人γ干扰素的结构特征

<正> γ干扰素(IFN-γ)是人体三种主要的干扰素之一,现已表明其具有抗增殖、免疫调节和抗病毒等广泛的生物学活性。在理化性质方面,IFN-γ不同于α干扰素(1FN-α)和β干扰素(1FN-β)。由互补DNA(cDNA)推断1FN-γ,为146个氨基酸的多肽链。天然IFN-γ的纯化与结构分析表明有两种主要的活性分子,其分子量分别为25KDa和20KDa,两者的氨基酸序列完全相同,均     

猪I型与II型干扰素的克隆、表达及抗病毒活性比较

干扰素(IFN)是由多种细胞受病毒感染或其他生物诱导剂刺激而产生的天然蛋白质,主要功能为抗病毒增殖、调节免疫反应和激活免疫细胞等。本研究克隆并测序了猪干扰素(PoIFN)α、γ、αγ及ω基因。构建原核表达载体pET-His/PoIFN-α、pET-His/PoIFN-γ、pET-His/PoIFN-αγ和pET-His/PoIFN-ω,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,经纯化、复性得到具有生物学活性的蛋白。用细胞病变抑制法在Marc-145/PRRSV、Marc-145/VSV、PK-15/VSV、Vero/VSV、MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定,结果表明猪α和αγ融合干扰素有较为显著的抗病毒活性,抗PRRSV活性高达108U/mg;猪γ干扰素活性效价约为α干扰素的1/2到1/3;猪ω干扰素几乎未检测到抗病毒活性,需进一步验证。本研究对干扰素在抗病毒、提高机体免疫方面的应用提供了理论依据。     

不同型别的基因工程干扰素抗病毒活性的比较

对大肠杆菌生产的不同型别的基因工程干扰素rIFN-α1(α1)、rIFN-αA(αA)、rIFN-β17ser(β17ser)和rIFN-γ(γ),以及自然人白细胞干扰素nIFN-αco,在不同细胞上对不同病毒的抗病毒活性做了比较研究。证明:①α1抗病毒作用的细胞谱较广,尤其在牛肾MDBK细胞和猪肾PK细胞上有很高的活性,分别为在人细胞上的29倍和7倍。β17ser和γ在异种细胞上活性极低,在鼠、猪和牛肾细胞上的活性为人细胞上的1～2％以下。②5种干扰素对麻疹、CoxB1、Sindbis、腺病毒7型和Ⅰ、Ⅱ型单纯疱疹病毒的抗病毒活性无明显差异。但不同病毒对干扰素的敏感性有明显差别,以Sindbis病毒为最敏感,7型腺病毒最不敏感。③5种干扰素对流行性出血热病毒均有明显的抗病毒作用,尤以人α1型和β干扰素作用最强,α1对出血热病毒的抗病毒活性是对滤泡性口膜炎病毒(VSV)的1/2.85,人β干扰素是对VSV的1/4.1。上述结果为人基因工程干扰素的临床应用提供了实验依据。     

鸡α干扰素在家蚕中的表达及抗病毒活性测定

鸡α干扰素在防御病毒感染及治疗病毒性疾病中起着重要的作用。旨在利用家蚕杆状病毒表达系统研制有活性的鸡α干扰素。首先对鸡α干扰素基因(ChIFN-α)进行了优化与合成,将其克隆到杆状病毒转移载体pVL1393中,与ORF1629缺损的亲本病毒BmBcmid共转染,纯化重组病毒,再感染家蚕幼虫,收集蚕血淋巴以检测α干扰素基因的表达。Western blot分析结果显示,成功表达出分子量约为19 kD的鸡α干扰素。采用细胞病变抑制法在Vero-VSV*GFP系统中测定表达产物的抗病毒活性。所的表达的鸡α干扰素具有明显的抗病毒活性,活性不低于3.2×105 U/mL。利用杆状病毒载体系统成功地表达了具有抗病毒活性的鸡α干扰素的成熟蛋白,为开发廉价高效的鸡干扰素生物制剂奠定了物质基础。     

猪γ干扰素的表达及其抗病毒活性的安全检测

为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性,本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒(VSV△G*G)为指示病毒,分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素(PoIFN-γ)在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示:由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性,其抗病毒活性为105IU/mL,原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性,其抗病毒活性为32IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒(VSV*GFP)所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致,表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品,使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。     

人α和γ干扰素联合应用的抗病毒协同作用

采用病毒产量减少试验,在A_(540)细胞上观察α和γ干扰素联合应用的抗病毒协同作用。结果表明:协同倍数为5-16倍;协同作用由干扰素本身的性质所决定,与其它成分无关;α干扰素不能促使γ干扰素加快透生抗病毒状态的建立;故认为协同作用的产生与两型干扰素的细胞受体不同以及抗病毒的生化途径不同有关。     

经体外缺失诱变组建人杂交干扰素αA/γ

使用寡核苷酸指导的定点突变方法,将人αA型干扰素的完整基因与γ干扰素C端16个氨基酸的编码序列融合,在噬菌体λP_L启动子控制下,合成了一个杂交蛋白质。此蛋白质经抗人α干扰素单克隆抗体纯化后,在MDBK细胞上具有抗病毒活性,并像γ干扰素一样,可被依赖于cAMP的蛋白激酶磷酸化。[γ-~(32)P]杂交蛋白与MDBK细胞的结合,可被αA型干扰素大大抑制(70％)。     

淋巴因子和干扰素

用a-干扰素预先处理(每毫升1500国际单位作用4小时)经伴刀豆球蛋白A激发的白细胞,即使在大规模情况下也是非常适合于竹干扰素的生产。这种产物表明具有分子量分别为51 000和 23 600道尔顿的两个抗病毒活性峰     

猪脾细胞干扰素与人白细胞干扰素之间的抗原性关系

我们应用中和试验在不同细胞上对干扰素血清与猪脾细胞干扰素(PSIFN)及人干扰素(HuIFN-α)的中和能力进行了试验,结果证明HuIFN-α多克隆抗体具有明显的中和PSIFN的能力。而人免疫干扰素(Hu IFN-γ)抗体具有微弱的中和猪脾细胞干扰素能力。猪脾细胞干扰素不仅可在同源细胞表现出抗病毒活性,而且可在异源细胞表现出较高的抗病毒活性。应用人白细胞干扰素多克隆抗体亲和层析可有效地分离猪脾细胞干扰素,证实猪脾细胞干扰素与人白细胞干扰素之间具有高度的同源性关系。     

新型猫源干扰素FeIFN-ω与干扰素FeIFN-α的表达及抗病毒活性比较

ω型干扰素(IFN-ω)与α型干扰素(IFN-α)同属于Ⅰ型干扰素,都具有抗病毒,抗增殖和免疫调节的功能,但它们之间的活性却存在较大差异.通过PCR扩增猫ω型干扰素基因(FeIFN-ω),根据GenBank公布的猫α型干扰素基因序列,合成猫α型干扰素基因(FeIFN-α).分别构建原核表达载体pET-His/FeIFN-α和pET-His/FeIFN-ω,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达.表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,复性后蛋白用细胞病变抑制法进行抗病毒活性测定.结果显示,重组猫ω型干扰素(FeIFN-ω)抗病毒活性明显高于重组猫α型干扰素(FeIFN-α),尤其对H9N2亚型禽流感病毒(AIV),FeIFN-ω的活性是FeIFN-α的160倍,对犬瘟热病毒(CDV),FeIFN-ω的活性是FeIFN-α的4倍,而日本同类产品Intercat 对CDV和AIV均未表现活性.以上研究为以ω型干扰素为基础的抗病毒药物应用奠定了重要的理论基础.     

猪β防御素2与猪γ干扰素在毕赤酵母中的融合表达及生物学活性比较

为了研究猪β防御素2(PBD-2)与猪γ干扰素(PoIFNγ),采用重叠延伸PCR法合成嵌合编码序列PBD-2-PoIFNγ,在此序列的基础上扩增PoIFNγ基因,并分别克隆入毕赤酵母表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ与pPICZαA-PoIFNγ。经SacI线性化,电击转化巴斯德毕赤酵母X33,筛选阳性重组子,在含0.5%甲醇的BMMY培养基中诱导72h。SDS-PAGE及Western blotting结果表明,所获得的重组子能够分别分泌表达PBD-2-PoIFNγ融合蛋白与PoIFNγ。琼脂扩散法和细胞病变抑制法未检测到融合蛋白的抑菌和抗病毒活性,而PoIFNγ具有明显的抗病毒活性。圆二色谱分析显示PoIFNγ与PBD-2-PoIFNγ的螺旋和无规则卷曲含量差别较大,推测是融合蛋白未能正确折叠影响了PBD-2-PoIFNγ的活性。     

聚乙二醇化干扰素的抗病毒和抗肿瘤活性的研究

观察聚乙二醇化干扰素 (PEG IFNα2b)抗病毒和抗肿瘤的生物学活性 ,并与干扰素 (IFNα2b)进行比较。结果表明 :PEG IFNα2b抗病毒活性约下降 15倍 ,但抗人肿瘤细胞增殖的活性明显增强。     

利用TGATG序列在大肠杆菌中直接表达非融合的人αD型干扰素

本文利用人αD型干扰素基因信号多肽编码区内自身的TGATG序列,在大肠杆菌中有效地表达非融合的人αD型干扰素。其根据是:第一,纯化干扰素的分子量为19.5k,而不是27k的融合蛋白;第二,干扰素活性峰的分布集中在19.5k附近;第三,干扰素抗体的吸收峰与其活性峰相一致;第四,纯化干扰素N端序列分析证明DNA水平设计的准确性。同时,还证明大肠杆菌能够识别并加工人αD型干扰素信号多肽。 在探讨TGATG序列对下游基因表达的影响时发现,“翻译联结”(ATG-TGATG)方式起始的基因表达水平比一般ATG起始方式高约10倍;而在ATG-TGATG起始方式中,第一和第二种读码框架之间的距离,即使相差27个氨基酸编码序列,后一种基因的表达水平也无明显差异。     

鸡γ干扰素的可溶性表达及纯化产物的抗病毒活性

【目的】克隆鸡γ-干扰素（chIFN-γ）基因,大肠杆菌表达及产物纯化与活性检测。【方法】通过RT-PCR方法用ConA刺激的20日龄SPF鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出chIFN-γ成熟蛋白基因cDNA,克隆至原核表达载体pET-32a (+),构建重组表达质粒pET-32a (+)-chIFN-γ,在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达,利用镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDS-PAGE、Western blot鉴定。利用MDCK-VSV系统测定抗病毒活性。【结果】克隆得到456 bp 的chIFN-γ成熟蛋白编码基因,大肠杆菌中成功表达chIFN-γ蛋白,分子量约为31.0 kDa,能与抗His的单克隆抗体和兔源多抗血清发生特异性反应。表达蛋白一部分形成包涵体,另一部分以可溶形式存在,可溶性蛋白经镍柱在天然条件下的纯化得率为3.0 mg/mL。生物学活性试验表明,1:32 稀释纯化的重组chIFN-γ （rchIFN-γ）孵育MDCK细胞后能抵抗100TCID50的VSV攻击。【结论】通过镍柱天然纯化获得的rchIFN-γ具有较好的抗病毒活性,为研制新型抗病毒干扰素制剂奠定基础。     

γ-干扰素时间分辨免疫荧光分析方法的建立

采用生物素-Eu³⁺标记链亲和素双抗体夹心时间分辨免疫荧光分析技术(TRIFMA),建立新的γ-干扰素检测技术,提高γ-干扰素检测方法的灵敏度.用固相包被的兔多抗捕获样品中IFN-γ,以具有中和IFN-γ抗病毒活性的生物素化单抗作为二抗体,再加Eu³⁺标记链亲和素并荧光检测.已知不同浓度标准IFN-γ CPS值的标准曲线,判断待检样品中IFN-γ量.本方法最低检测值为0.02 μg/L,检测范围为0.02～400 μg/L,而TNF-α,IL-2和IFN-α等细胞因子无交叉反应.对基因工程IFN-γ的生产,纯化过程中定性, 定量监控以及对培养细胞上清中IFN-γ量的检测等都有实用价值.     

羊α干扰素在家蚕中的表达及抗小反刍兽疫病毒活性测定

干扰素具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性,可增强机体抗病毒能力,已经广泛应用于病毒性疾病的防控.小反刍兽疫病毒是危害山羊、绵羊等小反刍动物常见的病毒之一,该病毒的传播对全球养殖业造成了严重的影响.为了表达具有高效抗病毒活性的羊α干扰素(OviIFN-α),将OviIFN-α基因序列根据家蚕密码子偏好性进行优化合成,构建pVL1...     

人干扰素α2b和IgG Fc片段融合蛋白显著延长体内半衰期

重组人干扰素α(rHuIFNα)已被广泛用于临床治疗多种人类病毒性疾病和肿瘤。但IFNα在体内半衰期较短从而导致IFNα在用药后数小时即从血浆中被清除。目前常用化学修饰和构建融合蛋白的方法来延长IFNα的半衰期。在本研究中, 构建了IFNα2b与人IgG免疫球蛋白Fc片段的融合基因(IFNα2b-Fcγ)并在毕赤酵母中以二聚体形式分泌表达, 并有部分糖基化。不同亚型Fcγ片段的融合蛋白对IFNα2b抗病毒活性均有一定影响。其中IFNα2b-Fcγ2所受影响最小, 较单纯的IFNα2b降低了2.3倍, 抗病毒活性可达4.29x107 IU/mg, 大鼠皮下注射后循环血液中半衰期达65 h, 血液中存留时间120 h以上, 比商品重组干扰素的体内半衰期延长约8倍, 血液存留时间延长10倍, 显示了其良好的临床应用 前景。     

利用圆二色谱和流式细胞术分析干扰素-α的构象与其抗病毒活性的相关性

利用圆二色谱(Circular dichroism,CD)和流式细胞术(Flow cytometry,FCM)分析干扰素(Interferon,IFN)-α的构象与其抗病毒活性之间的关系。以重组人IFN-α(rIFN-α2b和rIFN-α2a)为材料,变温CD谱分析表明,在65℃以下,两种IFN-α的二级结构相对稳定,当温度高于65℃以后,两者的二级结构发生不可逆的改变。FCM分析构象变化前后IFN-α的抗病毒活性发现,构象的改变一定程度上减弱了其抗病毒活性。rIFN-α2b和rIFN-α2a具有相似的变化趋势。以上结果表明,IFN-α的构象是影响其抗病毒活性的重要因素之一,同时也验证了CD结合FCM是分析蛋白质药物构象与其细胞水平上生物学活性相关性的较好组合。     

干扰素-α和-γ对灌流假孕大鼠卵巢黄体的作用

利用假孕大鼠卵巢体外灌流方法研究干扰素－α和－γ对黄体分泌孕酮和前列腺素Ｆ－２α的作用,并测定灌流后卵巢中３β－羟甾脱氢酶和２０α－羟甾脱氢酶的活性。观察灌流假孕第８天大鼠卵巢结果表明,三种不同剂量（５０、１００、１０００ｕ／ｍｌ）的干扰素－α和－γ均能抑制孕酮的分泌,但干扰素－α的抑制作用仅在短时间内发生,干扰－α和－γ均有抑制ｈＣＧ诱导孕酮分泌的作用,但有剂量和作用时间差异。两种不同类型的干扰素对卵巢分泌前列腺素Ｆ２α无显著作用。干扰－α对灌流８小时后卵巢中３β－羟甾脱氢酶的活性无显著作用,但是干扰素－γ显著抑制３β－羟甾脱氢酶的活性,两种类型的干扰素对２０α－羟甾脱氢酶的活性无显著作用。实验结果提示：两种类型的干扰素都能降低灌流假孕大鼠卵巢黄体孕酮的水平,但是呈现不同的抑制机制。     

毕赤酵母表达猪干扰素-γ基因及其抑制蓝耳病病毒效果

为了研究和应用猪重组干扰素-γ（rPoIFN-γ）预防和治疗病毒性疫病,将大白猪PoIFN-γ基因插入到酵母整合载体pHIL-S1、构建了重组GS115工程菌（pHIL-S1/rPoIFN-γ）。经过SDSPAGE、Western blot分析和抗滤泡性口炎病毒（VSV）活性测定,证实rPoIFN-γ分子量为18 kD,在GS115中的表达量为18%;其抗VSV活性为450～540 u/mL。用rPoIFNγ处理猪肺巨噬细胞系Marc145后,经细胞病变抑制法（CPE50）测定,rPoIFNγ可以抵抗蓝耳病病毒（PRRSV）感染。结果显示酵母表达的rPoIFN-γ是有应用价值的抗病毒生物工程制剂。