原检查IgA/MA抗体

用EB病毒膜抗原基因重组的痘苗病毒感染动物细胞,其细胞表面可表达EB病毒膜抗原,以此膜抗原作为诊断抗原检测血清中IgA/MA抗体,明显优于常用的B95-8细胞表面膜抗原,从而为研究人群血清抗体反应与鼻咽癌的关系,为鼻咽癌的诊断和普查开辟了新的途径。     

中国人肥胖基因克隆及其原核表达载体的构建

为了探讨人肥胖（obesity,OB）基因的生理和病理意义,利用逆转录-聚合酶链式．反应（RT-PCR）方法,从中国汉族成人腹膜后脂肪组织总RNA中扩增出肥胖基因编码区序列（cDNA）．定向亚克隆pUC19质粒,克隆的OBcDNA不含信号肽序列并加入了新的起始密码子ATG,序列分析表明,与日本报道的人OBcDNA相比,多出一个谷氨酸密码子CAG．将OBcDNA定向克隆至原核表达载体pBV220,构建了重组OB基因表达质粒pBV220-OB．SDS-PAGE证实pBV220-OB在大肠杆菌中可表达分子量为16.7KD的特异蛋白带．     

鼠疫耶尔森氏菌VcrV基因在大肠杆菌中的高效表达

将测序后的鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis)LcrV基因重组质粒pGEM－T／ypV酶切,克隆于原核表达载体pBV220,构建成pBV/ypV表达质粒,转化大肠杆菌DH5α,进行PCR及酶切鉴定,筛选阳性克隆,进行温控诱导表达,SDS－PAGE检测表达产物,在相对分子质量38000处有－表达条带,经薄层扫描分析目的蛋白带占全菌蛋白的38．4％以上,主要以可溶形式存在。     

大肠杆菌邻氨基苯甲酸合成酶编码基因trpED的克隆与表达

目的:通过基因重组的方法获得在体外具有邻氨基苯甲酸合成酶活性的基因trpED,为进一步解除反馈抑制的基因改造寻找靶标。方法:分别构建重组质粒pBV220-trpE和pBV220-trpD;由于trpE和trpD存在翻译偶联现象,将其自大肠杆菌基因组中经PCR扩增得到,构建新的表达质粒pBV220-trpED。结果:SDS-PAGE显示,包含质粒pBV220-trpED的重组菌在相对分子质量约53000(trpE基因表达)和56000(trpD基因表达)处的蛋白表达量明显增多,且邻氨基苯甲酸合成酶活性是对照的3倍。结论:翻译偶联的存在直接影响蛋白活性的发挥;重组质粒pBV220-trpED的获得为进一步的基因改造,以提高色氨酸产量奠定了研究基础。     

Epstein-Barr病毒旱期抗原P138和P54基因的重组与表达

应用基因重组技术,将EB病毒早期抗原(EA)P138两个抗原部位的基因片段和早期抗原P54的完整基因重组,构建成质粒pUC B,转化大肠杆菌JM109获得高效表达。其产物为分子量83kD的P83。经Western blot检验证实,P83能与鼠抗P138和鼠抗P54两种单克隆抗体产生特异性反应。用P83检测30份鼻咽癌病人血清IgA类抗体100％阳性,30份正常人血清全部阴性。     

干扰素-tau的原核表达、纯化和活性测定

干扰素-tau (IFN-tau)是一种新发现的I型干扰素,为了更清楚的研究它的生物学功能,在已克隆IFN-tau cDNA的基础上,PCR扩增出IFN-tau ORF,与原核表达载体pBV220重组后,成功的构建了IFN-tau的原核表达质粒pBV220/IFN-tau。重组质粒转化大肠杆菌BL21,该菌经过诱导,用凝胶过滤色谱层析的方法获得了纯化的目的蛋白,该蛋白经过氨基酸序列分析证实是IFN-tau ;用细胞病变抑制法测定IFN-tau经过透析复性后的活性为2.09×106IU/ml,比活性为2.35×106IU/mg。