应用Vero细胞法测定重组减毒绿脓杆菌外毒素A的残余毒力

绿脓杆菌外毒素A(ETA)有ADP -核糖基转移酶的活性 ,在真核细胞中通过催化ADP -核糖基团从NAD+转移到EF 2 (延长因子 2 ) ,使蛋白质合成终止 ,致细胞死亡 ,其作用机制、机理与白喉毒素相同。本文应用Vero细胞法测定了绿脓杆菌外毒素A的毒性 ,发现Vero细胞对绿脓杆菌外毒素A的敏感度高达 3.0× 10 -5mg/ml,且精密度高 ,准确性好 ,是一种有效、可行的绿脓杆菌外毒素毒力的测定方法。对 3批经基因工程减毒后样品的残余毒力进行了测定 ,发现样品基本无细胞毒性 ,毒力比原毒素低 2× 10 15倍     

测定血清中白喉抗毒素含量的Vero细胞试验的改进

<正>Vero细胞试验已经被应用在测定人血清中白喉抗毒素的保护力或者通过测定免疫小鼠血清中抗毒素滴度评价白喉类毒素的效力。 白喉毒素能抑制培养物中Vero细胞的新陈代谢和存活,这种毒素效应可以被血清样品中的白喉抗毒素中和。在Vero细胞上,血清样品的滴度在有固定量的白喉毒素存在时被测出。Vero试验是根据在微     

白喉毒素单克隆抗体的研究

自从1975年Kohler和Milsbein证明骨髓瘤细胞与免疫动物脾细胞融合成杂交细胞系,并能分泌与免疫抗原相应抗体之后,它已成为许多领域中比较理想的工具。白喉毒素是一个最早被发现的细菌性毒素     

细菌毒素的膜受体

<正>对某些个别的或性质相似的毒素其结构功能关系和作用机理,已经发表了很多综述性的文章。本文旨在综述有关细菌毒素,特别是毒素受体和它们相互作用的最新文献。但我们所述及的,仅限于A-B结构(用于比较的大肠杆菌的耐热毒素除外)的多肽毒素。其中的一些毒素开始被合成为单链,只是经过蛋白酶解后才成由二硫键联结的A-B分子的双链(包括白喉毒素、绿脓杆菌外毒素A、破伤风毒素和肉毒毒素)。另一些毒素则是由单独合成的亚单位或原体联结在一起才成为A-B结构的(如霍乱毒素、大肠杆菌不耐热毒素、百日咳菌毒素和痢疾毒素)。另外,     

绿脓杆菌的粘附素

绿脓杆菌的粘附功能被认为是绿脓杆菌呼吸道感染的首要一步。粘液型菌株是由细胞外粘多糖（ＭＥＰ）介导,而非粘液型菌株则由菌毛（Ｐｉｌｉ）介导,国内外文献早有报道并认为ＭＥＰ和菌毛均为绿脓杆菌的粘附素。绿脓杆菌的菌毛与菌体的粘附、动力和噬菌体的吸附有关。ＭＥＰ除了粘附功能外,尚与抑制白细胞的吞噬作用、抑制抗ＬＰＳ抗体介导的调理吞噬作用有关,并能增强菌株对抗体包被的抵抗力。     

白喉毒素类免疫毒素研究进展

白喉毒素类免疫毒素是将缺失天然受体结合活性的白喉毒素片段或突变体与抗体或细胞因子偶联而得到的一类新型导向药物,它可特异性识别并结合靶细胞,通过发挥其ADP核糖基化活性而抑制细胞蛋白合成,引发细胞凋亡。由于白喉毒素类免疫毒素能高效、特异地杀伤特定靶细胞,而使其在肿瘤等疾病的药物开发中暂露头角。综述了基于白喉毒素的免疫毒素的研制现状与应用前景 。     

杀伤血管内皮生长因子受体 1 阳性细胞的靶向毒素

白喉毒素 (diphtheria toxin DT) 是棒状白喉杆菌被β噬菌体感染后分泌的一种外毒素. 它可以阻断真核细胞的蛋白质合成,杀死细胞. 血管内皮生长因子 (VEGF) 的 R82A, K84A, H86A 突变体可以和肿瘤血管上高表达的 VEGF 受体 1 (VEGFR-1) 特异性结合. 首先从白喉杆菌中提取基因组 DNA,扩增出白喉毒素 C 区、 T 区基因. 并运用点突变技术,制成 VEGF 的 R82A, K84A, H86A 突变体. 利用这个可以和肿瘤血管上特异性受体相结合的 VEGF 的突变体,代替白喉毒素上的受体结合区,制成了针对 VEGFR-1 的靶向融合毒素——— DT391-mVEGF. 以去除了受体结合区的 DT391 为阴性对照,细胞实验表明,融合毒素对 VEGFR-1 阳性的肿瘤细胞有特异性杀伤作用.     

霍乱和鼠疫病原菌蛋白毒素的分子结构及其功能

<正>细菌毒素的研究始于19世纪末分离出白喉毒素后,其后也分离并研究了其它细菌毒素。经查明大多数细菌毒素为蛋白性,并具有结合部位和活性功能。毒素分子具有结合功能的部分使毒素粘着于特定细胞的相应受体上,然后分子的活性部分施展毒性作用。研究结果指出没有结合部位的毒素分子不能体现生物学作用,尽管分子中仍保持具有活性功能的部位。 由于积累了许多有关细菌毒素的资料,有必要对其系统化和分类。在许多著作中都阐述了一些主要细菌毒素的分类法。Bonventre提出根据毒素分子的结构特点进行分     

肿瘤细胞靶向性白细胞介素4(IL-4)融合蛋白的研究

白细胞介素 4受体 (IL-4R)特异地存在于多种肿瘤细胞表面 ,这为某些肿瘤的治疗提供了一个靶向标记。在以前的研究中 ,人白细胞介素-4(Hil-4)与白喉毒素 (DT)的融合蛋白 (DT4H)被构建 ,且它对某些肿瘤细胞系的高毒性得到了证明。但是 ,由于毒素部分的强免疫原性 ,它可以诱导人体的免疫反应。该研究中我们构建了白细胞介素 4与绿脓杆菌外毒素 (PE) 253～608aa的融合蛋白 ,并在其N端添加了 6×His标记方便纯化 ,在其C端添加了KDEL提高毒性。为了改善与IL-4R的亲和力我们将IL-4进行了环式重组 ,构建的融合毒素 ,H404K ,经DEAE$CSepharoseFastFlow及Ni-NTA纯化后 ,纯度达 90 %。纯化后的H404K与DT4H相似 ,对U251高度敏感 ,对MCF7及HepG2中度敏感 ,且我们首次证实该毒性不会被兔抗白喉毒素的多克隆抗体所抑制。这些研究表明 ,H404K与DT4H可以以一种互为替代的方式用于某些恶性肿瘤的治疗     

IL-10_(23-57)-PE40可溶表达、纯化及其细胞活性

以IL-10的功能短肽(35肽,即IL10第23至57氨基酸残基)为导向部分与PE40(绿脓杆菌外毒素除去受体结合区后的剩余部分)融合分别置入pet20b(+)和pet28a(+)构建重组毒素IL102357PE40的两种表达质粒,其中置于pet20b(+)的重组毒素在BL21(DE3)pLysS中以周质分泌可溶形式表达,置于pet28a(+)的重组毒素在Rosettablue(DE3)中以高效胞质可溶形式表达;依次通过硫酸铵盐析、疏水层析、阴离子交换层析、铜离子亲和层析纯化周质分泌成份,得90%重组毒素纯品;细胞活性实验表明,该重组毒素只对单核巨噬细胞有杀伤作用;细胞ELISA显示,该重组毒素对单核巨噬细胞的杀伤作用(IC50为13.9pmolL)符合绿脓杆菌外毒素的作用机理.     

用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测白喉毒素的抗体

<正> 本文叙述了定量测定白喉毒素抗体的酶联免疫吸附测定法(ELISA)。用ELISA技术与单间免疫扩散测定法比较,其结果能很好地相关,而且ELISA技术更为敏感一万倍。比在家兔体内皮肤试验法也至少敏感10倍。 绪言 某些方法用于定量测定白喉毒素的抗体,它包括体内和体外测定试验。体内测定如在家兔去毛的背上作皮内中和滴定试验,有利于测定实际中和毒素的抗体。虽然,在体内进行中和抗体滴度的测定是不可缺少的,但这些方法需要精心操作,代价高而又费时,另外,如果不进行大量的动物实验,     

医药其它

924425免疫毒紊和细胞素毒素融合蛋白〔会,英〕/Strom,T .B.一了Ann,N.Y.Acad.Sci一1991,636一233~250〔译自DBA,1992,11(11),92-06176〕 重组DNA技术的发展和毒素结构与功能关系的深入了解促进了大量抗体和细胞毒素杂交分子的开发。使全毒素分子上的受体结合位点缺失或灭活制成新型的嵌合“魔弹”,这样化学连接和遗传融合.的靶因子(抗体或细胞素)就能控制定靶的细胞。临床检测几种杂交分子,很有应用潜力。从以下方面综述了这些免疫毒素和嵌合毒素的生产和应用:用铜绿假单胞菌内毒素一A、白喉毒素或蓖麻蛋白-A构建免疫毒素;毒素与抗…     

prtR严紧调控的分子基础及对绿脓杆菌素表达的影响

[目的]阐明铜绿假单胞菌prtR严紧调控的分子基础及对绿脓杆菌素表达的影响。[方法]通过5'RACE确定prtR和ptrB的转录起始位点;通过RT-PCR的方法研究prtR的相对表达水平和对绿脓杆菌素表达的影响。[结果]prtR和ptrB的转录起始位点分别位于已预测的结构基因上游-1 bp和-322 bp;另外,PrtR除了通过抑制prtN来抑制绿脓杆菌素的表达之外,它的本底水平的表达对绿脓杆菌素还有一个间接或直接的抑制作用。[结论]造成prtR极低表达水平的原因,除自我抑制外,还存在ptrB对其的转录竞争抑制。此外,prtR独立对绿脓杆菌素的表达有抑制作用。     

白喉毒素E154位突变及生物活性评价

在量子化学计算的基础上,结合目前关于白喉毒素结构与功能的研究状况,选择把白喉毒素催化区的第154位谷氨酸分别突变为天冬氨酸和精氨酸,研究此处电荷性质的改变对生物活性的影响.通过基因定点突变方法制备这两个突变体基因,并在大肠杆菌表达系统中获得高效表达,在此基础上对它们的生物活性进行了评价.结果表明,与重组野生型白喉毒素相比,突变体E154D的整体动物毒性和细胞毒性略有增加,而E154R的毒性下降.     

绿脓杆菌外毒素A的结构、功能及其重组毒素

绿脓杆菌外毒素A有三个结构功能区.氨基端区(Ⅰ)通过关键位点Lys57结合靶细胞表面受体.中心区(Ⅱ)负责该毒素的跨膜转位功能,Arg276和Arg279是关键位点.在胞吞泡内此毒素于Arg279与Gly280间酶解成28 000和37 000两片段.羧基端区(Ⅲ)所在的37 000片段由其末端氨基酸序列REDLK介导到内质网再转位入胞浆通过Glu553位点结合NAD⁺使延伸因子-2受ADP-核糖基化而抑制细胞蛋白质合成导致细胞死亡.改造的毒素基因同识别蛋白基因融合成的重组毒素有应用前景.     

IL-1023-57-PE40可溶表达、纯化及其细胞活性

以IL-10的功能短肽(35肽,即IL10第23至57氨基酸残基)为导向部分与PE40(绿脓杆菌外毒素除去受体结合区后的剩余部分)融合分别置入pet20b( )和pet28a( )构建重组毒素IL102357PE40的两种表达质粒,其中置于pet20b( )的重组毒素在BL21(DE3)pLysS中以周质分泌可溶形式表达,置于pet28a( )的重组毒素在Rosettablue(DE3)中以高效胞质可溶形式表达;依次通过硫酸铵盐析、疏水层析、阴离子交换层析、铜离子亲和层析纯化周质分泌成份,得90%重组毒素纯品;细胞活性实验表明,该重组毒素只对单核巨噬细胞有杀伤作用;细胞ELISA显示,该重组毒素对单核巨噬细胞的杀伤作用(IC50为13.9pmolL)符合绿脓杆菌外毒素的作用机理.     

水华藻类的分子鉴定研究进展

水华藻类包含有原核藻类和真核藻类,广泛存在于淡水水体和海水中,其中包括形成赤潮的生物和使湖泊和沼泽发生水华的蓝藻。这些生物产生的毒素往往是次生代谢产物,种类繁多,包括肝毒素(Hepatotoxins),神经毒素(Neurotoxins)和皮炎毒素(Dermatoxins),其中淡水水华产生的最主要的两种毒素为微囊藻毒素(Microcystin)和节球藻毒素(Nodularins),其毒性作用的位点是抑制蛋白磷酸酶活性,从而影响细胞功能,因此对公共卫生、人体安全和动物安全造成了极大的威胁。       

绿脓杆菌外毒素A受体结合亚单位基因的克隆与表达

绿脓杆菌外毒素A(PEA)是绿脓杆菌感染的最主要致病因子,它由3个区域共613个氨基酸组成,分子质量66 ku。在体内,毒素先由Ⅰ区(受体结合亚单位)识别细胞表面受体并与之结合,而后,通过Ⅱ区(跨膜亚单位)将具有ADP-核糖基化活性的毒性单位导入胞浆,使Ⅲ区(毒力亚单位)发挥毒力作用,催化细胞内的延长因子2(EF-2)发生ADP-核糖基化反应,使EF-2灭活,抑制蛋白合成而杀灭细胞。在这种结合、入胞、抑制蛋白合成的三步连续过程     

白细胞介素2免疫毒素研究进展

应用基因工程技术已研制出多种免疫毒素,IL-2免疫毒素是研究最为成功的例子之一,包括IL-2与绿脓杆菌外毒素的融合蛋白,IL-2与白喉毒素的融合蛋白等.这类毒素以IL-2为导向分子,IL-2受体阳性细胞为靶细胞,治疗移植排斥反应、自身免疫性疾病、T细胞淋巴瘤等疾病,在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中已取得了较好的疗效.但是这类免疫毒素对人体均有较强的抗原性,使治疗时间和效果均受限制,为此研制了人源化的IL-2免疫毒素,能在体内外杀伤IL-2受体阳性细胞.     

绿脓杆菌外毒素A的最新研究进展

在免疫缺失、囊肿性纤维化、烧伤烫伤等患者的临床继发感染中,绿脓杆菌是引起感染的主要病原菌之一,其合成的细胞外毒性物质—绿脓杆菌外毒素A(PEA)被认为是引起感染的最关键内在机制。该文对中外学者们在PEA的结构、功能、提取和纯化方法、重组毒素、基因工程疫苗以及应用等方面的研究进行归纳总结,并对研究和应用中存在的问题加以分析,对预防和治疗绿脓菌感染、抗肿瘤、抗移植排斥和治疗自身免疫性疾病等具有重要而深远的意义。