海南捕鸟蛛毒素-IV对大鼠背根神经节细胞钠通道的抑制影响(英文)

海南捕鸟蛛毒素 IV(HNTX IV)是从中国捕鸟蛛Seleconosmiahainana粗毒中分离得到的一种肽类神经毒素 ,在成年大鼠背根神经节 (DRG)细胞上观察了该毒素对电压门控钠通道的影响。在全细胞膜片钳条件下 ,HNTX IV能明显抑制哺乳动物神经性河豚毒敏感型 (TTX S)钠电流 ,但不影响河豚毒不敏感型 (TTX R)钠电流。HNTX IV对DRG细胞TTX S钠电流的抑制作用具有浓度依从性 ,其有效半抑制浓度 (IC50 )为 44 .6nmol/L。该毒素不影响DRG钠电流的激活与失活时间特征 ,但能导致钠通道的半数稳态失活电压向超极化方向漂移约 10 .1mV。结果表明HNTX IV是一种新型的蜘蛛毒素 ,其影响电压门控钠通道的机制可能有别于那些结合于通道位点 3来延缓钠电流失活时间特征的蜘蛛毒素如δ 澳洲漏斗网蛛毒素、μ 美洲漏斗网蛛毒素I VI等。     

海南捕鸟蛛毒素—Ⅳ对大鼠背根神经节细胞钠通道的抑制影响

海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ（HNTX-Ⅳ）是从中国捕鸟蛛Seleconosmia hainana粗毒中分离得到的一种肽类神经毒素,在成年大鼠背根神经节（DRG）细胞上观察了该毒素对电压门控钠通道的影响。在全细胞膜片钳条件下,HNTX-Ⅳ能明显抑制哺乳动物神经性河豚毒敏感型（TTX-S）钠电流,但不影响河豚毒不敏感型（TTX-R）钠电流,HNTX-Ⅳ对DRG细胞TTX-S钠电流的抑制作用具有浓度依从性。其有效半抑制浓度（IC50）为44.6nmol/L。该毒素不影响DRG钠电流的激活与失活时间特征,但能导致钠通道的半数稳态失活电压向超极化方向漂移约10.1mV。结果表明HNTX-Ⅳ是一种新型的蜘蛛毒素,其影响电压门控钠通道的机制可能有别于那些结合于通道位点3来延缓钠电流失活时间特征的蜘蛛毒素如δ-澳洲漏斗网蛛毒素,μ-美洲漏斗网蛛毒素I-Ⅵ等。     

三种蜘蛛粗毒对NG108—15细胞电压门控钠通道的抑制作用

利用小鼠神经细胞瘤×大鼠神经胶质细胞的杂交细胞NG108-15,通过全细胞记录(whole-cellrecording)模式的膜片钳技术,检验了虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)、海南捕鸟蛛(Selenocosmia hainana)和广西大疣蛛(Macrothele guangxiasp)的粗毒对NG108-15细胞膜上电压门控TTX敏感型钠电流和延迟整流钾电流的作用.结果表明,三种蜘蛛粗毒对外向延迟整流钾电流没有明显作用,但对TTX敏感型的快钠电流表现出较强的抑制效应.抑制效应呈量效关系.三种粗毒抑制钠电流的EC     

Arg26和Lys27突变对海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ生物活性影响

海南捕鸟蛛毒素Ⅳ(hainantoxin-Ⅳ,HNTX-Ⅳ)是一种新型的从海南捕鸟蛛粗毒中分离纯化的作用于河豚毒素敏感型(tetrodotoxinsensitive,TTXS)钠通道阻断剂.采用2D1HNMR技术解析HNTXⅣ的空间结构为胱氨酸抑制剂结模体,为进一步阐述HNTX-Ⅳ结构与功能的关系,应用固相Fmoc方法化学合成了用丙氨酸代替海南捕鸟蛛毒素Ⅳ第26位精氨酸的单残基突变体R26AHNTXⅣ和第27位赖氨酸的单残基突变体K27AHNTXⅣ.合成的突变体用谷胱甘肽法氧化复性并通过反相高效液相色谱(RPHPLC)纯化.通过MALDITOF质谱测定突变体的分子量.通过核磁共振谱仪测定突变体的空间结构.通过全细胞膜片钳实验比较天然HNTX-Ⅳ(nHNTX-Ⅳ)和两个突变体分子的生物学活性.结果发现,nHNTX-Ⅳ的R26或K27被突变后的空间结构没有发生明显变化.R26AHNTX-Ⅳ能明显抑制TTXS钠电流,K27AHNTX-Ⅳ对TTXS钠电流无明显影响.说明第26位的精氨酸与HNTX-Ⅳ的生物学活性无关,而第27位赖氨酸则是HNTX-Ⅳ的关键残基.     

海南捕鸟蛛毒素-Ⅵ的分离纯化及鉴定

从分布于我国海南省的海南捕鸟蛛（Selenocosmia hainana)粗毒中,应用阳离子交换色谱和反相高效液相色谱分离得到1种多肽神经毒素,命名为海南捕鸟蛛毒素－Ⅵ（Hainantoxin-Ⅵ,HNTX-Ⅵ)。MALDI－TOF南谱分析及氨基酸序列分析表明该多肽毒素分子量为3.998 49kDa,序列为NH2－ECKYLWGTCEKDE－HCCEHLGCNKKHGWCGWDGTF－COOH,其中的6个Cys形成3对二硫键。HNTX－Ⅵ能阻断小鼠膈神经膈肌标本神经肌肉接头传递,脑室及硬膜外注射毒能使小鼠瘫软。同源性搜索表明该毒素与蜘蛛Grammostola spatulata毒素HaTx和蜘蛛Scodra griseipes中的SGTx1毒素有很高的同源性,而后两种毒素均为K^ 通道阻断剂。     

海南捕鸟蛛毒素-Ⅵ，一种新型的抑制昆虫电压门控钠通道失活的狼蛛神经毒素

通过阳离子交换和反相HPLC柱层析从海南捕鸟蛛（Ornithoconus hainana）粗毒中分离到一种新型的神经毒素,海南捕鸟蛛毒素-Ⅵ(HNTX-Ⅵ), 由34个氨基酸残基组成,含有6个保守的半胱氨酸残基. 运用全细胞膜片钳技术,研究了HNTX-Ⅵ对电压门控钠通道的影响.先前从海南捕鸟蛛粗毒中分离到的几种毒素,具有抑制哺乳动物钠通道激活的特性.本文研究结果表明,HNTX-Ⅵ能以类似于δ-atractoxins作用方式延缓蜚蠊背侧不成对中间(dorsal unpaired median,DUM）神经细胞的钠通道的失活,且导致钠通道稳态失活变得不完全,在预钳制电压大于-55 mV时形成不完全失活结构. HNTX-Ⅵ的这种新的功能不仅为探索钠通道的门控机制提供了有用的工具,也为开发新的安全的杀虫剂提供理论基础.     

河蟹眼柄神经分泌细胞离子通道的膜片钳研究

采用全细胞膜片钳技术对培养12－24小时不同形态河蟹眼柄视节端髓X器官（MTXO）神经分泌细胞离子通道进行了研究。结果表明,河蟹眼柄MTXO中分布的A、B、C三种类型神经分泌细胞均可记录到由向电流和外向电流组成的正常全细胞电流。内向电流由高电压激活钙离子通道电流（Lca)和对TTX敏感钠离子通道电流（INa）组成。ICa的激活电压为－30mV,在0－ 20mV电压下达到峰值,在－40mV和－70mV保持电压下记录的ICa激活阈值、初始峰值及I－V曲线无明显差别。外向电流明显,幅值较大,包括对4－AP敏感的快速激活、快速失活钾离子通道电流（IA）和对TEA敏感的缓慢激活、缓慢失活钾离子通道电流（IK）。正常蟹种、二龄成蟹和早熟蟹种MTXO神经分泌细胞均表达电压门控钠、钾、钙离子通道,通道电流和电压特征无明显区别.     

虎纹捕鸟蛛神经细胞急性分离培养及其电压门控通道膜片钳

探索了虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)食道下神经细胞急性分离培养条件,并利用全细胞膜片钳技术对虎纹捕鸟蛛食道下神经细胞电压门控性钠、钾和钙通道的基本电生理学特性进行了研究.适合虎纹捕鸟蛛神经细胞离体培养的培养基为(g/L):葡萄糖0.7,果糖0.4,琥珀酸0.06,咪唑0.06,L-1513.7,Hepes 2.38,酵母粉2.8,乳白蛋白2.5,青霉素200 IU/ml,链霉素200 mg/ml,小牛血清15%;pH 6.8.该培养基非常适合虎纹捕鸟蛛神经节神经细胞离体培养,细胞在温度(27±2)℃的培养箱中培养2～4h,培养的细胞数目多、结构完整、贴壁效果好,细胞近似汤勺形,有一个长的单极突起,大部分细胞在10～30μm之间.全细胞模式下可以记录到钠、钾和钙三种电压门控离子通道电流.钙电流为高电压激活电流,该电流能够被NiCl2完全抑制;钾电流为瞬时钾电流和延迟整流钾电流,这两类钾电流分别被细胞外液中的4-氨基吡啶和氯化四乙胺所阻断;钠电流为TTX敏感型电流.     

敬钊毒素-Ⅴ的合成、复性及其钾通道活性鉴定

敬钊毒素-Ⅴ(jingzhaotoxin-Ⅴ,JZTX-Ⅴ)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化得到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂.为了深入研究该毒素的功能,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相方法化学合成了JZTX-Ⅴ,合成多肽经谷胱甘肽法氧化复性后,利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离纯化.复性产物的相对分子质量经质谱测定为3 605.51,而与天然毒素混合进行HPLC共洗脱实验时也只得到单一峰.全细胞膜片钳实验显示,JZTX-Ⅴ能够抑制大鼠背根神经节细胞上的A型钾电流,却对外向延迟整流钾电流没有影响,对处于静息关闭状态的A-型钾通道也表现出较高的亲和性.JZTX-Ⅴ对A型钾通道的这种抑制作用具有浓度依从性, 其半数有效抑制浓度(IC50)为52.3 nmol/L. JZTX-Ⅴ通过引起A型钾通道的活化曲线往去极化方向漂移,和失活曲线往超极化方向漂移来改变通道的门控特征.目前的研究结果为深入开展JZTX-Ⅴ的功能研究及分子改造奠定了基础.     

Thr28突变对虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ钠通道活性的影响

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HWTX-Ⅳ)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化到的一种新型多肽类神经毒素,能明显抑制表达于大鼠背根神经节细胞的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道.为了更好地研究该毒素的结构与功能之间的关系,采用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成法合成了用谷氨酸(Glu)替代HWTX-Ⅳ第28位苏氨酸残基的突变体T28D-HWTX-Ⅳ,线性多肽合成产物经反相高效液相色谱(HPLC)分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性.复性产物采用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术鉴定分子质量,通过全细胞膜片钳电生理技术测定其电压门控钠通道药理学活性.当第28位Thr残基被Glu取代后,突变体T28D-HWTX-Ⅳ对表达于大鼠DRG细胞膜上的TTX-S钠通道的IC50值约为362 nmol/L,对TTX-S钠通道的抑制活性比天然HWTX-Ⅳ(IC50值=30 nmol/L)下降了约12倍,显示第28位的Thr残基是HWTX-Ⅳ与TTX-S型钠通道相互作用的关键活性残基.目前的研究为进一步探索HWTX-Ⅳ的结构与功能关系及新型镇痛药物的研发奠定了基础.     

缓激肽对背根节神经元钠通道电流的作用

目的：观察缓激肽(bradykinin,BK)对大鼠背根节神经元电压依赖性钠通道电流的作用。方法：采用全细胞膜片钳技术,记录钠通道电流。结果：缓激肽剂量依赖性(0．01～10μmol／L)增高小细胞背根节神经元诱发放电频率;缓激肽剂量依赖性(O．01～10μmol／L)增加小细胞背根节神经元的河豚毒素不敏感(TTX—resistant,TTX—R)钠电流,对TTX敏感(TTX—sensitive,TTX-S)钠电流无明显影响。结论：缓激肽引起炎性痛的机制可能与TTX-R钠通道电流有关。     

《生命科学研究》2014年封面插图说明

<正>2014年《生命科学研究》封面左上角的插图是海南捕鸟蛛毒素-III(Hainantoxin-III,HNTX-III)的生物活性表面模型图。HNTX-III是由湖南师范大学蛋白质与发育生物学教育部重点实验室从海南捕鸟蛛毒液中分离纯化到的一个新型河豚毒素敏感型钠通道抑制剂,由33个氨基酸残基组成,含有三对二硫     

我国南方捕鸟蛛一新种的生物化学鉴定(蜘蛛目,捕鸟蛛科)

采用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）、激光解析基质辅助电离飞行时间质谱（ＭＡＩＤＩ－ＴＯＦＭＳ）和蛋白质序列分析方法,对从我国海南通什地区发现的一种捕鸟蛛与广西虎纹捕鸟蛛（Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍ ｉａｈｕｗ ｅｎａ）的毒液进行了比较分析． 虽然两种蜘蛛形态十分相似,但其毒液的化学组成和主要毒素的氨基酸序列存在明显的差异,说明两种蜘蛛在进化上有同源性但分化很早．应列为不同种,特将海南发现的蜘蛛新种定名为海南捕鸟蛛,新种Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍ ｉａ ｈａｉｎａｎａ ｓｐ．ｎｏｖ．     

虎纹捕鸟蛛毒素虎纹毒素-III对美洲蜚蠊神经细胞电压门控离子通道的影响

HWTX-III是从中国虎纹捕鸟蛛Ornithoctonus huwena粗毒中分离纯化到的一种昆虫神经多肽。通过应用全细胞膜片钳技术研究了HWTX-III对美洲蜚蠊Periplaneta americana神经细胞电压门控离子通道的影响。发现HWTX-III特异性地抑制美洲蜚蠊背侧不成对中间(dorsal unpaired median, DUM）神经细胞的电压门控钠通道(IC50≈1.106 μmol/L),而对电压门控钾通道没有明显的影响。HWTX-III通过一种新型的不同于其他蜘蛛毒素的机制抑制昆虫电压门控钠通道,它不影响通道的激活与失活动力学,也不明显地漂移稳态失活曲线。HWTX-III对昆虫神经细胞电压门控钠通道的特异性与新型作用机制为研究电压门控钠通道分子结构的多样性以及开发新的安全的杀虫剂提供有用的工具。     

苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ对棉铃虫幼虫神经细胞钠通道的影响

电压门控钠通道是神经细胞兴奋传导的基础,也是杀虫剂最主要的作用靶标。具有二氢沉香呋喃多元酯骨架的苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ是卫矛科植物苦皮藤的主要杀虫活性成分,苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ处理后昆虫的中毒症状分别表现为麻醉和兴奋。本实验应用全细胞膜片钳技术就苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ对棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫离体培养神经细胞钠离子通道的影响进行了比较。结果表明：苦皮藤素Ⅳ对TTX-敏感钠通道电流的抑制明显具有浓度和时间依赖性,高浓度（10 μmol/L和1 μmol/L）条件下,峰值电流迅速减小而被抑制,在较中间浓度（0.1 μmol/L）时缓慢降低,而在低浓度（0.01 μmol/L）下,峰值电流先增加然后再缓慢降低;苦皮藤素Ⅳ对激活电压无明显影响,但使峰值电压向正电位方向移动,在高浓度移动迅速,低浓度移动缓慢。苦皮藤素Ⅴ对TTX-敏感钠通道电流峰值有明显的增大作用,也有一定的浓度依赖性;对激活电压无明显影响,峰值电压在高浓度下变化不明显,在较低浓度(0.1 μmol/L和 0.01 μmol/L)下向正电位方向移动明显。结果说明,苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ可能在钠通道上有一个相同的靶标位点,但由于它们化学结构上的差异,可能对钠通道动力学的修饰 不同,导致不同的生理效应,昆虫表现出不同的神经中毒症状。     

苦参碱对棉铃虫幼虫神经细胞钠通道的影响

用全细胞膜片钳技术研究了生物碱类植物杀虫剂苦参碱对棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫离体培养中枢神经细胞钠离子通道门控过程的影响。结果表明： 苦参碱对棉铃虫幼虫神经细胞所表达的TTX （tetradotoxin, 河豚毒素)敏感钠通道具有浓度依赖性阻滞作用,1,10和100 μmol/L的苦参碱作用5 min后,分别使钠电流峰值较给药前下降（12.49±1.67）%、（18.79±2.16）%和（43.15±8.17）% (n=8, P<0.05)。苦参碱使钠电流的电流 电压关系曲线上移,但并不改变其激活电压、峰电压和电流电压关系曲线的形状。苦参碱对钠通道的阻滞作用可能是其具有某些毒理效应的离子基础。     

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ的二硫键定位分析

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ是从虎纹捕鸟蛛毒液中分离得到的一种昆虫毒素.它含有35个氨基酸残基,其中6个半胱氨酸形成三对二硫键.首先采用多酶将天然的肽链裂解后,通过MALDI-TOF质谱分析酶解肽段,推断出1对二硫键位于Cys9-Cys21,然后利用改进的部分还原分步测序法,确定虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ的另外2对二硫键的配对方式为Cys2-Cys16和Cys15-Cys28.因此,虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ的3对二硫键分别以Cys2-Cys16,Cys9-Cys21,Cys15-Cys28（即1-4、2-5和3-6）的方式配对.     

虎纹捕鸟蛛毒素—I（HWTX—I）对豚鼠回肠的作用机制研究

虎纹捕鸟蛛毒素ＨＷＴＸ－Ｉ（５ｍｇ／Ｌ）对电刺激豚鼠回肠引起的一过性收缩有非常明显的抑制作用．ＨＷＴＸ－Ｉ的抑制作用发生后,乙酰胆碱（ＡＣｈ）诱发的回肠收缩幅度与使用ＨＷＴＸ－Ｉ前无明显差异．在使用酚妥拉明后,ＨＷＴＸ－Ｉ仍能抑制豚鼠回肠的一过性收缩．ＨＷＴＸ－Ｉ对豚鼠回肠的抑制作用主要是抑制ＡＣｈ释放或影响ＡＣｈ释放之前的过程     

海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ突变体的固相合成和生理活性分析

海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HNTX-Ⅳ)是从我国海南捕鸟蛛粗毒中分离出的一种TTX-敏感型的钠离子通道阻断剂,由35个氨基酸残基组成,含3对二硫键.为了研究HNTX-Ⅳ结构与功能的关系,用芴甲氧羰基(Fomc)固相多肽合成方法合成了用丙氨酸(Ala)替代HNTX-Ⅳ第12位丝氨酸(Ser12)的突变体S12A-HNTX-Ⅳ和替代第29位精氨酸(Arg29)的突变体R29A-HNTX-Ⅳ.合成的突变体经谷胱甘肽法氧化复性和纯化后,分别用MALDI-TOF质谱进行分子量鉴定,用一维核磁共振波谱法分析空间结构的变化,膜片钳电生理方法分析生物学活性.结果表明,Ser12和Arg29被Ala突变后没有明显影响分子的空间结构,S12A-HNTX-Ⅳ的生物学活性与天然HNTX-Ⅳ的相近,提示Ser12与HNTX-Ⅳ的生物学活性无关或关系不大;而R29A-HNTX-Ⅳ的生物学活性下降了155倍,说明Arg29是与HNTX-Ⅳ生物学活性相关的关键残基之一.推测R29A-HNTX-Ⅳ活性的降低是由于Ala替代Arg后改变了HNTX-Ⅳ与受体作用的位点,而不是由于毒素分子整体空间结构变化所致.     

敬钊毒素-Ⅲ对Nav1.8通道的抑制作用

敬钊毒素-Ⅲ(JingzhaotoxinⅢ,JZTX-Ⅲ)是从敬钊缨毛蛛毒液中分离到的一种门控调节型毒素,能选择性抑制钠通道亚型Nav1.5激活,但对其他6种钠通道亚型(Nav1.1 Nav1.4 Nav1.6和Nav1.7)无抑制作用。为了更好地研究钠通道结构与功能之间的关系,采用全细胞膜片钳技术检测了JZTX-Ⅲ对表达在ND7123细胞上的Nav1.8画道的影响。结果显示,JZTX-Ⅲ抑制Nav1.8电流,并且这种抑制作用具有时间和浓度依赖性,抑制时间常数和IC_(50)值分别为41.15±0.6 s和1.4±0.23μmol/L;1μmol/JZTX-Ⅲ使Nav1.8画道的电流-电压关系曲线和激活曲线分别向去极化方向漂移10 mV和9mV,使Nav.1.8通道的稳态失活曲线向超极化方向漂移16 mV,明显改变Nav1.8通道的激活和稳态失活动力学。此外,钠通道序列比对结果提示JZTX-Ⅲ可能通过结合Nav1.8通道DIIS3~S4连接环上的Lys(K)残基抑制Nav1.8通道。以上研究结果为进一步探索钠通道结构与功能之间的关系奠定了基础。