反义RNA抑制猪传染性胃肠炎病毒复制的研究

根据反义RNA作用原理,设计一条互补猪传染性胃肠炎病毒基因(26888—27184)区的反义RNA序列。将该序列与逆转录病毒表达载体构建成质粒PLXSN—N5’,并与质脂体共转染PA317细胞,经G418(500μg／ml)筛选出稳定的产毒细胞克隆。取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,测定细胞克隆产生的假病毒滴度,用高滴度假病毒感染IBRS2细胞。提取被感染的IBRS2细胞总DNA和RNA,通过PCR和RT_PCR证明PL,XSN—N5’整合到IBRS2细胞基因组。病毒感染细胞病变表明,反义RNA有明显抑制TGEV复制的作用。     

反义RNA抑制猪传染性胃肠炎病毒复制的研究

根据反义RNA作用原理,设计一条互补猪传染性胃肠炎病毒基因(26888-27184)区的反义RNA序列.将该序列与逆转录病毒表达载体构建成质粒PLXSN-N5',并与质脂体共转染PA317细胞,经G418(500μg/ml)筛选出稳定的产毒细胞克隆.取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,测定细胞克隆产生的假病毒滴度,用高滴度假病毒感染IBRS2细胞.提取被感染的IBRS2细胞总DNA和RNA,通过PCR和RT-PCR证明PLXSN-N5'整合到IBRS2细胞基因组.病毒感染细胞病变表明,反义RNA有明显抑制TGEV复制的作用.     

猪水泡病病毒VP1基因的克隆和表达

以猪水泡病病毒RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了849bp的VP1基因,通过T-A克隆技术,将VP1基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建SVDV VP1基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析.然后亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP1基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了猪水泡病病毒VP1基因重组表达载体.经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP1蛋白抗原.SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002%的L-阿拉伯醛糖进行诱导,5h后表达可达到高峰,表达蛋白为融合蛋白,质量约47.13kDa,表达产量约占菌体总蛋白的16%.Western blotting检测表明,诱导的蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应.融合蛋白中含有猪水泡病病毒VP1蛋白抗原,为应用该表达蛋白抗原制备SVD免疫血清学诊断试剂和新型疫苗构建奠定基础.     

猪水泡病病毒VP1基因的克隆和表达

以猪水泡病病毒RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了849bp的VP1基因,通过T-A克隆技术,将VP1基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建SVDVVP1基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP1基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了猪水泡病病毒VP1基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP1蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002%的L-阿拉伯醛糖进行诱导,5h后表达可达到高峰,表达蛋白为融合蛋白,质量约47.13kDa,表达产量约占菌体总蛋白的16%。Westernblotting检测表明,诱导的蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。融合蛋白中含有猪水泡病病毒VP1蛋白抗原,为应用该表达蛋白抗原制备SVD免疫血清学诊断试剂和新型疫苗构建奠定基础。     

猪水泡病病毒VPl基因抗原区的原核表达

利用RT-PCR和nested PCR(nPCR)技术扩增出猪水泡病病毒VPl基因的抗原区,将其克隆到表达载体pProEX-HTb中,获得重组质粒,经PCR、酶切和序列分析鉴定表明,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确。将重组质粒导入BL21(DE3),经IPTG诱导表达后SDS-PAGE检测表明,重组菌能表达猪水泡病病毒VPl抗原区蛋白;Western blot检测表明,诱导表达的抗原区蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。     

猪水泡病病毒VP2基因抗原区在大肠杆菌中的表达

利用RT_PCR技术 ,以SVDVHK’70为材料 ,扩增出VP2基因抗原区。将目的基因的PCR扩增产物直接进行双酶切 ,然后将酶切产物与酶切后的表达载体pGEX 4T_1进行连接 ,转化BL2 1菌体并提质粒 ,经酶切、PCR鉴定为阳性的重组质粒命名为pGEX_VP2 ,并测序。测序结果表明 ,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确 ,表达载体构建成功。将含有阳性质粒的BL2 1菌液经IPTG诱导后进行SDS_PAGE分析 ,出现预期的目的蛋白条带 ,此目的蛋白经Westernblot检测确定其有免疫活性。     

猪传染性水疱病病毒(SVDV)在微细胞和微胞质体内的复制

本实验研究了SVDV在微细胞和微胞质体两种非完整细胞体系内的复制。用秋水仙素处理IB-RS-2细胞,在含有松胞素B的Ficoll 400不连续梯度中进行高速离心,制备了大量的微细胞。微细胞在正常的培养条件下60小时后仍有70%以上存活,用SVDV感染只需4—5小时就几乎全部脱落。并证明微细胞能繁殖出有感染力的子代病毒。用松胞素B去核技术制备的微胞质体,运用扫描电镜和显微放射自显影的方法证实了SVDV可以在微胞质体内复制病毒RNA,并引起微胞质体病变。同时纯化了用松胞素B处理悬浮的IB-RS-2细胞而制备的大量的微胞质体,SVDV感染后,可以产生一定数量的有感染力的子代病毒。虽然滴度低于完整细胞繁殖的病毒,但证明了SVDV可以利用微胞质体中少量的细胞成分和酶类完成其感染、复制和装配一系列繁殖过程,产生有感染力的子代病毒。     

猪水泡病病毒全基因组核苷酸序列的测定与分析

猪水泡病是由猪水泡病病毒(Swine vesicular disease virus,SVDV)引起的猪的一种急性传染病,在症状上与口蹄疫极其相似。该病流行性强,发病率高,能造成严重的公共卫生问题。国际兽医局将其列为动物A类传染病,我国农业部列为动物一类传染病。SVDV属于小RNA病毒科肠道病毒属,其核酸类型为单股正链RNA分子,无囊膜,病毒基因组含一个大的开放阅读框,编码一条由2185个氨基酸组成的多聚蛋白。     

猪水泡病病毒VP1基因抗原区的原核表达

利用RTPCR和nested PCR(nPCR)技术扩增出猪水泡病病毒VP1基因的抗原区，将其克隆到表达载体pProEXHTb中，获得重组质粒，经PCR、酶切和序列分析鉴定表明，目的基因插入的位置、大小和读码框均正确。将重组质粒导入BL21（DE3），经IPTG诱导表达后SDSPAGE检测表明，重组菌能表达猪水泡病病毒VP1抗原区蛋白；Western blot检测表明，诱导表达的抗原区蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。     

猪瘟病毒的形态结构与形态发生

建立了猪瘟病毒(CSFV)弱毒疫苗Thiverval株(T株)与中 国兔化弱毒疫苗C株在MPK细胞中的感染模式。使用MPK细胞增殖CSFV,其病毒滴度明显提高,从而为应用电镜超薄切片技术研究猪瘟病毒的形态结构与形态发生提供了可能性。猪瘟病毒呈圆形颗粒,直径约为70nm。其内部是电子致密的核心,直径约为40nm,有时呈六角形;外有包膜包裹。在CSFV感染的MPK细胞质中,可观察到处于不同发育阶段的子代病毒粒子。此外,猪瘟病毒的感染能够引起某些宿主细胞超微结构上的变化。     

猪水泡病病毒强致病性毒株主要保护性抗原蛋白基因cDNA的序列测定与分析

从猪水泡病病毒（ＳＶＤＶ）细胞培养物的ＰＥＧ浓缩毒中提取病毒ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ和套式ＰＣＲ扩增病毒主要保护性抗原蛋白基因,将扩增产物１．６ｋｂ插入ｐＵＣ１８载体中,经亚克隆后用双脱氧链终止法测定其序列,与已发表的ＳＶＤＶ分离物该区序列作比较,核苷酸同源性为９６％－９７％,氨基酸同源性为９８％,参与构成ＳＶＤＶ中和性抗原位点的几个氨基酸残基均很保守;与已发表的柯萨奇Ｂ５病毒的对应序列比较,两者核苷酸序列同源性为７７％,而推导的氨基酸顺序同源性竞高达９２％。本文结果有助于ＳＶＤＶ的分子流行病学研究,并为其和柯萨奇Ｂ５病毒的相互关系提供参考数据,为ＳＶＤＶ新型疫苗研究提供了基础材料     

ELECTRON MICROSCOPIC STUDIES ON THE DEVELOPMENT OF VESICULAR STOMATITIS VIRUS IN KB CELLS

The development of vesicular stomatitis virus in KB cells was studied by electron microscopy. Sections of infected cells were made 1, 4, 7, 10, and 20 hours after inoculation of the cell cultures, and at the same intervals the supernatant fluid was assayed for virus titer by the plaque test in chick embryo cells. At 10, 14, and 20 hours after inoculation, virus rods were observed attached to cytoplasmic membranes, inside cytoplasmic vacuoles, and attached to the membranes delimiting these vacuoles; they were also found on the surface membrane of the cells. Besides the rods, spherical particles of different sizes and shapes were seen. The possibility that these structures are related to the development of virus rods is discussed. A similarity was noted between the site of maturation of vesicular stomatitis virus rods and that of some other arbor viruses.     

传染性牛鼻气管炎病毒和山羊痘病毒从细胞表面释放的研究

利用扫描电镜和细胞表面复型透射电镜技术,研究了传染性牛鼻气管炎病毒和山羊痘病毒分别从牛肾细胞和羊睾丸细胞表面的释放。根据表面形态结果观察,说明病毒是以出芽、细胞裂解、特殊通道和通过绒毛等多种方式释放。本文对病毒的形态、释放数量和分布以及同细胞之间的关系也进行了描述。     

细胞松驰素B对牛传染性鼻气管炎病毒感染与复制的影响

体外培养的牛肾细胞,经浓度为50μg/ml的细胞松弛素B(CB)处理2小时后,牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)仍能侵入细胞,繁殖的子代病毒数量不受影响。然而当同样浓度的CB在病毒的整个繁殖期中持续存在时,病毒的繁殖即完全被抑制。说明细胞的吞噬作用至少不是这种病毒进入细胞的唯一方式,可能病毒囊膜与细胞膜的融合是病毒进入细胞的主要方式;而在侵入细胞后的病毒繁殖过程中,细胞微丝和其它对CB敏感的系统起着不可缺少的作用。降解微丝对IBRV的早期发生有明显的影响,其效应强度与CB的浓度有关。还观察到CB处理对病毒形态发生方式有明显影响。     

厦门港球型侧腕水母(Pleurobrachia globosa Moser)的生殖

球型侧腕水母是厦门港最常见、数量最大的栉水母。雌雄同体。主要生殖季节在4—7月,是水产养殖业的重要敌害。精、卵多在下半夜排放。精子和卵子分别由位于两栉毛板之间的输精孔和输卵孔排出。卵子呈圆球状,其外为一层透明的胶质卵膜。平均卵径为319.2±57.5μm。胚胎发育在胶质膜内进行。当膜内幼体的雏形平衡囊、栉毛带、口及口道形成之后,幼体便用口及口道顶破胶质膜而孵出。