花生根瘤菌Bradyrhizobium sp.MM6 Ⅲ型分泌系统的结构和功能

【目的】探究花生根瘤菌Bradyrhizobium sp.MM6的Ⅲ型分泌系统(T3SS)的结构及其在根瘤菌与不同宿主建立共生关系中的作用。【方法】同源比对分析菌株MM6的T3SS基因簇的结构特征,并采用三亲本接合转移的方法构建T3SS调节基因ttsI突变菌株;通过蛭石结瘤和石蜡切片实验,比较突变体与野生型的共生固氮表型差异。【结果】经预测,MM6的T3SS基因簇编码区长约34.1 kb,可分为3个区域,包含10个保守结构基因和8个效应蛋白基因,与B.diazoefficiens USDA110相应基因的序列相似性为83%–93%;成功构建了MM6的ttsI突变株;ttsI突变株与野生型分别与花生(S523和Y45)、野大豆和大豆中黄57结瘤,ttsI突变体在花生中的总瘤数显著增加(P<0.05),根瘤中含菌细胞更多;ttsI突变体在野大豆中平均每株植物增加4个根瘤,根瘤中含菌细胞更多,地上部干重相比野生型MM6显著增加(P<0.05);在大豆中黄57中,野生型MM6能形成红色的有效根瘤,ttsI突变体不结瘤,且植株叶片发黄,地上部干重相比野生型MM6显著降低(P<0.05)。【结论】MM6的T3SS在花生和野大豆共生体系中起着有害的作用,而在大豆中黄57的共生体系中起着有利的作用。     

花生根瘤菌Bradyrhizobium sp.MZ5 Ⅲ型分泌系统调节基因ttsI突变体的功能分析

【目的】探究慢生型花生根瘤菌Ⅲ型分泌系统在花生-根瘤菌互作的功能。【方法】本研究采用同源重组和三亲本接合转移的方法,构建Bradyrhizobium sp. MZ5的Ⅲ型分泌系统调节基因ttsI突变体;荧光定量PCR检测添加大豆苷元(Daidzein)和染料木黄酮(Genistein)诱导物后野生型和突变株转录水平上ttsI的表达量变化及其差异;蛭石结瘤实验分析ttsI基因突变对花生结瘤能力的影响。【结果】在转录水平上,大豆苷元和染料木黄酮对MZ5的Ⅲ型分泌系统调节基因ttsI的表达具有显著的抑制作用(P0.05)。在MZ5△ttsI突变体中ttsI基因的表达量都明显下调,与野生型菌株的相比都达到极显著水平(P0.001)。蛭石结瘤实验表明,与野生型菌株相比,MZ5△ttsI突变体在不同花生品种的结瘤数和地上部干重都显著性降低。根瘤石蜡切片表明,MZ5△ttsI突变体在根瘤内的含菌量少于野生型菌株。【结论】Bradyrhizobium sp. MZ5菌株中的Ⅲ型分泌系统在花生-根瘤菌互作中对结瘤有积极的促进作用。     

丁香假单胞菌中的III型分泌系统及其调控机制研究进展

丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)是引起许多作物病害的一种革兰氏阴性病原细菌。该细菌入侵寄主植物细胞主要通过其III型分泌系统(type III secretion system,T3SS)将效应蛋白转入到寄主真核细胞内,抑制寄主免疫功能,以达到成功侵染和定殖的目的。III型分泌系统的主调控因子RhpR/S通过感受环境信号的变化直接调控hrpR/S及其他毒力相关通路。同时III型分泌系统基因的表达也受到其他调控因子的影响,包括σ因子HrpL、双组分系统GacA/S、Lon蛋白酶、第二信使分子和环境信号等。本文在简要介绍丁香假单胞菌III型分泌系统组成和功能的基础上,综述丁香假单胞菌III型分泌系统调控机制的最新研究进展,以期为深入探究病原菌的致病机制提供参考和思路。     

III型分泌系统抑制剂对铜绿假单胞菌PAO1毒性因子的影响

【目的】进一步研究III型分泌系统(Type III secretion system, TTSS)抑制剂对条件致病菌Pseudomonas aeruginosa PAO1的TTSS相关蛋白、鞭毛和纤毛等主要毒性因子的影响,评估TTSS抑制剂的防治效果及潜在风险。【方法】构建TTSS效应蛋白合成基因exoY和exoT转录报告质粒pAT-exoY、pAT-exoT,并将其转入菌株PAO1中。菌株PAO1(pAT-exoY)、PAO1(pAT-exoT) 与TTSS抑制剂共同培养后,检测exoY和exoT的表达。通过SDS-PAGE检测TTSS抑制剂对鞭毛结构蛋白FliC的影响。将PAO1单菌落穿刺接种于含有TTSS抑制剂的1%琼脂糖平板,观察细菌纤毛介导的蹭行运动(Twitching motility)。【结果】转录报告实验结果表明4个TTSS抑制剂可显著抑制exoY和exoT的转录;化合物TS52、TS53和TS94虽不影响胞内TTSS针状顶端结构蛋白PcrV的产量,但可抑制PcrV蛋白的胞外运输。化合物TS53可降低鞭毛结构蛋白FliC的产生。另外,化合物TS52、TS53和TS88可降低菌株PAO1的蹭行运动能力,但TS94可提高菌株PAO1的这种运动能力。【结论】TTSS抑制剂除通过抑制TTSS表达外,还可能通过影响其它毒性因子如鞭毛的合成、IV型分泌系统介导的蹭行运动等方式影响菌株PAO1致病性。     

用AFLP技术检测慢生型花生根瘤菌竞争结瘤的研究

以 5株慢生型花生根瘤菌和天府 3号花生为材料 ,用 AFLP技术研究了慢生型花生根瘤菌 Spr2 - 9、Spr3- 3、Spr3- 5、Spr4- 5和 Spr7- 1的遗传特性和竞争结瘤能力。结果显示 ,供试条件下 ,传代次数对菌株的遗传性状无明显影响 ,2 8℃培养条件下 ,花生根瘤菌连续传 96代 ,其 AFLP指纹未发生明显变化 ;37℃培养 ,仅 Spr3- 3和 Spr3- 5能够存活并正常生长 ,其 AFLP指纹也未发生明显改变 ,然而其它菌株不能生长。将供试慢生型花生根瘤菌分别接种天府 3号花生 ,光照培养 30 d后 ,随机各取 4个根瘤 ,从根瘤中提取类菌体 DNA进行 AFLP分析 ,各根瘤类菌体 DNA的 AFLP指纹图谱与该菌株纯培养物 AFLP指纹相同。将 5个菌株混合接种天府 3号花生 ,不同菌株的占瘤率存在差异 ,Spr3- 3和 Spr3- 5的竞争结瘤能力最强 ,两菌株的占瘤率之和为 85.4% ;Spr4- 5的占瘤率为 1 2 .2 % ;Spr7- 1为 2 .4% ;而 Spr2 - 9的竞争结瘤能力最差。本试验结果说明 ,AFLP技术用于根瘤菌生态和竞争结瘤能力研究 ,具有下列优点 :简易、快速、准确 ;直接取豆科植物的根瘤提取 DNA,进行原位研究 ;在不改变菌株遗传特性 ,即不使用突变株的前提下 ,可以直接测定已知菌株的竞争结瘤能力     

肉桂酸衍生物对铜绿假单胞菌PAO1 III型分泌系统的影响

【目的】铜绿假单胞菌是引起医院获得性感染最常见的条件致病菌,而III型分泌系统(Type III secretion system,TTSS)是其致病的主要因子之一。本文从合成的21个肉桂酸衍生物中筛选影响TTSS效应子(Effector)产生的化合物,并初步研究其作用机制。【方法】将TTSS效应子合成基因exoS的转录报告质粒pAT-exoS转入菌株PAO1中,获得PAO1(pAT-exoS)。待筛选的化合物与PAO1(pAT-exoS)菌株共培养6 h后,检测exoS基因的表达,从中筛选影响exoS基因表达的化合物。【结果】筛选结果表明：21个化合物中,3个化合物抑制exoS基因表达,2个化合物则促进exoS基因表达。此外,化合物TS128、TS143和TS160对菌株生长有明显的抑制作用。Western blot实验进一步证实筛选得到的化合物TS108、TS128和TS165可抑制ExoS的产生;化合物TS139和TS143则促进ExoS的产生。为进一步研究抑制剂的作用机理,过量表达TTSS主要的调控因子exsA基因可部分消除抑制剂TS108和TS165的抑制效果;而rsmZ rsmY双基因突变体PAO6421中添加抑制剂TS108和TS165并不能显著抑制exoS基因的表达,同样,抑制剂TS108和TS165也不影响受Gac/Rsm信号传导系统调控的群体感应信号分子的产生。【结论】抑制剂TS108和TS165的作用机制可能主要是影响esxA基因,从而影响exoS基因表达及蛋白产量。     

用发光酶基因(luxAB)标记法研究慢生花生根瘤菌的竞争结瘤能力

luxAB基因标记是一种新型基因标记技术,在很多研究领域都有着良好的应用前景。研究通过三亲本杂交将luxAB基因成功地向慢生型花生根瘤菌进行了转移,并获得了一株带LuxAB基因标记的菌株Cspr7-1。对Cspr7-1进行性状、标记基因的遗传稳定性检测,结果表明,LuxAB基因不仅能有效表达,而且性状稳定。在无氮水培条件下进行标记菌株与土著根瘤菌的竞争结瘤试验。结果证实,Cspr7-1在植物根系上的占瘤率平均达到61.3％,比土著根瘤菌的竞争结瘤能力强,而且Cspr7-1在主根上的侵染能力远较侧根上的强,平均高出22.3％-39.6％。     

青枯菌Rsc1285参与III型分泌系统及致病力的调控

摘要:【目的】研究青枯菌Rsc1285参与调控其III型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)及致病力的途径。【方法】通过基因敲除、基因互补等研究Rsc1285对T3SS基因表达和致病力的影响。【结果】青枯菌rsc1285基因缺失突变体对寄主西红柿植株的致病力明显减弱,其hrpB、T3SS等基因表达水平较野生型明显降低,但hrpG、prhG的表达不受影响。【结论】青枯菌通过一个全新的途径利用Rsc1285调控hrpB及T3SS的转录表达并决定其致病力。     

铜绿假单胞菌中III型分泌系统受Rhl和PQS群体感应系统调节

摘要：【目的】研究铜绿假单胞菌中群体感应系统（Quorum sensing, QS）与III型分泌系统（Type III secretion system, T3SS）的关系。【方法】通过基因敲除的方法破坏铜绿假单胞菌QS系统相关基因,将T3SS相关基因exoS、exoY、exoT、exsD-pscA-L启动子-报道子luxCDABE融合体整合到野生型菌株及QS系统突变菌株的染色体组上,通过检测启动子活性,比较这些基因在不同菌株中的表达情况。【结果】研究结果表明,T3SS中的exoS与exoT在pqsR基因突变体中的表达有明显的增强,Rhl系统对这四种基因的表达具有抑制作用,而Las系统存在与否对T3SS基本没有影响。【结论】铜绿假单胞菌中的Rhl系统和奎诺酮信号（Pseudomonas Quinolone Signal, PQS）系统对T3SS相关基因的表达具有重要的调节作用。     

vcrV基因对副溶血弧菌生物学特性及III型分泌系统1效应蛋白易位的影响

【背景】副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)具有两套III型分泌系统(typeIIIsecretion system,T3SS)。T3SS1通过向宿主细胞分泌效应蛋白发挥致病作用,vcrV基因位于T3SS1编码基因簇。【目的】以vcrV基因为研究对象,探索其对副溶血弧菌生物学特性及T3SS1致病机制的影响。【方法】以副溶血弧菌POR-1株为参考菌株,利用同源重组技术构建vcrV基因缺失株ΔvcrV和回补株CΔvcrV,比较各菌株在生长性能、生物被膜形成能力、细胞黏附及细胞毒性等生物学特性的差异,应用Western Blot检测T3SS1诱导条件下POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV等菌株效应蛋白分泌量,进一步利用具有过表达载体pMMB207-vp1683-CyaA的各菌株侵染HeLa细胞,通过Western Blot检测细胞内效应蛋白VopR(Vp1683)的易位量。【结果】与基础菌株POR-1相比,缺失vcrV基因不影响副溶血弧菌的生长性能、生物被膜形成能力及细胞黏附等生物学特性,显著降低了对HeLa细胞的毒性作用,具有过表达载体的POR-1、ΔvcrV和CΔv...     

The Bordetella type III secretion system: its application to vaccine development

B. pertussis is a causative agent of whooping cough (pertussis) in humans. Despite wide-scale vaccination in many countries, there is serious concern about pertussis as a re-emerging disease. Re-emergence of pertussis may be explained by several factors: the short duration of protection by the currently available acellular pertussis vaccine, an increase in asymptomatic adult carriers and expansion of strains with certain antigenic variations which are not covered by currently available vaccines. To develop safer and more efficacious vaccines which confer more prolonged protection, researchers are focusing on identification and characterization of new virulence factors. One candidate for protective antigens is the type III secretion system and its secreted proteins.     

Identification and characterization of a type III secretion-associated chaperone in the type III secretion system 1 of Vibrio parahaemolyticus

Vibrio parahaemolyticus causes human gastroenteritis. Genomic sequencing of this organism has revealed that it has two sets of type III secretion systems, T3SS1 and T3SS2, both of which are important for its pathogenicity. However, the mechanism of protein secretion via T3SSs is unknown. A characteristic of many effectors is that they require specific chaperones for efficient delivery via T3SSs; however, no chaperone has been experimentally identified in the T3SSs of V. parahaemolyticus . In this study, we identified candidate T3SS1-associated chaperones from genomic sequence data and examined their roles in effector secretion/translocation and binding to their cognate substrates. From these experiments, we concluded that there is a T3S-associated chaperone, VecA, for a cytotoxic T3SS1-dependent effector, VepA. Further analysis using pulldown and secretion assays characterized the chaperone-binding domain encompassing the first 30–100 amino acids and an amino terminal secretion signal encompassing the first 5–20 amino acids on VepA. These findings will provide a strategy to clarify how the T3SS1 of V. parahaemolyticus secretes its specific effectors.     

减毒鼠伤寒沙门菌三型分泌表达系统的构建及其特性

为开发新型重组减毒鼠伤寒沙门菌口服活疫苗载体,本研究以pYA3493质粒为基础,用鼠伤寒沙门菌sopE_(Nt100)基因及其启动子替代原有的P_(trc)启动子,构建沙门菌三型分泌表达载体pYA-sopE_(Nt100);再将质粒pYA-sopE_(Nt100)电转入沙门菌ΔcrpΔasd SL1344,构建减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统,研究其生物学特性,进一步将报告基因egfp克隆入sop E基因下游,构建重组菌株ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100)-egfp),感染Vero细胞,用Western blotting分析该系统递呈外源抗原的能力。PCR、酶切及测序结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统构建成功;生物学特性鉴定结果表明,其血清型与亲本株Δcrp SL1344及野生株SL1344保持一致;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化;生长速度也更为缓慢;重组菌株ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))的LD50较野生株SL1344降低了7.0×104倍;Western blotting结果发现,重组菌培养上清中能检测到Sop E_(Nt100)-egfp融合蛋白(37 k Da);重组菌株感染Vero细胞后,可以同时检测到Sop E_(Nt100)-egfp融合蛋白(37 k Da)和EGFP蛋白(27 k Da)。以上结果证实,本研究成功构建了新型减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统,其能够有效递呈外源抗原,该重组菌株有潜力作为安全、稳定、高效表达外源基因的口服重组活疫苗载体。     

Iron starvation regulates the type III secretion system in Bordetella bronchiseptica

The type III secretion system (T3SS) plays a key role in the exertion of full virulence by Bordetella bronchiseptica. However, little is known about the environmental stimuli that induce expression of T3SS genes. Here, it is reported that iron starvation is a signal for T3SS gene expression in B. bronchiseptica. It was found that, when B. bronchiseptica is cultured under iron-depleted conditions, secretion of type III secreted proteins is greater than that in bacteria grown under iron-replete conditions. Furthermore, it was confirmed that induction of T3SS-dependent host cell cytotoxicity and hemolytic activity is greatly enhanced by infection with iron-depleted Bordetella. In contrast, production of filamentous hemagglutinin is reduced in iron-depleted Bordetella. Thus, B. bronchiseptica controls the expression of virulence genes in response to iron starvation.     

The type III secretion system needle,tip, and translocon

Many Gram‐negative bacteria pathogenic to plants and animals deploy the type III secretion system (T3SS) to inject virulence factors into their hosts. All bacteria that rely on the T3SS to cause infectious diseases in humans have developed antibiotic resistance. The T3SS is an attractive target for developing new antibiotics because it is essential in virulence, and part of its structural component is exposed on the bacterial surface. The structural component of the T3SS is the needle apparatus, which is assembled from over 20 different proteins and consists of a base, an extracellular needle, a tip, and a translocon. This review summarizes the current knowledge on the structure and assembly of the needle, tip, and translocon.     

沙门菌致病岛2 Ⅲ型分泌系统研究进展

沙门菌(Salmonella)是革兰氏阴性的兼性胞内菌,可引起其广泛宿主的一系列疾病,严重时可导致全身性感染,威胁生命安全。沙门菌致病岛2(SPI2)是与沙门菌全身性感染密切相关的重要毒力基因簇,其编码的Ⅲ型分泌系统2(T3SS2)在沙门菌侵入宿主细胞后开始组装合成,经该装置分泌的多种效应蛋白对沙门菌在宿主细胞内的生存和增殖起着重要作用。近些年来,与沙门菌T3SS2相关的研究一直都是病原微生物领域关注的焦点之一。本文简要综述了SPI2的基因特征、SPI2基因表达的调控、T3SS2的结构和组成、T3SS2的效应蛋白及与T3SS2相关的疫苗研究等方面的主要研究进展。