用甲基化的寡聚核苷酸作反义制剂

在含甲基磷酸根的寡核苷酸中,核苷酸之间含有非离子键,能抵抗细胞核酸酶的降解。一这种寡聚物能被培养的哺乳动物细胞完全吸收,它们能与细胞或病毒mRNA的启始密码或编码区或前体RNA的拼接位点有效的结合,特异性地抑制mRNA在细胞中表达。在甲基磷酸根寡核苷酸上衍生与靶mRNA共价交联的功能团,可以增强这种反义寡聚物的效率。这种寡聚核苷酸类似物是研究和控制基因表达的有用工具,并有希望开发成为治疗制剂。     

TGFa反义寡聚核苷酸对膀胱癌BIU87细胞株的作用

报道了２３碱基组成的ＴＧＦａ反义寡聚核苷酸和对照寡聚核苷酸对人膀胱移行细胞癌ＢＩＵ８７细胞增殖及其ＴＧＦａｍＲＮＡ表达的表用,结果表明：ＴＧＦａ反义寡聚核苷酸抑制抑体外培养的ＢＩＵ８７细胞的增殖,ＤＮＡ合成和ＴＧＦａｍＲＮＡ的表达,进一步证明了ＴＧＦａ在ＢＩＵ８７细胞恶性增殖中的重要作用。     

反义寡聚核苷酸：生理学研究中的新工具

反义寡聚核苷酸（antisenseoligonucleotide,AS-ON）通常是指与体内某RNA或DNA序列具有互补顺序,并能通过碱基配对与互补链杂交,从而影响其转录或翻译过程的核酸片段。AS-ONs技术的近来应用为生理学研究开辟了一条新路,对将来了解基因的功能提供了一种新手段。本文综述了AS-ONs的设计策略、作用机理、修饰和导入方式等基本问题,旨在对AS-ONs的应用提供参考。     

TGFα反义寡聚核苷酸对膀胱癌BIU 87细胞株的作用

报道了23碱基组成的TGFα反义寡聚核苷酸和对照寡聚核苷酸对人膀胱移行细胞癌BIU87细胞增殖及其TGFα mRNA表达的作用,结果表明:TGFα反义寡聚核苷酸抑制体外培养的BIU87细胞的增殖、DNA合成和TGFα mRNA的表达,进一步证明了TGFα在BIU87细胞恶性增殖中的重要作用.     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅲ.十三脱氧核糖核苷酸的化学合成

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)先后同d-_pT_pC~(An)_pC~(An)_(-CA(?))和d-_pG~(Bz)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pA~(Bz)_(OAc)反应,脱去保护基后,在7M尿素柱上分离纯化,最后得到产物脱氧核糖十三核苷酸(d-GpApCpGpApGpTpCpCpG_pGpApA)。因上述两步缩合反应所得到的中间产物带有大量芳香族保护基,增强了寡聚核苷酸对离子交换树脂的吸附,给分离纯化工作造成一定困难。我们发现这些带有保护基的寡聚核苷酸在DEAE-葡聚糖A-25(Cl~-型)柱上,用含有3M尿素和40%乙醇的氯化锂溶液洗脱,可以克服这一困难。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅰ.十脱氧核糖核苷酸的化学合成

用片段缩合的方法,化学合成了十脱氧核糖核苷酸 d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)_pT_pC~(An)_pC~(An)_pG~(Bz)。各中间片段及最终产物在脱除全部保护基后,均能定量地为桔青霉磷酸二酯酶酶解,并得到预期的碱基比例。将三苯甲基-纤维素柱运用于带MMTr基片段反应混合液的分离,能使情况简化,为进一步在DEAE-纤维素柱上分离纯化创造有利条件。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅲ.十三脱氧核糖核苷酸的化学合成

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,d-_(MMTr)G_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)G_p~(Bz)先后同d-_pT_pC_p~(An)C_(OAc)~(An)和d-pG_p~(Bz)G_p~(Bz)A_p~(Bz)A_(OAc)~(Bz)。反应,脱去保护基后,在7M尿素柱上分离纯化,最后得到产物脱氧核糖十三核苷酸(d-G_pA_pC_pG_pA_pG_pT_pC_pC_pG_pG_pA_pA)。因上述两步缩合反应所得到的中间产物带有大量芳香族保护基,增强了寡聚核苷酸对离子交换树脂的吸附,给分离纯化工作造成一定困难。我们发现这些带有保护基的寡聚核苷酸在DEAE-葡聚糖A-25(Cl~-型)柱上,用含有3M尿素和40%乙醇的氯化锂溶液洗脱,可以克服这一困难。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅰ.十脱氧核糖核苷酸的化学合成

用片段缩合的方法,化学合成了十脱氧核糖核苷酸d-_(MMTr)G_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)G_p~(Bz)T_p~(Bz)C_p~(An)C_p~(An)G~(Bz*)。各中间片段及最终产物在脱除全部保护基后,均能定量地为桔青霉磷酸二酯酶酶解,并得到预期的碱基比例。将三苯甲基一纤维素柱运用于带MMTr基片段反应混合液的分离,能使情况简化,为进一步在DEAE-纤维素柱上分离纯化创造有利条件。     

特异寡聚核苷酸对猪瘟病毒在细胞中增殖抑制作用的研究

本实验探讨了寡聚核苷酸对CSFV复制的影响以及作为抗CSFV新型药物的可行性。实验结果表明针对CSFV5'um端非编码区NS3蛋白丝氨酸蛋白酶功能区的寡聚核酸对CSFV复制均有显著的抑制作用,而针对CSFV3' 端非编码区寡聚核苷酸仅有轻微抑制作用,5'端寡聚核苷酸具有最佳抑制作用,同时发现相应序列中正义聚核苷酸的作用要优于反义寡聚核苷酸;脂质体介导转染能显著提高寡聚核苷酸对CSF复制的抑制作用。这些初步结果也提示,CSFV5'端和3'端非编码区对CSFV复制的重要性和作用有所不同。     

阳性脂质体介导反义寡聚核苷酸转染HeLa细胞的效果研究

采用FITC标记的未经修饰的和经过修饰的两种19-mer反义寡聚核苷酸序列(ODN19和S-ODN19)作为转染物质,用流式细胞技术(FCM)研究比较几种常用阳性脂质体介导的寡聚核苷酸转染HeLa细胞的效果及适宜的转染时间。未经化学修饰的ODN19转染结果显示,LipofectAmine和DM-RIE-C增强转染的作用相对较强,而其他两种脂质体的作用并不明显。对于经过修饰的S-ODN19转染而言,四种阳性脂质体均具有增强S-ODN19转染作用,但以LipofectAmine的效果最为明显,其转染效果(FITC均值为5203.11)为无脂质体介导对照的数十倍。四种阳性脂质体的增强转染作用排序为:LipofectAmine>FuGENE6>Lipofectin>DM-RIR-C。另外,在用FuGENE6介导寡聚核苷酸转染时,采用4小时转染时间可获较好转染效果。     

内皮素受体反义寡聚核苷酸对内皮素受体基因表达及血管平滑肌细胞增殖的影响

报道了内皮素Ａ型受体反义寡聚核苷酸（ＯＤＮｓ）对大鼠血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖及内皮素受体基因表达的影响．~３Ｈ－ＴｄＲ参入结果显示,内皮素Ａ型受体反义ＯＤＮｓ处理细胞可显著抑制内皮素诱导的ＶＳＭＣ的ＤＮＡ合成,反转录－ＰＣＲ及受体结合实验结果表明,ＯＤＮｓ的上述作用与降低ＶＳＭＣ内皮素Ａ型受体基因表达活性有关．     

特异寡聚核苷酸对猪瘟病毒在细胞中增殖抑制作用的研究

本实验探讨了寡聚核苷酸对CSFV复制的影响以及作为抗CSFV新型药物的可行性.实验结果表明针对CSFV5'端非编码区NS3蛋白丝氨酸蛋白酶功能区的寡聚核苷酸对CSFV复制均有显著的抑制作用,而针对CSFV3'端非编码区寡聚核苷酸仅有轻微抑制作用,5′端寡聚核苷酸具有最佳抑制作用,同时发现相应序列中正义聚核苷酸的作用要优于反义寡聚核苷酸;脂质体介导转染能显著提高寡聚核苷酸对CSFV复制的抑制作用.这些初步结果也提示,CSFV5'端和3'端非编码区对CSFV复制的重要性和作用有所不同.     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅱ.六脱氧核糖核苷酸的化学合成与抽提分离

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,合成了二个六脱氧核糖核苷酸(d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)和d-(MMT_r)T_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)),脱去保护基后经双向同系层析测定核苷酸排列顺序,完全符合实验设计要求(d-GpApCpGpApG和d.TpCpGpApApC)。上述二个带保护基的六脱氧核糖核苷酸合成的每一步,都是采用溶剂抽提方法分离的,大大简化了分离的步骤和缩短了分离的时间,便于脱氧寡核苷酸的大量制备。此法也适用于其他带保护基寡核苷酸的制备,不论其三苯甲基衍生物基团在5’端或3’端(例如如d-_pG~(Bz)_pA~(Bz)_(-ODMT_r))。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅱ.六脱氧核糖核苷酸的化学合成与抽提分离

用均三甲基苯磺酰氯(M8)作缩合剂,合成了二个六脱氧核糖核苷酸(d-_(MMTr)G_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)G_p~(Bz)和d-_(MMTr)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An))*,脱去保护基后经双向同系层析测定核苷酸排列顺序,完全符合实验设计要求(d-G_pA_pC_pG_pA_pG和d-T_pC_pG_pA_pA_pC)。上述二个带保护基的六脱氧核糖核苷酸合成的每一步,都是采用溶剂抽提方法分离的,大大简化了分离的步骤和缩短了分离的时间,便于脱氧寡核苷酸的大量制备。此法也适用于其他带保护基寡核苷酸的制备,不论其三苯甲基衍生物基团在5′端或3′端(例如d-_pG_p~(Bz)A_(ODMTr)~(Bz))。     

反义寡聚脱氧核苷酸（ODN）衍生物抑制乙肝病毒抗原表达的研究

为比较针对中不同基因的ＯＤＮ硫代衍生物阻断乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的抗原表达,合成了与核心蛋白编码基因起始码上游序列,多聚酶蛋白编码基因起码上游及内部序列３．５ｋｂＲＮＡ３＇端起始负链ＤＮＡ合成序列互补的寡聚脱氧核苷酸硫代衍生物,分别在ＨＢＶ短暂表达和稳定表达细胞培养系统中观察其抑制ＨＢＶ抗原表达的作用。结果发现,当培养液中ＯＤＮ浓度为２０μｍｏｌ／ＬＪＦ ,四种ＯＤＮ均能抑ＨｅｐＧ２．２．１５细胞     

BCL-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸对原代急性白血病细胞选择性抑制作用

为探讨BCL-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(AS-PS-ODN,ASPO)对急性原代白血病细胞和正常或良性血液病骨髓细胞的作用是否存在差别。应用台盼蓝拒染试验测定细胞存活力;用造血祖细胞集落培养:粒—单系祖细胞集落(CFU-GM),多向祖细胞集落(CFU-Mix),后红系祖细胞集落(CFU-E)、前红系祖细胞集落(BFU-E)和白血病祖细胞集落(CFU-AML,CFU-ALL)培养检测细胞增殖能力;免疫细胞化学染色检测细胞BCL-2蛋白表达变化。结果发现(1)正常或良性血液病骨髓细胞经10μmol/L ASPO处理一周,同对照组比较:细胞生长数、CFU-GM、CFU-Mix、CFU-E、BFU-E及BCL-2蛋白表达均无显著差别(P<0.05)。(2)急性原代白血病细胞经5μmol/L ASPO处理一周,同对照组比较:细胞生长数显著减低;CFU-AML或CFU-ALL显著降低(P < 0.05),而CFU-GM明显增高(P< 0.05);对照组BCL-2蛋白表达率为77.92％±22.50％,ASPO组于培养的第3天为54.05％±20.20％(P<0.01)和第6天为55.35％±22.74％(P<0.05)均显著低于对照组。因此认为BCL-2ASPO具有选择性地抑制白血病细胞的增殖和BCL-2蛋白的表达的作用。     

p38 MAPK反义寡聚脱氧核苷酸阻断肢体缺血预处理诱导的脑缺血耐受

目的:观察p38MAPK反义寡聚脱氧核苷酸(As-ODN)对肢体缺血预处理(LIP)诱导的脑缺血耐受的影响。方法:48只永久凝闭双侧椎动脉的Wistar大鼠分为8组(n=6):sham组、LIP组、脑缺血损伤组、LIP+脑缺血损伤组、双蒸水+LIP+脑缺血损伤组、p38MAPKAs-ODN组和p38MAPKAs-ODN+LIP+脑缺血损伤组,p38MAPKAs-ODN的剂量又分为5nmol/5μl和10nmol/5μl。所有动物均在sham手术后或末次全脑缺血/再灌注后7天断头取脑,硫堇染色观察海马CA1区锥体神经元迟发性死亡情况。结果:sham组和LIP组均未见延迟性神经元死亡(DND)。与sham、LIP组相比,脑缺血损伤组出现了明显的DND,表现为组织学分级(HG)升高和锥体神经元密度(ND)下降(P0.05)。LIP可显著抑制脑缺血损伤引起的DND。与LIP+脑缺血损伤组相比,p38MAPKAs-ODN+LIP+脑缺血损伤组出现了显著的DND,表现为HG升高、ND降低(P0.05),且此种变化与p38MAPKAs-ODN的注射剂量呈明显正相关。结论:p38MAPKAs-ODN可阻断LIP诱导的脑缺血耐受,进一步证实了p38MAPK表达上调参与了LIP诱导的脑缺血耐受。