血影内Th~（3＋）在脉冲电场作用下外渗的动态研究

利用改进后的Ｔｂ／ＤＰＡ荧光方法对在脉冲电场作用下人血影内Ｔｂ离子外渗的动力学过程进行了系统的研究。对不同场强和脉宽的电场处理的离子外渗量与时间的关系和电穿孔总面积随时间的变化进行了测量,结果表明,离子外渗的主要方式是由膜两侧浓度梯度导致的离子自由扩散,当脉冲宽度或强度两者之一给定的情况下,均存在临界场强和临界脉宽,在临界点以上电场作用下,膜上出现明显的电穿孔。在实验条件下,电穿孔的面积在２００－     

细胞电穿孔动态过程的荧光测量

利用改进后的Ｔｈ／ＤＰＡ荧光方法及探针ＥＢ对人血影及大鼠骨髓细胞电穿孔的动态过程及其与电脉冲参数的关系进行了系统的研究．测量结果表明,在临界点以上电场作用下,血影电穿孔在电击后０．２—０．３ｓ时达最大,在约０．８ｓ时愈合;而大鼠骨髓细胞电穿孔在电击后０．４—０．９ｓ达到最大,３－５ｓ左右愈合;电穿孔大小及扩大、愈合速率与电脉冲参数有关。１０－４０ｍｍｏｌ／Ｌ乙醇和５－２０ｍｍｏｌ／Ｌ成二醛抑制血影对Ｔｂ３＋离子的电通透,相同浓度的成二醛作用强于乙醇。这些结果将为电穿孔技术的合理应用提供参考。     

脉冲电场对人红细胞膜结构影响的冷冻断裂研究

对外加脉冲电场处理的人红血球冷冻断裂和蚀刻的复型观察中发现在强电场(3KV/cm)作用下,细胞周围有颗粒状和纤维状结构。结合SDS电泳分析证明了它们是由于在电场作用下,红血球膜的带3蛋白和膜骨架蛋白(血影蛋白)脱出的结果。在强电场作用下,由于膜蛋白和膜骨架蛋白的脱出造成了对细胞膜的损伤,使细胞膜稳定性降低,细胞易变形和形成伪足。由于膜蛋白的脱出,多余的自由脂质进入细胞质内而形成泡状结构。外电场改变了蛋白-蛋白以及蛋白-脂分子间的作用可能是电穿孔的主要机理。本文还对当前公认的冷冻断裂中所观察到的膜中间颗粒的来源提出了疑问,并提出了它们还可能与冰晶有关。而冰晶的形成又与膜的亲水与疏水性有关。     

酵母整细胞及原生质体的最佳电穿孔条件

本实验系统地研究了椭圆酿酒酵母AS2-607(南阳6号“K”)质膜的电穿孔条件。通过对不同电场条件产生的菌落数的测量,可以确定对原生质体的最佳条件为:RC脉冲电场幅度应为5--10KV/cm 脉冲的时间常数应小于30微秒;为加强电穿孔作用应采取多个一列的短脉冲方式;用链霉蛋白酶和胰蛋白酶作预处理能提高质膜对电场的抗性。而对在28℃下悬浮培养14小时的该种酵母细胞,由于细胞壁的影响,对高达20KV/cm或400微秒的RC脉冲仍无明显的电击穿致死效应。在本实验中,我们发观了以下的三点有趣的结果:对原生质体的膜击穿电压Vm可提高至3.7V,这时仍有足够高的成活率;一列相同的电脉冲的致死率依次序先后递减;对完整细胞作电击穿操作,可大大提高脉冲的幅度和时程。     

脉冲电场对人红细胞膜结构影响的冷冻断裂研究

对外加脉冲电场处理的人红血球冷冻断裂和蚀刻的复型观察中发现在强电场作用下,细胞周围有颗粒状和纤维状结构。结合ＳＤＳ电泳分析证明了它们是由于在电场作用下,红血球膜的带３蛋白和膜骨架蛋白（血影蛋白）脱出的结果。在强电场作用下,由于膜蛋白和膜骨架蛋白的脱出造成了对细胞膜的损伤,使细胞膜稳定性降低,细胞易变形和形成伪足。由于膜蛋白的脱出,多余的自由脂进入细胞质内而形成泡状结构。外电场改变了蛋白－蛋白以及蛋     

脉冲电场在医学中的基础研究及电穿孔的临床应用

脉冲电场利用方波直流脉冲发生器改变细胞膜的通透性,并在细胞膜上形成纳米级细孔,其被称为电穿孔是一种新型微创技术,分为可逆电穿孔(reversible electroporation)及不可逆电穿孔(irreversible electroporation)。在过去的四十年,电穿孔大量的实验研究及其自身的优点及先进性,使电穿孔相关的技术已被允许应用与临床。目前临床和实验中应用电穿孔的化疗药物已有十余种,通过电穿孔进行基因转染及DNA疫苗的研发已取得巨大成功。尤其近几年发展的非热能的不可逆电穿孔对实体肿瘤的消融作用,为肿瘤治疗提供新的思路,因其比其他局部治疗方法:具有治疗时间短,减少间接热损伤,对毗邻主要血管的肿瘤组织有消融能力等优点引起了对不可逆电穿孔巨大的临床研究兴趣。本文就电穿孔的基本理论,电化学治疗,基因电转染及不可逆电穿孔的临床应用进行探讨。     

脉冲电场对真皮成纤维细胞生长和膜流动性的影响

采用MTT比色分析法检测脉冲电场(f=50Hz,t=20μs,Epp=1V/m),对真皮成纤维细胞增殖的影响,结果表明,电场作用1分钟和5分钟,均产生促进细胞增殖的效果(P<0.05和P<0.001),而较长时间(t≥10分钟)的电场作用则显著抑制细胞的正常增殖(P<0.001)。 采用荧光偏振法研究了脉冲电场对真皮成纤维细胞膜流动性的影响。结果表明,电场作用5分钟后即刻引起膜流动性的显著增加。而电场作用45分钟后,需经过一段时间的温育(30 分钟),才表现出膜流动性的降低。说明不同作用时间的电场可以造成膜流动性的增加或降低,而且对膜流动性的影响是可逆的。我们认为,脉冲电场所引起的膜流动性改变是细胞分裂能力发生变化的原因之一。     

低频脉冲电场对胰岛素介导的细胞增殖影响及其作用机理研究

本文以胞外信号分子胰岛素为研究对象,从细胞信号系统与电磁场相互耦合角度,通过MTT比色法和间接免疫荧光技术研究脉冲电场(f=50Hz,τ=20μS,Epp=1V/m)对人肝细胞(L-02细胞株)的增殖能力以及胰岛素与细胞表面受体的专一结合特性的影响。MTT比色分析结果发现在脉冲电场对细胞增殖的直接作用中,处理5、10、20分钟对细胞增殖的抑制百分率分别为10.13％、18.10％和11.85％;脉冲电场对细胞增殖的间接作用中,胰岛素经脉冲电场处理20、40分钟,对细胞增殖的抑制百分率分别为10.31％和14.12％;流式细胞术检测结果表明细胞悬液和胰岛素共同经脉冲电场处理20分钟组其平均荧光强度降低22.74％,仅胰岛素受电场处理组和仅细胞受电场处理组的平均荧光强度分别下降12.96％和10.51％。本实验结果显示 脉冲电场对人肝细胞的作用体现在两个方面:一是电场直接作用于细胞膜上的胰岛素受体及其他膜成分;二是脉冲电场还可通过改变培养基中的胰岛素分子的构像,影响胰岛素与受体的结合能力,进而影响细胞的增殖等活动。     

利用电穿孔技术实现质粒向酵母原生质体的转化

本实验的主要目的旨在摸索电场对基因转化的最佳条件.已得到初步结果为:用酿酒酵母S.cerevisiae DBY 746作为穿梭质粒(YRp类)的受体菌.经过对最适电场条件与基因转化率之间关系的研究,我们发现在1个400μS的宽时程脉冲、电场强度为4KV/cm时有最高转化率,达273个转化子/μgDNA.本实验所用的电穿孔装置是自组装的,它简便、快速、实用.     

脉冲电场引起的红血球内钠离子浓度变化的研究

利用位移试剂和²³Na-NMR的方法研究脉冲电场对正常人红血球内Na⁺浓度的影响,实验结果给出在高强度电场作用下,细胞内Na⁺浓度增加,并且随脉冲强度的增加而增加,比指数关系还快.在低强度电场作用下,细胞内Na⁺浓度减少.乌苯苷能抑制细胞内Na⁺浓度的减少,抑制程度随乌苯苷浓度的增加而增强,从而证实了低强度的脉冲电场对Na⁺,K⁺-ATPase的激活作用,直接测定脉冲电场对红血球血影膜的Na⁺,K⁺-ATPase活性的影响,进一步证实了这一结果.并对在电场作用下细胞膜的通透性和电场对酶的激活作用及电场等外界物理信号是否能跨过细胞膜等进行了讨论.     

氧化应激在长脉宽1064nm Nd: YAG激光治疗甲真菌病中的作用

目的探讨长脉宽1064nm Nd:YAG激光对引起甲真菌病的最常见致病菌-红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)的体外抑制/杀灭作用及活性氧簇(ROS)介导的氧化应激反应在其中发挥的作用。方法改变长脉宽1064nm Nd:YAG激光脉冲数(7次脉冲、9次脉冲、11次、13次脉冲),固定其他参数照射红色毛癣菌菌落,绘制生长曲线,确定有抑制作用的最小脉冲数。在此脉冲数条件下干预红色毛癣菌菌落及孢子悬液,比较菌落形态学改变,检测孢子悬液相对活力的改变,同时检测ROS在不同处理后的表达水平变化。结果激光对红色毛癣菌的抑制/杀灭作用随能量的增加而增强,相对活力随时间的增加而下降,呈能量和时间依赖性;激光干预后,菌丝失去正常形态结构,孢子悬液的荧光强度及ROS含量较未照射的高,P=0.0157。结论长脉宽1064nm Nd:YAG激光体外对红色毛癣菌有抑制/杀灭作用,ROS介导的氧化应激反应可能在该激光治疗红色毛癣菌甲真菌病中发挥了一定的作用。     

低频脉冲电场逆转MCF-7/ADR对高三尖杉酯碱和长春新碱的耐药性

为了探讨低频脉冲电场对人乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/ADR耐药性的逆转作用及机制,采用MTT比色法检测MCF-7/ADR的耐药指数和耐药性的逆转倍数,荧光显微镜观察脉冲电场对MCF-7/ADR细胞内DiOC2(3)(P-gp的特异性荧光底物)积累和外排的影响。结果发现,在低频脉冲电场不影响MCF-7/ADR细胞生长的情况下,不同时间的电场作用均能逆转MCF-7/A的多药耐药,对高三尖杉酯碱(HHT)耐药性的逆转倍数在1.429～1.848之间,对长春新碱(VCR)耐药性的逆转倍数在1.473～2.090之间,45min电场作用的逆转效果最好,其次是30min电场作用。药物积累和外排实验结果表明,脉冲电场作用45min能使细胞内的DiOC2(3)积累明显增加,而30min电场作用能显著抑制DiOC2(3)的外排。促进药物积累和抑制其外排可能是脉冲电场逆转多药耐药的机制之一。     

不同场强下IRE的肿瘤消融作用及对抗肿瘤免疫的影响

目的:探讨不同电场强度的不可逆电穿孔(IRE)对于肿瘤的消融效果以及其所引起的肿瘤免疫反应。方法:将B16黑色素瘤细胞接种于C57小鼠,制作黑色素瘤小鼠模型,应用不可逆电穿孔仪对肿瘤进行消融,通过测量肿瘤生长大小研究不同场强下的消融效果。通过CD4、CD8a免疫组化染色初步了解不同场强激发的免疫反应的强弱,从而选择最佳消融参数。结果:随着电场强度增加,肿瘤消融效果逐渐趋于理想,然而平板电极夹之间过高电场引发的热效应则不利于后续抗肿瘤免疫反应的激活。选择合适的电场,通过增加电击组数可以达到良好的治疗效果。结论:IRE对肿瘤的消融优势在于它能够很好的激活机体的抗肿瘤免疫反应,因此,选择合适的电场增加电击组数可以起到很好的抗肿瘤作用,具有很好的应用前景。     

脉冲电场对水结构影响的研究

本文研究了脉冲电场对水的导电率、ｐＨ值、折射率、透光率影响。结果表明,１．０×１０５ｖ／ｍ脉冲电场处理去离子水、蒸馏水５、３０ｍｉｎ后,电导率、折射率增加;透光率、ｐＨ值降低。电处理水具有“记忆”效应。对自来水作相同处理后,除电导率没测到变化外,其它指标也有变化。研究发现,电场处理水引起其结构改变,电场强度起决定作用,其次是处理时间。本文还探讨了作用机理。     

镧对水稻根质膜透性和根分泌物中几种营养离子含量的影响

通过水培实验,研究了系列浓度La在不同处理时间内对水稻根质膜透性和根分泌物中几种营养离子含量的影响。结果表明,La在低浓度时(≤50μg·ml^-1),可以稳定细胞膜,减少电解质外渗率,在此浓度下,根系分泌物中K^+、Ca^2+、P和H^+的含量比对照低,La的浓度升高(100～400μg·ml^-1),随着处理时间的延长,电解质外渗率呈现短时间抑制,长时间促进的规律．La在高浓度时(c≥500μg·ml^-1),即使短时间的处理,也会使根细胞原生质膜破坏,电解质外渗率提高．此时根分泌物中K^+、Ca^2+、P和H^+含量均比对照高．由此可以得出在水培条件下,La^3+≤50μg·ml^-1对水稻生长是安全的。     

高压电场灭菌效果研究

本文以乳酸杆菌、枯草杆菌及酵母菌为研究对象,研究了高压交流电场作用对它们的致死率影响及细胞结构的变化。实验表明：在22．5kv／cm的场强下处理ls能导致乳酸杆菌活菌数降低近6个数量级,通过显微摄影可明显观察到枯草杆菌细胞结构的破裂和酵母细胞的死亡。     

猪血红蛋白(Hb)脉冲酶解效果比较研究

目的寻找一种高效快捷有效地降解猪血红蛋白(Hb)新方法。方法在波型为双向方波,电极间距离为1.2 cm,脉冲频率为200 kHz的脉冲电场下,利用胰蛋白酶在温度为37℃,水解时间为4 h条件下水解猪血红蛋白。结果在脉冲电场作用下,胰蛋白酶水解血红蛋白获得的降解产物,利用高效凝胶色谱、紫外可见扫描及SDS-PAGE蛋白质电泳检测,发现其吸收峰或色带明显多于单一利用胰蛋白酶降解血红蛋白所得降解产物的吸收峰或色带。结论当脉冲电场通过血红蛋白时,血红蛋白内部的分子结构便产生斯塔克效应(Stark effect),引起血红蛋白分子剧烈振动,从而改变其分子结构振辐、吸收峰和偶极矩,并分别引起斯塔克频率、偶极矩、极化率的改变、使血红蛋白分子结构的极化跃迁和超极化,因此,在脉冲电场作用下,促进了血红蛋白酶解反应。     

电穿孔技术在转基因及动物克隆中的应用

电穿孔技术利用电场造成细胞膜的改变而将DNA导入细胞内,它还可用于细胞融合及动物克隆等。基因电转移的效率通常比化学法提高1—2个数量级,主要与脉冲波形、长度、缓冲液等有关。方波直流电脉冲应用广泛,在有关细胞核移植的多项研究报告中均指出它有重要作用。     

外加直流电场对血管平滑肌细胞形态及迁移行为的影响

在外加直流电场(electricalfields,EFs)作用下血管平滑肌细胞(VSMCs)膜表面细胞生长因子受体表达发生明显的变化,并影响细胞形态、迁移的特性。通过EFs干预装置干预体外培养的大鼠主动脉VSMCs,记录和分析细胞图像,研究不同强度电场、不同作用时间下VSMCs迁移和细胞形态的变化,并用免疫细胞化学或免疫荧光染色方法检测与VSMCs迁移相关的血小板衍化生长因子受体(PDGFR)、血管紧张素II1型受体(AT1R)和2型受体(AT2R)等受体的表达情况,研究EFs影响VSMCs形态及迁移的机制。研究结果提示,在EFs干预作用下,VSMCs膜PDGFR表达增加,部分细胞呈不对称分布,在EFs阴极面较集中;细胞中AT1R表达亦增加,但无明显不对称分布现象;AT2R表达没有改变;EFs长时间作用下,培养的VSMCs有明显的电场趋化性,细胞向阴极迁移的距离明显高于无EFs作用对照组,细胞膜向阴极方向伸展,发生形状改变,定向迁移依赖于EFs强度。EFs作用下,部分细胞生长因子受体的表达上调和重分布,可能与细胞定向迁移的启动和维持有关。     

细胞离子在振荡电磁场作用下的受力模型分析

本文通过生物细胞模型,研究振荡电场、振荡磁场以及振荡磁场产生的感应电场对细胞离子的作用机理。模型分析结果表明,电场力和罗仑兹力对细胞膜两侧的自由离子将产生加速度,振荡离子将产生周期性电位移。该模型同时也解释了脉冲电磁场比同参教的连续场产生更多的生物效应,以及连续场在开始施加和切除时的效应最大。