滑液囊支原体不同感染途径的致病力比较

[背景]自2010年以来,我国鸡群中滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的感染率不断增高,目前MS已广泛存在于我国不同的鸡群中,包括蛋鸡、种鸡、白羽肉鸡和地方品种鸡等,其血清阳性率已超过40％,严重危害我国养鸡业,并造成了严重的经济损失.[目的]系统比较MS以不同感染途径对56日龄无特定病原体(...     

3株禽滑液囊支原体分离株致病性的比较和评价（英文）

【背景】禽滑液囊支原体是感染鸡的一种重要病原体,给我国的家禽养殖业带来了严重的经济损失。【目的】评价从病鸡中分离到的3株禽滑液囊支原体的致病性,以期丰富不同区域来源的分离株对鸡致病性的认识。【方法】分别用分离株CHN-WF224-2016、CHN-BZJ2-2015、CHN-JNB19-2016感染商品肉鸡,并在攻毒后第10天和21天进行实验室解剖,通过气囊和足垫的临床病变、血清学检测结果及气管粘膜病理形态学改变来比较评价分离株的致病力。【结果】CHN-BZJ2-2015和CHN-WF224-2016分离株能引起明显足垫肿胀和关节滑膜炎,其中CHN-BZJ2-2015分离株致病力最强,感染21d后的血清学检测和气管粘膜厚度与CHN-JNB19-2016分离株和MS-H疫苗株比较差异显著(P0.05)。【结论】本研究表明我国目前流行的禽滑液囊支原体菌株其致病力存在明显差异,强调养殖场要积极控制和预防禽滑液囊支原体感染的重要性,同时为今后该疫苗的研发积累了实验数据。     

滑液支原体醛缩酶的亚细胞定位及免疫原性

【背景】滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染能够引起鸡和火鸡的气囊炎、关节渗出性的滑液囊膜及腱鞘滑膜炎等。有研究表明,许多支原体中与代谢相关的酶类不仅分布在细胞质,也分布于细胞膜表面,通过结合宿主细胞的胞外基质蛋白,协助病原菌黏附入侵宿主细胞。已有报道牛支原体(Mycoplasma bovis)和鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)的醛缩酶(Fructose-bisphosphate aldolase,FBA)分布在膜蛋白和胞浆蛋白中,而MS的FBA蛋白还未见相关研究。【目的】对MSFBA蛋白进行生物信息学分析、原核表达、免疫原性分析及亚细胞定位检测,为进一步探索MS代谢相关酶类的生物学功能奠定基础。【方法】通过分析软件PSORTb、SignalP 4.1 Server和TMHMM Server在线预测MSFBA的亚细胞定位、信号肽及跨膜区,并用BLASTn和MEGA 5.0进行同源比对及进化树分析;通过Overlap PCR点突变扩增MS的fba全基因序列,连接表达载体pET-28a(+)并进行原核表达及纯化,获得纯化后的重组MSFBA(rMSFBA)蛋白;用MS阳性血清进行Westernblot鉴定rMSFBA的免疫原性;用纯化的rMSFBA蛋白制备兔多克隆抗体,与MS全菌蛋白、膜蛋白及胞浆蛋白进行Western blot分析,同时对MS全菌进行悬浮免疫荧光分析,检测MSFBA的膜定位情况。【结果】生物信息分析预测MSFBA分布在细胞质中,无信号肽,无跨膜区,在MS种内相似性高达99%,与其他种属FBA相似性在61%-78%之间,进化树显示其与牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)、仓鼠支原体(Mycoplasm acricetuli)等的FBA蛋白进化关系较近,与精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、人型支原体(Mycoplasma hominis)等的FBA蛋白进化关系较远;表达rMSFBA蛋白并纯化,经测定其相对分子质量大小约为33kD;rMSFBA能与MS阳性鸡血清特异性结合,证实其具有较好的免疫原性;Western blot显示抗rMSFBA的兔血清能与MS全菌蛋白和胞浆蛋白反应,而与膜蛋白不反应,说明MSFBA蛋白分布于胞浆中;悬浮免疫荧光实验证实MS的细胞膜上未见FBA蛋白分布。【结论】首次报道了滑液支原体的FBA蛋白是一个高度保守的免疫原性蛋白,主要分布在细胞质中,该结果为进一步研究MSFBA蛋白的生物学功能提供了分子基础。     

lpxL和lpxM基因对O1、O78血清型禽致病性大肠杆菌毒力的影响

【目的】为探究脂多糖对O1、O78血清型禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)致病作用的影响。【方法】选取负责脂质A生物合成相关基因lpx L和lpx M,利用λ噬菌体的Red同源重组系统分别构建APECE516(O1血清型)和APECE522(O78血清型)缺失株E516Δlpx L、E516Δlpx M、E516Δlpx LΔlpx M、E522Δlpx L、E522Δlpx M和E522Δlpx LΔlpx M,并通过体内外试验对其生物学特性及致病性进行研究。【结果】各菌株生长速度基本一致。E516Δlpx L、E516Δlpx LΔlpx M、E522Δlpx M和E522Δlpx LΔlpx M的抗血清补体杀菌能力和抗鸡巨噬细胞HD-11吞噬能力较野生株显著下降,而缺失株E516Δlpx M、E522Δlpx L与野生株相比无明显差异;半数致死剂量测定结果显示,除E516Δlpx M、E522Δlpx L外,各缺失株毒力降低1000倍左右;SPF鸡体内动态分布试验结果显示,各缺失株在鸡体内定殖能力较野生株显著下降,但回补株的毒力未能恢复至野生株水平。【结论】lpx L和lpx M基因与O1血清型APECE516株和O78血清型APECE522株的毒力有关,但是lpx L和lpx M基因对E516和E522菌株毒力的影响存在差异。     

尿道致病性大肠杆菌HEC4株和禽源致病性大肠杆菌E058株毒力相关特性的比较

对人尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)HEC4株和禽致病性大肠杆菌(avian pathogen-ic Escherichia coli,APEC)E058株进行毒力基因和其他相关特性的比较,结果显示,它们具有一些共同的毒力基因,包括一些存在于APEC中一个大的可传递质粒上的基因;同时,它们也具有一些相似的生化特性。对SPF鸡的致病性试验显示,这两株分离株具有相似的致病力。因此,对于APEC和UPEC的相关性,以及APEC是否有可能导致人尿道感染或者成为UPEC的毒力基因贮主,有待进一步研究。     

基于脂蛋白P80的滑液支原体抗体ELISA检测方法的建立及应用

【目的】研究滑液支原体(Mycoplasma synoviae, MS)脂蛋白P80的免疫反应性及其在MS血清抗体ELISA检测中的应用。【方法】对MSP80的氨基酸序列进行生物信息学分析、原核表达和纯化,并用免疫印迹法分析其与6种不同MS分离株阳性血清的免疫反应性以及与其他禽病原血清的交叉反应性;运用纯化的MS P80表达蛋白作为包被抗原建立了MS血清抗体的间接ELISA检测方法,对其敏感性和重复性进行检测;比较检测了与美国爱德士检测试剂盒对50份临床血清样品的阳性符合率。【结果】生物信息学分析预测MS P80蛋白为脂蛋白且含有信号肽,其在MS种内同源性高达98%-100%,与其他种属P80蛋白同源性在25%-34%之间,成功表达和纯化了MS P80重组蛋白(rMS P80);Western blotting分析表明纯化的rMS P80具有良好的免疫反应性和特异性;运用rMS P80建立的MS血清ELISA抗体检测方法可对不同株MS阳性血清进行抗体效价检测,而对其他禽病原阳性血清均无交叉反应性;该检测方法的批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%,重复性良好;与美国IDEXX检测试剂盒比较,本文建立的ELISA抗体检测方法敏感性更高,阳性符合率为75%,阴性符合率为89.47%,总样本符合率为86%。【结论】MS P80具有较好的免疫反应性、种内保守性和种间特异,并且可用作MS抗体检测的靶标抗原。     

禽致病性大肠杆菌江苏、安徽分离株的生物学特性分析

[目的]研究禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)江苏、安徽分离株的优势血清型,并分析其生物学特性.[方法]对分离自病禽的细菌进行鉴定,采用玻片凝集法测定禽致病性大肠杆菌的血清型,PCR方法检测14种毒力基因的分布,采用美国临床和实验室标准化研究所的方法进行药物敏感性检测,改良结晶紫半定量法检测分离细菌的生物被膜形成能力. [结果]共分离到禽致病性大肠杆菌56株,血清型检测结果表明,O78血清型占64.29％,为主要血清型.毒力基因检测显示,fimC、pfs、ompA和luxS的阳性率超过90％.药物敏感性检测显示,58.93％的菌株对8种以上的药物耐受.生物被膜检测显示,有16株细菌生物被膜形成能力为中等以上,其中68.75％的菌株耐8种以上的药物.[结论]O78为主要流行的血清型.fimC、pfs、ompA和luxS基因为APEC保守基因.多重耐药性仍很普遍,细菌生物被膜与耐药性具有相关性.     

滑液支原体NADH氧化酶的酶学活性及亚细胞定位研究

【背景】许多研究表明,支原体的NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)不仅在胞浆中发挥生物酶学功能,也存在于细胞膜上发挥黏附宿主细胞功能。【目的】对滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的NOX进行酶学活性及亚细胞定位研究,分析其在MS致病过程中的潜在作用。【方法】对MS的NOX蛋白进行原核表达、纯化,然后对重组MSNOX (rMSNOX)的酶学活性及影响酶活的条件进行研究,测定其酶比活力、米氏常数及最大反应速率,接着用MS阳性血清及制备的rMSNOX兔多克隆抗体,分别与rMSNOX蛋白及MS全菌、膜蛋白和胞浆蛋白进行Western blotting反应,鉴定rMSNOX的免疫原性及其在MS中的分布情况。【结果】在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达rMSNOX蛋白,相对分子质量约为53 kD,并获得纯化的rMSNOX蛋白;酶活测定显示rMSNOX蛋白的酶比活力为14.17IU/mg,最适酶促温度为37℃,最适pH为7.5,双倒数法求得rMSNOX的最大反应速率V_max为21.8μmol/(L·min),米氏常数K_m     

禽呼肠孤病毒变异株的分离鉴定

从病鸡肝分离到一株病毒,经电镜检查、理化特性分析、核酸电泳和中和试验等证明它为禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）。该病毒只在鸡胚肝细胞（ＣＥＬｉ）上产生细胞病变（ＣＰＥ）,在鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）和Ｖ＿（ｅｒｏ）细胞上不增殖,它对热无敏感,Ｍｇ￣（２＋）不能增强其对热的稳定性,其基因组中的４个小节段的迁移率与ＡＲＶＦＤＯ和Ｓ＿（１１３３）株明显不同,表明它是不同于ＦＤＯ和Ｓ＿（１１３３）的ＡＲＶ变异株。     

一株球孢白僵菌的分离鉴定及其对草地贪夜蛾的致病性

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J. E.Smith)是我国于2019年新发现的一种迁飞性重大害虫。为了寻找对草地贪夜蛾有高致病性的昆虫病原真菌,本实验对采自广东省广州市华南农业大学湿地的感菌稻黑蝽Scotinophara lurida若虫僵虫进行了室内分离培养,结合形态学和rDNA-ITS序列分析,采用浸虫法研究了该菌对草地贪夜蛾各龄幼虫的致病力。鉴定结果表明该病原真菌为球孢白僵菌Beauveria bassiana,编号为GZSL-1菌株。菌株GZSL-1可侵染草地贪夜蛾6个龄期的幼虫,随孢子浓度的升高,草地贪夜蛾幼虫感病死亡率增加,当浓度达到1×10~8孢子/mL时,1～3龄幼虫的累计校正死亡率皆为100%,4龄和5龄幼虫也达到57.47%和55.06%,6龄仅25.28%。接菌6 d后1～5龄幼虫的LC_(50)值分别为1.32×10~3、3.42×10~3、1.01×10~4、1.61×10~5和1.23×10~7孢子/mL。幼虫LT_(50)值随孢子悬浮液浓度增加而递减,在孢子浓度为1.0×10~4～1.0×10~8孢子/mL范围内,1龄、2龄和3龄幼虫的LT_(50)值分别为3.58～1.69 d、4.30～1.78 d和5.70～3.12 d;浓度为1.0×10~5～1.0×10~8孢子/mL时,对4龄幼虫的LT_(50)为5.45～4.85 d;浓度为1.0×10~7～1.0×10~8孢子/mL时,对5龄幼虫的LT_(50)为5.04～5.02 d。上述研究结果表明,鉴定的球孢白僵菌菌株GZSL-1对草地贪夜蛾幼虫具有较强致病性,可为草地贪夜蛾微生物防治提供候选菌种资源。     

Molecular basis of the length variation in the N-terminal part of Mycoplasma synoviae hemagglutinin

Mycoplasma synoviae is a major avian pathogen that synthesizes hemagglutinin VlhA, an abundant immunodominant surface lipoprotein. In most M. synoviae strains, the VlhA protein cleaves into the N-terminal part, a lipoprotein MSPB, and a C-terminal part MSPA, which mediates binding to erythrocytes. VlhA is encoded by the vlhA gene of which the 5'-end is present in the genome as a single copy, which does not change its sequence during recombination of the vlhA gene with pseudogenes. In this study, sequence analyses of the 5'-end vlhA sequences of 30 M. synoviae isolates revealed a highly polymorphic region encoding the proline-rich repeats (PRR) in the N-terminal part of MSPB. Pathogenic strain K1968 had an insertion encoding sequence DNPQNPN in PRR, whereas strains F10-2AS, K2581, K3344 and five strains belonging to two related clusters of strains isolated recently from chickens in Slovenia lacked one PRR repeat of 19 amino acids. The predicted length variations correlated well with the lengths of the corresponding MSPB proteins detected in immunoblots with specific antibodies. Comparison of the 5'-end vlhA sequences of 30 M. synoviae strains showed 11 different types of vlhA sequences indicating that the analysis of this vlhA part is useful for strain differentiation. Distinct sequence motifs seem to be characteristic for vlhA genes of individual M. synoviae strains or clusters of strains and can be used as markers for tracing their spreading between poultry farms.     

The characterization of Mycoplasma synoviae EF-Tu protein and proteins involved in hemadherence and their N-terminal amino acid sequences

An abundant cytoplasmic 43-kDa protein from Mycoplasma synoviae, a major pathogen from poultry, was identified as elongation factor Tu. The N-terminal amino acid sequence (AKLDFDRSKEHVNVGTIGHV) has 90% identity with the sequence of the Mycoplasma hominis elongation factor Tu protein. Monoclonal antibodies reacting with the M. synoviae elongation factor Tu protein also reacted with 43-kDa proteins from the avian Mycoplasma species Mycoplasma gallinarum, Mycoplasma gallinaceum, Mycoplasma pullorum, Mycoplasma cloacale, Mycoplasma iners and Mycoplasma meleagridis, but not with the proteins from Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma imitans or Mycoplasma iowae. In addition, two groups of phase variable integral membrane proteins, pMSA and pMSB, associated with hemadherence and pathogenicity of M. synoviae strains AAY-4 and ULB925 were identified. The cleavage of a larger hemagglutinating protein encoded by a gene homologous to the vlhA gene of M. synoviae generates pMSB1 and pMSA1 proteins defined by mAb 125 and by hemagglutination inhibiting mAb 3E10, respectively. The N-terminal amino acid sequences of pMSA proteins (SENKLI ... and SENETQ ...) probably indicate the cleavage site of the M. synoviae strain ULB 925 hemagglutinin.     

一株源自孔雀的新型支原体的鉴定及其致病性和基因组分析

【背景】Mycoplasma gallinaceum (MGC)是禽源支原体的一种,仅在南非、英国等地发生,我国鲜有报道。【目的】从患呼吸道病的孔雀气管中分离到一株支原体,命名为Peacock20181011,确定其分类、致病性和基因组特征。【方法】利用微生物学常规方法,结合分子生物学检测和基因组序列,对其进行鉴定;通过对Special pathogenic free(SPF)鸡、鸡胚的致病性研究和最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)测定,确定其致病性和药敏性。【结果】通过对分离菌的培养、纯化、形态学和染色观察,结合生化试验和16SrRNA基因测序证实,该菌为一株新的MGC,与模式菌株NCTC10183的16S rRNA基因相似性高达99.86%,系统发育树显示该菌与MGC属同一分支;人工感染实验表明该菌对SPF鸡无致病性,但可造成SPF鸡胚发育迟缓,爪部蜷缩;MIC结果显示该菌对单硫酸卡那霉素和氟苯尼考等敏感。基因组序列表明,该菌基因组长度为1 183 913 bp,(G+C)mol%含量为28.7%,含有898个Coding sequences (CDS),拥有4个拷贝的16S rRNA基因和6个质粒,预测有20个毒力因子基因和2个耐药基因。【结论】明确了MGC在我国的存在,丰富了中国禽源支原体的种类,为支原体病的防控提供了依据。     

我国17株绵羊肺炎支原体分子分型及其菌体蛋白免疫印迹

【目的】分别从基因和蛋白水平研究我国部分地区绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)分离株的分子特征,并了解其免疫原性蛋白的差异。【方法】对分离自8个地区的17株绵羊肺炎支原体进行扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)分析,采用NTsys-2.10e软件对AFLP和SDS-PAGE结果进行聚类,并用绵羊肺炎支原体模式株Y98高免血清对部分分离株进行免疫印迹分析。【结果】当相似系数分别为0.78和0.85时,绵羊肺炎支原体分离株可根据8个来源地区分成8个AFLP群和8个SDS-PAGE群;用8株分离株进行免疫印迹共出现6条蛋白条带,分子质量分别为105 kDa、83 kDa、65 kDa、42 kDa、40 kDa或26 kDa,其中83 kDa和40 kDa蛋白为8个菌株保守的免疫原性蛋白。【结论】我国部分地区绵羊肺炎支原体分离株之间存在遗传差异,不同分离株的主要免疫原性蛋白也存在一定差异,但83 kDa和40 kDa蛋白为其保守的免疫原性蛋白。本研究首次对我国部分地区绵羊肺炎支原体分离株进行了分子分型与免疫印迹分析,结果将为绵羊肺炎支原体病的新型诊断技术开发和疫苗研制奠定理论基础。     

Mouse pathogenicity studies of Nocardia asteroides complex species and clinical correlation with human isolates

Abstract Nocardia asteroides complex organisms derived from human specimens between 1979 and 1992 were identified on the species level. Of 117 N. asteroides complex organisms, 34 (29%) were N. farcinica , 28 (24%) were N. nova , and 55 (47%) were N. asteroides sensu stricto . An analysis of the specimen sites from which the organisms were derived showed that isolates derived from blood, brain, or bone marrow were more likely to be N. farcinica than the other two species. A study of the virulence of ten strains of each species was undertaken, using a mouse model with intravenous inoculation. The 50% lethal doses (LD₅₀) for N. farcinica were significantly lower than those of the other two species. LD₅₀ values for N. nova and N. asteroides were not significantly different. The above data confirming the greater virulence of N. farcinica support the identification of species within the N. asteroides complex.     

Comparison of Mycoplasma agalactiae isolates by pulsed field gel electrophoresis, SDS-PAGE and immunoblotting

Abstract We have analyzed 81 isolates of Mycoplasma agalactiae from four different regions of Italy between 1990 and 1995 in order to identify antigenic differences through SDS-PAGE and Western blotting and chromosomal DNA restriction endonuclease cleavage pattern differences. Antigenic variability in M. agalactiae isolates was investigated analyzing hydrophobic membrane protein fractions by immunoblotting using pooled sheep antiserum from naturally infected sheep. Large restriction fragments obtained cleaving genomic DNAs with Sma I, Nru I, Sal I, Xho I, Bss HII and Kpn I were analyzed by pulsed field gel electrophoresis. Genetic analysis indicates that isolates are all similar without intraspecific differences. This homogeneity was confirmed by immunoblotting: 80 and 50 kDa antigens are present in all strains analyzed.     

Liver lesions seen at slaughter as an indicator of necrotic enteritis in broiler flocks

Historical data of necrotic enteritis incidence and carcass condemnations owing to liver lesions in south-eastern Norway during 1978-1998 revealed covariance in the occurrence of the two variables. In histological examination during the first half of 1998, 33 of 45 sampled carcasses condemned owing to liver lesions showed histopathological changes consistent with earlier described Clostridium perfringens-associated hepatitis. The results suggest that the occurrence of necrotic enteritis in broiler flocks may be monitored by using meat inspection data on liver lesions.     

断奶仔猪源大肠杆菌LEE及HPI毒力岛的检测

应用Duplex_PCR方法,对240株断奶仔猪源大肠杆菌分离株的LEE毒力岛的eaeA基因和耶尔森菌强毒力岛核心区的irp2基因进行了检测,并对HPI毒力岛的fyuA基因及其在大肠杆菌染色体中的插入位置进行了分析,以及随机选取部分PCR产物进行了克隆和序列分析。结果表明:其中29株(12.08%)为LEE HPI ,39株(16.25%)为LEE ,11株(4.58%)为HPI ;另外还发现:不同病例来源的分离株之间,两种毒力岛的携带率不同;在断奶仔猪腹泻源分离株中,29株(20.71%)为LEE HPI ,22株(15.71%)为LEE ,9株(6.43%)为HPI ;断奶仔猪水肿病源分离株中,仅5株(6.58%)为LEE ,2株(2.63%)为HPI ,未发现LEE HPI 菌株;断奶仔猪水肿病并发腹泻源分离株中,仅12株(50%)为LEE ,未发现HPI 及LEE HPI 菌株。本实验克隆的eaeA(425bp)与已发表序列完全一致,irp2(280bp)f、yuA(948bp)、asn_tRNA_intB(1391bp)均与已发表的序列高度同源,同源性分别在98.2%、98.3%、95.8%以上;40株LEE HPI 或HPI 分离株中,29株(72.5%)为fyuA ,且其HPI毒力岛位于大肠杆菌染色体asn_tRNA位点。