向日葵盐胁迫相关基因的cDNA-AFLP差异表达

目的:研究向日葵盐胁迫前后基因表达的变化,分离并鉴定耐盐相关基因。方法:采用c DNA-AFLP技术分析盐胁迫产生的差异表达基因片段。结果:从256对引物组合中筛选到232对有差异表达的引物组合。用其进行选择性扩增,获得差异表达的上调TDFs 845条。经二次PCR扩增及反向Northern blot验证,获得42个阳性TDFs。对其中12个TDFs进行克隆及序列测定,得到10条TDFs核苷酸序列。经Blastx比对及功能分析,10个TDFs均与应答盐胁迫相关,涉及信号转导相关蛋白、胁迫相关功能蛋白、衰老相关蛋白以及与蛋白相互作用有关的蛋白。结论:利用c DNA-AFLP技术鉴定出一批盐胁迫应答基因,为揭示向日葵耐盐分子机制及指导向日葵耐盐分子育种实践奠定基础。     

桂花萜烯合酶(TPS)的生物信息学与原核表达分析

挥发性萜烯类化合物是植物花和果实中重要的香气活性物质,萜烯合酶(TPS)的种类和功能决定物种中萜烯类物质的多样性。桂花作为重要的香花植物,萜烯类物质是其花香的重要成分,但有关桂花萜烯合酶的研究却并不多。为揭示桂花萜烯类物质的生物合成机理,该研究利用生物信息学分析了4个TPS蛋白的理化性质、亚细胞定位及其结构,在原核表达系统中进行4个TPS蛋白的体外表达,并对可溶性的TPS4重组蛋白进行了体外酶反应功能分析。结果表明:(1) 4个TPS蛋白的理化性质差异较小,但仅有TPS4蛋白定位于其他靶向,不含信号肽,延伸链的比例较低,在靠近氨基端的区域内不含延伸链。(2) 4个TPS蛋白在原核系统中均可成功表达,但仅有TPS4获得了可溶性重组蛋白。(3)将纯化的TPS4重组蛋白分别与GPP、NDP和FPP进行反应,均只检测到一种产物,分别为反式-β-罗勒烯、β-水芹烯和α-法呢烯。这为揭示植物萜烯类物质生物合成的分子机理提供了参考,对从蛋白水平研究桂花花香基因功能奠定了基础。     

用cDNA-AFLP技术筛选新生牛软骨无血管区的高表达基因

软骨一直被认为是内源性血管生成抑制物的重要来源.为更好理解软骨血管生成抑制的遗传学基础,对软骨中与血管生成抑制有关的基因进行了初步的探索.本研究应用cDNA-AFLP技术对新生牛关节骨骺软骨无血管区和有血管区的差异表达基因进行分析,筛选无血管区特异表达或高表达的基因,共得到43个无血管区高表达的片段.通过对片段进行亚克隆、测序及同源性分析,结果发现,16个片段与已知基因同源,25个片段只在牛的基因组数据库中找到同源序列,另有2个片段未找到同源序列.在同源基因中,肌钙蛋白Ⅰ亚型其血管生成抑制作用已有较详细报道;S100A7与血管生成和肿瘤发生的关系也已有阐述.另外14个同源基因按生物过程分析,发现参与了细胞周期调节、信号传递、细胞间相互作用及新陈代谢等多个生物过程. 研究结果提示,牛软骨组织无血管区的无血管状态可能由多基因介导,其中一些可能是已知或未知的新基因.     

基于cDNA-AFLP及MSAP技术分析西瓜同源二倍体和四倍体低温胁迫差异表达

为了研究西瓜二倍体及同源四倍体在低温胁迫下的分子机制,以西瓜‘京欣’1号母本83166（二倍体）及其同源四倍体为材料,利用MSAP及cDNA-AFLP技术研究低温处理前后基因表达的差异,并对差异带进行克隆、测序和比对。22对MSAP引物扩增得到1564个位点,其中二倍体经低温处理后总甲基化率下降2.8%,四倍体下降6.4%。将12条差异带与西瓜基因组数据库比对,有7条带确定是西瓜基因组序列。26对cDNA-AFLP引物组合扩增出1267条带,其中二倍体上调表达占48.2%,下调表达占51.8%;四倍体上调表达占58.6%,下调表达占41.4%。23条差异带在NCBI中找到了同源序列基因,包括假定蛋白（39.13%）、能量与代谢（43.48%）、物质运输（8.70%）、转录相关（4.35%）以及逆境相关（4.35%）,另有10条无同源序列。低温胁迫后,四倍体去甲基化率与上调表达量均高于二倍体,而且四倍体诱导出的差异基因参与了物质的能量代谢调控及逆境胁迫过程,说明四倍体较二倍体有更强的耐冷性。     

基于cDNA-AFLP技术的玉米种子劣变相关基因分析

以人工控制劣变处理（温度45℃,相对湿度100%）3 d的玉米杂交种‘郑单958’种子为材料,通过cDNA-AFLP技术,共获得约5 400个转录本。对差异片段进行测序分析,最终获得122个种子劣变相关基因序列（DRS）,其中,上调表达74个,下调表达48个,功能涉及初生代谢、次生代谢、蛋白代谢、转录与调控、胁迫响应、信号转导和运输。采用qRT-PCR技术分析了11个上调表达差异基因的表达模式,结果显示不同基因的表达模式存在较大差异,说明不同基因在种子劣变中可能扮演不同角色。     

利用cDNA-AFLP技术分析龙眼子叶胚基因表达差异

分别提取'红核子'龙眼(Dimdcarpus longan Lour.)谢花后35 d(早期)和50 d(晚期)子叶胚RNA,建立cDNA-AFLP分析体系,获得指纹图谱.对41个差异片段回收克隆和序列分析,表明其中21个与已知功能基因具有高度同源性,这些基因的功能主要涉及侧牛器官的离轴极性、糖酵解、能最代谢、离子转运、细胞壁伸长、细胞周期调控、RNA转录、RNA翻译和调控、蛋白磷酸化调控和降解、信号转导等;其余片段与已知基因的同源性较低或没有.     

桂花开花进程中花瓣色素、可溶性糖和蛋白质含量的变化

以软叶丹桂(O smanthus fragrans‘Ruanye Dangu i’)、柳叶银桂(O.fragrans‘Liuye Y ingu i’)和四季桂(O.fra-grans‘Sijigu i’)3个桂花品种为试材,研究了桂花不同品种开花和衰老过程中的花瓣色素、可溶性糖和蛋白质等的变化。结果表明:(1)从初花期到盛花期再到衰老期,类胡萝卜素和花青素的含量先升高再下降,与花瓣颜色深浅变化一致,表明不同时期花色的变化主要由色素的含量变化所引起。(2)3个桂花品种花瓣的含水量、可溶性糖和可溶性蛋白质的含量均呈下降趋势,而花期较长的软叶丹桂比柳叶银桂和四季桂降幅要低,而柳叶银桂和四季桂之间差异不显著。     

小麦抗黄矮病相关基因cDNA-AFLP差异表达片段的验证

cDNA-AFLP技术是研究基因差异表达的有利工具,广泛用于植物抗病、抗逆和生长发育等研究领域.本研究以cDNA-AFLP技术分离的抗黄矮病小麦与感黄矮病小麦间差异表达片段为对象,利用反向Northern方法,从cDNA-AFLP技术筛选的46个候选抗黄矮病防御基因差异表达片段中,筛选出抗黄矮病相关防御基因片段6个;采用对回收的差异片段进行再扩增(延伸引物再扩增),再与原选扩产物一起进行PAGE电泳分析法,并结合半定量RT-PCR分析法,又验证了候选抗黄矮病相关基因表达片段3个.反向Northern方法以及对回收的差异片段进行再扩增(PAGE再分析法),结合(半)定量RT-PCR分析方法,可以比较准确地验证cDNA-AFLP所筛选出的基因差异表达片段.     

盐爪爪耐盐相关基因的cDNA-AFLP分析

以不同浓度NaCl(0、100、200、300、400和500 mmol/L)处理生长了4周的盐爪爪(Kalidium foliatum),48h后取其幼嫩叶片用于RNA提取,并进行了cDNA-AFLP表达差异分析.结果表明,用256对引物扩增出连续性差异片段155条,按照NaCl浓度升高的顺序,划分为8种差异带类型,即强→弱"、弱→强"、有→无"、无→有"、有→无→有"、无→有→无"、强→弱→强"和弱→强→弱".测序后获得176个新表达序列标签(ESTs),已将长度大于100 bp的162个ESTs登录到GenBank,登录号为HO205290~HO205450.经BLAST序列比对分析发现,盐爪爪的耐盐性可能与能量、新陈代谢、防御、转运、转录和翻译等相关蛋白有关.     

油菜种子发育和萌发过程中脱水耐性相关基因的cDNA-AFLP分析

选取甘蓝型油菜种子发育和萌发过程中与脱水耐性相关的不同时间点,采用cDNA-AFLP技术通过128对引物组合分析,共获得394条特异转录衍生片段(TDFs)。经BLAST序列比对,发现其中189条与GenBank数据库中已知功能基因同源,按其功能可分为转录因子、基础代谢、抗逆胁迫、信号转导等相关蛋白。RT-PCR技术对差异显著性片段验证结果显示,泛素蛋白、油体蛋白、热激蛋白和一些转录因子片段均受到种子脱水诱导表达。研究结果表明,发生在种子发育和萌发过程中的脱水耐性反应非常复杂,涉及植物生命活动的诸多领域。     

桂林地区不同桂花品种花香成分比较分析

为了解桂林地区不同桂花的花香成分差异,该研究采用顶空固相微萃取(HS-SPME)与气相色谱/质谱联用(GC-MS)技术,对桂林地区12种桂花的花瓣挥发性成分进行了检测分析。结果表明:共检测到49种挥发性成分,包括萜稀类31种、脂肪酸及其衍生物10种、苯基类4种和含氮化合物4种。其中,萜稀类化合物在4个品种群甚至12个品种中均属于比例最高的,总相对含量为82.28%～94.83%。所检测的桂花均含有反-β-罗勒烯等6种花香成分,但不同品种所含成分不同或相对含量不同,如‘龙怀金桂’含有β-紫罗酮且含量最高(为34.89%),而‘橡叶朱砂’却缺少β-紫罗酮。各品种主要的香气成分及其含量也不完全相同,如‘龙怀金桂’的主要香气成分是β-紫罗酮等5种,‘月塘金桂’是β-紫罗酮等8种,‘橡叶朱砂’为顺-氧化芳樟醇等6种。共鉴定出11种香气活性物质,其中10种属于萜稀类。‘龙怀金桂’香气活性物质总含量最高(为82.99%),且紫罗酮类和罗勒烯类活性物质的含量也最高;‘橡叶朱砂’和‘天香台阁’含有芳樟醇类活性物质最高(在60%左右)。综上认为,萜稀类化合物为桂林地区桂花的主要香气成分,不同桂花品种既含有共同的香气成分也含有不同的成分;‘龙怀金桂’适合开发罗勒烯类和紫罗酮类物质产品,‘橡叶朱砂’和‘天香台阁’适合开发芳樟醇类物质产品。     

NaCl胁迫对5个桂花品种叶片超微结构的影响

该研究以5个桂花品种为材料,以Hoagland培养液为对照,设计2个NaCl含量(70、100 mmol/L)处理10 d后利用透射电镜和扫描电镜观察各处理不同品种的叶片超微结构特征,以明确桂花品种对耐NaCl胁迫的解剖结构响应机制。结果显示：(1)透射电镜观察发现：随NaCl 胁迫程度的加强,5个桂花品种叶肉细胞中叶绿体结构受到不同程度地破坏;70 mmol/L NaCl处理后,5个品种的细胞核基本保持正常,而100 mmol/L NaCl处理后核内染色质发生降解;随着NaCl胁迫程度的加强,5个桂花品种的类囊体片层结构中嗜锇颗粒明显增多;在膜结构方面,大叶银桂的叶肉细胞被破坏程度最为严重,叶绿体膜被破坏,叶绿体形状基本不能辨认。(2)扫描电镜观察结果显示：随着NaCl浓度的增大,5个品种叶片表面的气孔密度不断增大,而张开气孔的密度却不断减小,且叶肉细胞体积均缩小;‘大叶银桂’、‘笑秋风’、‘晚籽银桂’的栅栏组织占叶厚的比重随NaCl胁迫浓度的增大而升高,‘潢川金桂’和‘紫梗籽银桂’的栅栏组织占叶厚的比重则随NaCl胁迫浓度的增大而呈先升高后降低的趋势。研究表明,NaCl胁迫对桂花叶片细胞叶绿体、细胞核等的超微结构会造成损伤,且NaCl胁迫浓度越高损伤越明显。该试验可初步判断‘大叶银桂’、‘笑秋风’、‘晚籽银桂’的耐盐性略高于‘潢川金桂’和‘紫梗籽银桂’。     

桂花RAP2 12基因的克隆与表达模式分析

国家自然科学基金(31870695);     

遮阴对四季桂生理生态特性的影响

为了解遮阴对四季桂(Osmanthus fragrans)生长的影响,研究了成都地区夏季遮阴处理下四季桂扦插苗生理生态特性的变化。结果表明,随遮光率增加,比叶重下降;叶绿素b(Chl b)含量增加,Chl a/b降低。遮阴下叶片可溶性糖、可溶性蛋白含量降低,以80%遮光率下降的最显著;随遮光率上升,叶片丙二醛(MDA)含量下降,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性降低,以55%、80%遮光率的MDA含量下降显著。遮阴处理下,叶片光饱和点(LSP)、光补偿点(LCP)、最大净光合速率(Pmax)、暗呼吸速率(Rd)均下降,而表观量子速率(AQE)增大;瞬时光能利用率(LUE)升高,净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、气孔限制值(Ls)均降低,胞间CO_2浓度(Ci)升高。四季桂幼苗主要通过提高Pn和抗氧化酶活性来适应强光环境;降低SLW、LSP、LCP和Rd,提高Chl和Ci含量,增大AQE和LUE提高弱光利用能力,中度遮阴(25%、55%遮光率)有利于幼苗在夏季的生长。     

基于AFLP分子标记的桂花品种核心种质的构建

用100个桂花品种荧光AFLP分子标记信息构建核心种质。利用获得的指纹信息,运用UPGMA聚类取样法,采用Kimura 2-parameter遗传距离,多次聚类随机抽样。结果表明:(1)8对引物共获得514条带,平均每对引物获得64条带。(2)从100个桂花品种中筛选了30个样本的核心种质。(3)比较核心种质和全部种质的Shan-non-Wiener指数(H′)和Simpson指数(D),t检验值均说明核心种质的遗传多样性指数与全部种质遗传多样性没有明显差异,表明所构建的核心样品能够很好地保留原始100个桂花品种的遗传多样性。     

桂花叶的化学成分及抗肿瘤活性研究

为了解桂花(Osmanthus fragrans)叶片的化学成分,应用多种色谱分离手段从桂花叶醇提溶液分离得到13个化合物,经波谱分析分别鉴定为香橙素(1)、染料木黄酮(2)、lupinalbin A(3)、齐墩果酸甲酯(4)、3-羰基齐墩果酸(5)、fouquierol(6)、19α-羟基-3-O-乙酰熊果酸(7)、白桦脂醇(8)、豆甾-3,5-二烯-7-酮(9)、刺五加酮(10)、对羟基苯乙酮(11)、3,16α-二羟基-对映贝壳杉烷(12)和trigoflavidone A(13)。所有化合物均为首次从桂花中分离得到。采用MTT法检测抗肿瘤活性表明,化合物2、3、10均有一定的抗肿瘤活性,且对4种肿瘤细胞株的活性检测为首次报道。     

香鳞毛蕨DfGNOM基因的克隆及其表达分析

GNOM是一种ADP核糖基化因子(ARF)的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF),为探索GNOM在香鳞毛蕨(Dryopteris fragrans)中的抗逆功能,该研究克隆了DfGNOM并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析了DfGNOM基因在不同植物激素及逆境胁迫处理下的表达模式,为进一步探索该基因的功能以及香鳞毛蕨的抗逆机制奠定基础。结果表明:(1)成功获得DfGNOM全长4 338 bp,蛋白质多序列比对以及进化树分析表明,DfGNOM与江南卷柏(Selaginella moellendorffii) SmGNOM亲缘较近,motif分析表明该蛋白含有sec7保守结构域。(2) qRT-PCR分析显示,DfGNOM在香鳞毛蕨的根、叶柄和叶中均有表达,但在叶中表达量最高;DfGNOM的相对表达量在生长素(IAA)处理后总体上调,在脱落酸(ABA)处理后总体下调;在NaCl处理下呈"降-升-降"的变化趋势,高温和低温处理下呈"升-降-升"变化趋势;在茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯利(ETH)以及PEG处理下,DfGNOM的相对表达也表现出不同的模式。研究认为,DfGNOM在香鳞毛蕨非生物胁迫响应过程中发挥调控作用。     

桂花树冠层气孔导度模型的优化及其参数分析

冠层气孔导度(g_c)是许多陆面过程模型中的重要参数,提高对冠层气孔导度的模拟精度非常重要。以环境因子阶乘的Jarvis形式的模型是气孔导度模型中的典型代表,但研究中不同的环境因子有不同的响应方程和参数。研究认为不同的响应方程有不同的模拟效果,并通过比较各环境因子的不同响应方程组合的模型的模拟效果来确定最优的g_c模型。以桂花树为例,测定了树干液流、茎水势和微气象环境,用Penman-Monteith(PM)方程反推计算冠层气孔导度并检验不同方程组合的16种模型。模型的参数用DiffeRential Evolution Adaptive Metropolis(DREAM)模型优化。结果表明这种方法能够有效地找到各环境因子最优的响应方程,从而最优化g_c模型。优化的g_c模型很好地模拟了桂花树冠层气孔导度的变化,尤其是对干旱的响应,模拟值与PM计算值的相关系数和均方根误差分别为0.803和0.000623 m/s。同时也证明了模型中温度函数f(T)1的现象并非个例,由于温度(T)和水汽压亏缺(D)常是高度相关的,建议在以后的g_c模型研究中应把T和D看成一个影响因子,但f(T)1的这种现象是否具有全球性还有待进一步研究证实。