番茄LeRma1基因的克隆与表达

以番茄‘哈大粉801’为试材,利用RT-PCR技术,克隆得到1个E3泛素蛋白连接酶基因LeRma1（GenBank登录号XM_004243764.1）。对LeRma1基因进行序列分析,并对LeRma1基因在番茄植株的不同部位以及在非生物胁迫（干旱、盐、碱、高温、低温）下的表达和生理特性进行研究,为培育和改良番茄品种提供理论依据。结果表明：（1）序列分析显示,LeRma1基因的cDNA全长序列729 bp,编码242个氨基酸,分子量为27.05 kD,理论pI 7.97;同源分析显示,番茄LeRma1蛋白与马铃薯的一致性最高（91%）。（2）半定量PCR检测表明, LeRma1基因在番茄根、茎、叶、花、果实中均有表达,且表达差异不明显。（3）干旱胁迫下,LeRma1基因在番茄叶片中优势表达,而在整个干旱过程中根部的LeRma1基因表达量变化不明显;抗旱相关基因LEA、 DREB2A、ABI3在干旱胁迫过程中,番茄叶片中均有表达,且其表达量呈上升趋势,而在根部DREB2A、ABI3基因基本没有检测到。（4）干旱胁迫过程中,番茄植株中丙二醛（MDA）含量呈显著升高趋势,质膜系统严重损伤,体内保护酶（SOD、POD、CAT）活性上升,且根部活性总体明显高于叶片。（5）在非生物逆境（盐、碱、高温、低温）胁迫过程中,LeRma1基因在番茄叶片和根部的表达几乎都有增强的趋势,且在叶片中均是胁迫3 h后诱导起始增强表达。研究认为,LeRma1基因是一个受干旱胁迫诱导增强表达的基因,且在叶片中优势表达,说明LeRma1基因对植物耐受干旱胁迫所起的作用存在一定的组织差异性,而且LeRma1基因可能参与番茄的干旱应答及信号转导过程,在番茄抵抗其他非生物胁迫中LeRma1基因也可能具有一定的作用。     

大豆E3泛素连接酶基因GmAIRP1的同源克隆及在烟草中的功能鉴定

E3泛素连接酶在植物抵御高盐及干旱等非生物胁迫过程中发挥重要作用。本研究克隆获得大豆E3泛素连接酶基因GmAIRP1,该基因cDNA全长为642 bp,编码213个氨基酸。蛋白结构域分析表明,GmAIRP1具有典型的RING-finger结构域。系统进化树分析表明,GmAIRP1与蒺藜苜蓿MtAIRP1同源性最高,亲缘关系最近。表达分析显示,GmAIRP1可被高盐、干旱和ABA诱导表达,并在胁迫1 h或3 h时表达量达到最大。抗逆表型分析表明,GmAIRP1转基因烟草在高盐和干旱胁迫21 d后,生长状态优于野生型,提高了植株对高盐和干旱胁迫的耐受性。生理指标测定结果显示,在高盐和干旱胁迫下,GmAIRP1转基因烟草的POD和CAT活性提高,整体高于对照,MDA含量始终低于对照。以上研究结果表明,Gm AIRP1能够通过激活抗氧化酶活性、提高渗透调节物质的积累来增强植物抵御高盐和干旱胁迫的能力,在植物响应高盐和干旱胁迫中发挥正调控作用。     

小麦TaDRLea3 2基因的克隆及胁迫诱导表达分析

胚胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA蛋白) 是植物体中广泛存在的一类与渗透调节相关的家族蛋白,植物受非生物胁迫会大量表达。该研究采用同源克隆技术,从干旱诱导的小麦品种‘郑引1号’ (Triticum aestivum L.)中获得1个新的LEA3家族基因（ TaDRLea3 2）,该基因全长668 bp,编码区为570 bp,编码189个氨基酸。生物信息学分析表明该蛋白为亲水性蛋白,二级结构以α 螺旋为主,含有9个由11个氨基酸组成的保守结构域,为典型的LEA3蛋白,存在3个磷酸化位点,无信号肽结构域及跨膜结构域,可能定位于细胞质中;实时定量PCR结果表明, TaDRLea3 2基因受干旱、高盐、低温诱导表达,同时也受外源ABA诱导,推测 TaDRLea3 2为ABA依赖型 LEA3基因,以不同机制参与小麦对非生物胁迫的应答过程,为深入分析小麦LEA3家族蛋白的抗逆机制奠定了基础。     

藜麦CqSAP8基因克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

该研究根据NCBI公布的藜麦胁迫相关蛋白(SAP)基因CqSAP8序列进行克隆,利用生物信息学分析CqSAP8蛋白序列、理化性质和结构特点,并采用qRT PCR方法检测CqSAP8基因表达的组织特异性及在非生物胁迫下的相对表达。结果表明：(1)藜麦CqSAP8基因CDS全长528 bp,编码175个氨基酸;预测CqSAP8蛋白分子量为18.73 kD,理论等电点为7.46,属于稳定的亲水性蛋白质;CqSAP8蛋白在N端和C端分别含有A20和AN1保守域,是SAP蛋白最典型的类型。(2)序列比对与进化分析显示,藜麦CqSAP8与甜菜BvSAP8、菠菜SoSAP8亲缘关系最近,序列相似性分别为89.66%和89.47%。(3)qRT PCR分析表明,藜麦CqSAP8基因在根、茎、叶、花和种子中均有表达,且在种子中表达量最高;CqSAP8基因在干旱和高温胁迫12 h表达量达到最大值,分别是对照的13.09和17.47倍,高盐和低温胁迫下的最大表达量均为对照的3.91倍,说明藜麦CqSAP8基因响应多种非生物胁迫应答;另外,藜麦CqSAP8的表达量在ABA胁迫下24 h急剧升高,推测CqSAP8基因在非生物胁迫前期的响应不依赖ABA。该研究为进一步研究CqSAP8基因功能及抗逆分子机制奠定了基础。     

大麦产量相关基因HvYrg1的克隆及植物RNA干扰载体的构建

大麦谷粒是受多个数量性状基因(QTL)控制的复杂性状,而RING E3泛素连接酶在决定大麦产量和蛋白质降解途径中起到极为重要的作用。本研究按照同源克隆的方法,依据水稻、拟南芥、玉米、小麦和酵母等E3泛素连接酶保守区域设计引物,采用RT-PCR方法从西藏大麦中克隆出产量相关基因HvYrg1全长cDNA序列,包括完整的开放阅读框架(ORF)1 275 bp,编码蛋白为424个氨基酸(GenBank No. EU333863)。同源性比较结果显示,它与GenBank上已报道的水稻GW2基因同源性最高为86%。以植物表达载体pCAMBIA2300-35s-OCS质粒为基础,构建由35s启动子调控的HvYrg1基因的RNA干扰载体pCAM-RNAi-HvYrg1。这一载体的成功构建为研究该基因在作物产量的功能鉴定打下了很好的基础。     

番茄转录因子基因SlWRKY6的克隆与原核表达分析

该研究基于番茄基因组数据库SGN(Sol Genomic Network)信息,利用RT PCR从栽培番茄‘M82’(Solanum lycopersicum)中成功克隆到番茄SlWRKY6基因(登录号：Solyc02g080890),通过qRT PCR方法和原核表达初步验证其生物学功能。结果表明：(1)生物信息学分析显示,番茄SlWRKY6基因ORF全长1 653 bp,编码550个氨基酸,其蛋白结构含有1个WRKYGQK保守结构域和C₂H₂锌指结构域,属于IIb类;其基因启动子上游1 500 bp含有多个激素响应元件和非生物胁迫响应元件。(2)进化树分析显示,SlWRKY6与潘那利番茄SpWRKY31 X1(NP_001352691.1)的相似性最高,且定位于细胞核内。(3)qRT PCR结果显示,SlWRKY6基因在番茄根、茎、叶中均有表达,在叶中的表达量最高,且受盐和干旱诱导表达。(4)SDS PAGE及Western blot结果显示,pET 30a SlWRKY6重组蛋白的大小约66 kDa,与预期大小一致。(5)原核表达分析显示,重组菌E. coli BL21∷pET 30a SlWRKY6在不同浓度盐(NaCl)和干旱(Mannitol)胁迫下生长速度显著低于对照菌E. coli BL21∷pET 30a,且在400 mmol/L NaCl、800 mmol/L甘露醇胁迫条件下最为显著;滴板实验初步验证SlWRKY6转录因子能提高重组菌E. coli BL21∷pET 30a SlWRKY6在ABA和pH 9(NaOH)胁迫的耐受性;在400 mmol/L NaCl、pH 5(HCl)、800 mmol/L甘露醇胁迫条件下耐受能力降低。研究表明,SlWRKY6转录因子可能通过参与ABA途径来响应非生物胁迫。     

‘潘那利’番茄碱性螺旋环螺旋转录因子基因的克隆与表达分析

碱性螺旋环螺旋(basic/Helix Loop Helix, bHLH)转录因子是植物最大的转录因子家族之一,其广泛参与植物逆境胁迫响应。该研究从野生‘潘那利’番茄(Solanum pennellii Correll)中成功克隆出bHLH转录因子基因SpbHLH89(Sol Genomics登录号Sopen04g001150),采用qRT PCR分析其在干旱胁迫下的表达模式,并利用异源表达初步分析其对非生物胁迫的响应。结果表明：(1)SpbHLH89编码区包含684 bp,编码227个氨基酸,具有典型的碱性螺旋环螺旋区,主要定位于细胞核中;进化树结果显示,SpbHLH89转录因子高度保守,与拟绒毛烟草NtbHLH94(Nicotiana tomentosiformis)存在高度相似性。(2)qRT PCR结果显示,SpbHLH89在‘潘那利’番茄的茎、叶和花中均有表达,其表达量受干旱胁迫诱导。(3)SDS PAGE与Western bloting结果显示,pET 30a SpbHLH89重组蛋白大小约为31 kD。(4)在盐胁迫(400 mmol/L NaCl)和干旱胁迫(600 mmol/L甘露醇)条件下,异源表达重组蛋白的E. coli BL21(DE3)重组菌生长速度提高,说明异源表达SpbHLH89转录因子基因可提高细菌对非生物胁迫的耐受性。     

马尾松HDR基因克隆及其对旱与盐胁迫的响应

干旱和土地盐渍化是制约林业可持续发展的重要因素,植物在遭受生物或非生物胁迫时,会在叶片释放萜类等挥发性物质。1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)是MEP途径的末端活性酶,具有提供前体萜类物质和主要限速作用。为探究马尾松HDR基因是否参与干旱和盐胁迫条件下的胁迫响应,该研究克隆了马尾松HDR基因开放阅读框,并初步分析了其生物信息、组织特异性表达水平和初步功能。结果表明:(1)PmHDR基因编码区长度为1 458 bp,编码485个氨基酸,其编码蛋白包含LytB/IspH基因超家族的核心序列和PLN02821多功能结构域,属于HDR家族。(2)PmHDR密码子使用偏好性较弱,偏好使用A/U结尾的密码子,烟草、拟南芥与酿酒酵母更适合作为其异源表达受体。(3)qRT-PCR结果显示,PmHDR基因在马尾松老叶中表达量最高,其次为幼叶、幼茎和老茎,在根中表达量最低。(4)构建基因表达载体pBI121-PmHDR并转化拟南芥,转基因拟南芥对干旱和盐胁迫表现出更强的抗逆性。以上研究结果表明PmHDR参与了植物干旱和盐胁迫的响应和调节,并为马尾松抗逆育种提供了一定的理论支持。     

拟南芥中RING型E3泛素连接酶基因AtGW2的克隆和功能分析

水稻RING型E3泛素连接酶基因OsGW2在调控水稻产量性状方面起着十分重要的作用.根据OsGW2的cDNA序列,通过RT-PCR方法从拟南芥中克隆了一个与OsGW2同源的基因,命名为AtGW2.序列分析表明,该基因编码一个RING-C2型E3泛素连接酶蛋白,含有401个氨基酸.通过构建AtGW2 RNA干扰植物表达栽体并转化拟南芥,结果表明,获得的转基因后代植株的子粒较野生型大,并且转基因拟南芥子粒千粒重高于野生型,这表明AtGW2负调控拟南芥子粒大小及粒重.     

向日葵E3泛素连接酶基因克隆及表达分析

该研究从向日葵中克隆了E3泛素连接酶基因HERC2,并进行了生物信息学分析和不同胁迫条件的表达分析。序列分析表明,HERC2(登录号为KT832066)序列的CDS为1 608bp,编码535个氨基酸,预测其分子量131kD,等电点为5.03。HERC2编码的蛋白质为疏水性蛋白质,且为细胞质蛋白;亚细胞定位预测分析表明,向日葵HERC2可能定位在高尔基体中;该蛋白质有5个RCC1保守结构域。向日葵HERC2与已报道的其他植物同源蛋白有相似的保守区域,与醉蝶花亲缘关系最近,而与大豆和野生大豆的亲缘关系最远。与HERC2cDNA对应的gDNA(登录号为KT832067)的ORF长度为3 409bp,与cDNA编码序列比对结果表明,该gDNA由5个外显子和4个内含子组成。实时荧光定量PCR分析表明,向日葵HERC2基因表达受非生物胁迫调节,在不同器官及不同非生物胁迫下存在特异性表达差异。研究认为,HERC2基因应答逆境胁迫具有其特定的表达模式,研究结果为加强对HERC2的利用奠定了基础。     

拟南芥AtPUB18的亚细胞定位和酶活性及AtPUB18的表达

通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆到AtPUB18全长ORF。利用VectorNTI和MEGA 5.0对蛋白序列进行生物信息学分析结果显示,AtPUB18和AtPUB19蛋白序列相似性为74.9%,一致性为63.5%;构建AtPUB18启动子(1 974bp)融合GUS报告基因载体并转化拟南芥,组织化学染色分析显示,低温和干旱诱导后转基因植株中AtPUB18表达水平显著提高;构建AtPUB18与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合的瞬时表达载体并转化原生质体,激光共聚焦显微镜观察发现,AtPUB18-GFP融合蛋白分布在细胞核和细胞质中;构建AtPUB18与麦芽糖结合蛋白基因(MBP)融合表达载体并转化大肠杆菌表达融合蛋白,纯化后的蛋白进行泛素连接酶活性检测结果显示,在小麦泛素激活酶E1和人泛素结合酶E2存在时,AtPUB18具有泛素连接酶活性。研究表明,AtPUB18是一个有功能的泛素连接酶,定位在细胞膜和细胞质中,可能参与拟南芥对非生物胁迫的响应。     

油葵HaGPAT1基因的克隆及表达分析

该研究利用RT-PCR技术,从油葵(Helianthus annuus L.)种子中克隆了甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因(HaGPAT1),对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测该基因在不同组织、种子不同发育时期以及不同胁迫条件下的表达特征。结果表明:HaGPAT1基因全长为1 656bp,编码551个氨基酸,相对分子量为62.132kD,等电点为8.84。系统进化树分析表明,HaGPAT1蛋白与高等植物莴苣的GPAT1亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,HaGPAT1基因在油葵花蕊中的表达水平最高,开花后17d的种子中次之;在干旱和盐胁迫条件下,HaGPAT1基因的表达水平均显著上调。研究推测,HaGAT1基因可能在油葵花器官发育中发挥重要作用,并且参与了油葵对干旱和高盐的抗性调节。     

甘薯细胞色素P450单加氧酶基因IbCYP714E1和IbCYP714E2的鉴定及表达分析

CYP714基因在植物赤霉素合成与代谢过程中发挥着重要作用。该研究从甘薯基因组中鉴定出2个CYP714基因,对基因的结构和编码蛋白质的理化性质等进行了生物信息学分析,并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析基因在不同组织和非生物胁迫条件下的表达特征,为解析甘薯CYP714基因的生物学功能提供帮助。结果表明:(1)2个基因为分别编码518个和521个氨基酸的碱性亲水蛋白,被亚细胞定位于细胞质中;(2)2个蛋白质均含有CYP714蛋白亚家族的3个特征结构域,与毛白杨的PtCYP714E2、PtCYP714E4和PtCYP714E5蛋白聚为一类,分别定名为IbCYP714E1和IbCYP714E2;(3)荧光定量PCR分析显示,IbCYP714E1和IbCYP714E2基因的表达部位存在一定差异,IbCYP714E1在柴根、初生根和叶片中表达量较高,而IbCYP714E2基因只在柴根和花上表达量较高,在盐和干旱胁迫下,IbCYP714E1基因表达量均增加,而IbCYP714E2基因只在盐胁迫条件下表达量增加。IbCYP714E1和IbCYP714E2基因可能参与赤霉素的降解和对非生物胁迫的应答。     

水稻胁迫相关基因OsPM1启动子的克隆与分析

依据NCBI数据库OsPM1的序列信息,采用PCR技术扩增获取OsPM1的2 100bp的启动子序列。利用PLACE预测启动子的顺式作用元件分析表明,启动子内含有大量与胁迫相关的顺式作用元件,主要有ABA响应相关元件、脱水响应元件、低温响应元件、热激响应元件和转录因子结合元件。构建OsPM1的启动子和GUS基因融合表达载体,转入拟南芥。组织化学染色分析结果显示,非生物胁迫处理前,幼苗中GUS基因表达水平很低;干旱、低温、高盐等胁迫处理后,GUS基因表达量显著升高。研究表明,OsPM1的启动子能够显著提高在干旱、高盐和低温处理后下游基因的表达水平。     

马尾松R2R3-MYB基因特征及进化和表达分析

MYB类转录因子在植物生长发育、代谢、应答生物胁迫和非生物胁迫的响应等生物过程发挥重要作用。为探究马尾松R2R3-MYB基因结构及功能,该研究以转录组数据为研究区域,从中筛选获得了17个马尾松R2R3-MYB基因,利用生物信息学对基因进行理化性质、系统进化树等分析,同时利用荧光定量PCR技术分析基因的组织特异性以及在花发育时期和非生物胁迫下的表达模式。结果表明：(1)17个PmMYBs亚细胞定位于细胞核,均无跨膜结构,且均含有Motif1、Motif2保守基序。系统发育进化树将马尾松PmMYBs划分为9个亚家族,且与火炬松、白云杉等裸子针叶植物关系较近。(2)17个基因均属于组成型表达,但在不同组织的表达量不同;所有基因均参与了花发育和非生物胁迫,不同基因在花发育不同时期的表达存在差异,有7个基因可能参与了雌雄性状转变;大部分基因响应非生物胁迫上调表达,但响应胁迫的时间存在差异;少数基因在胁迫中下调表达,尤其是PmMYB11基因在所有胁迫中均明显下调表达。该研究较系统地分析了马尾松R2R3-MYB基因的结构特征、系统进化及其在花发育时期和非生物胁迫下的表达模式,为深入探究马尾松R2R3...     

向日葵E3泛素连接酶基因的分析定位和表达鉴定

该研究利用前期获得的向日葵耐盐相关基因E3泛素连接酶基因序列(HERC2),构建瞬时表达载体Cam-35S-HERC2-GFP,采用基因枪法转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位;采用RT-PCR技术,分析盐胁迫下HERC2在耐盐品种P50和盐敏感品种P29根、下胚轴和叶中的表达差异;构建HERC2植物表达载体pPZP221-HERC2,采用农杆菌介导法将HERC2导入烟草,进行耐盐功能验证。结果表明:(1)HERC2蛋白定位在细胞膜、细胞质和细胞核中。(2)受到NaCl胁迫后,HERC2基因在耐盐品种P50和盐敏感品种P29中均上调表达,但耐盐品种中的表达量较高。(3)HERC2基因的表达,能够提高转基因烟草的耐盐性。该研究结果为进一步解析向日葵对盐胁迫的响应机制,以及耐盐新品种的选育奠定了基础。     

Arabidopsis C3HC4‐RING finger E3 ubiquitin ligase AtAIRP4 positively regulates stress‐responsive abscisic acid signaling

Degradation of proteins via the ubiquitin system is an important step in many stress signaling pathways in plants. E3 ligases recognize ligand proteins and dictate the high specificity of protein degradation, and thus, play a pivotal role in ubiquitination. Here, we identified a gene, named Arabidopsis thaliana abscisic acid (ABA)‐insensitive RING protein 4 (AtAIRP4), which is induced by ABA and other stress treatments. AtAIRP4 encodes a cellular protein with a C3HC4‐RING finger domain in its C‐terminal side, which has in vitro E3 ligase activity. Loss of AtAIRP4 leads to a decrease in sensitivity of root elongation and stomatal closure to ABA, whereas overexpression of this gene in the T‐DNA insertion mutant atairp4 effectively recovered the ABA‐associated phenotypes. AtAIRP4 overexpression plants were hypersensitive to salt and osmotic stresses during seed germination, and showed drought avoidance compared with the wild‐type and atairp4 mutant plants. In addition, the expression levels of ABA‐ and drought‐induced marker genes in AtAIRP4 overexpression plants were markedly higher than those in the wild‐type and atairp4 mutant plants. Hence, these results indicate that AtAIRP4 may act as a positive regulator of ABA‐mediated drought avoidance and a negative regulator of salt tolerance in Arabidopsis.     

A rice really interesting new gene H2‐type E3 ligase,OsSIRH2‐14, enhances salinity tolerance via ubiquitin/26S proteasome‐mediated degradation of salt‐related proteins

Salinity is a deleterious abiotic stress factor that affects growth, productivity, and physiology of crop plants. Strategies for improving salinity tolerance in plants are critical for crop breeding programmes. Here, we characterized the rice (Oryza sativa) really interesting new gene (RING) H2‐type E3 ligase, OsSIRH2‐14 (previously named OsRFPH2‐14), which plays a positive role in salinity tolerance by regulating salt‐related proteins including an HKT‐type Na⁺ transporter (OsHKT2;1). OsSIRH2‐14 expression was induced in root and shoot tissues treated with NaCl. The OsSIRH2‐14‐EYFP fusion protein was predominately expressed in the cytoplasm, Golgi, and plasma membrane of rice protoplasts. In vitro pull‐down assays and bimolecular fluorescence complementation assays revealed that OsSIRH2‐14 interacts with salt‐related proteins, including OsHKT2;1. OsSIRH2‐14 E3 ligase regulates OsHKT2;1 via the 26S proteasome system under high NaCl concentrations but not under normal conditions. Compared with wild type plants, OsSIRH2‐14‐overexpressing rice plants showed significantly enhanced salinity tolerance and reduced Na⁺ accumulation in the aerial shoot and root tissues. These results suggest that the OsSIRH2‐14 RING E3 ligase positively regulates the salinity stress response by modulating the stability of salt‐related proteins.     

棉花抗逆基因GhAREB4的克隆及功能分析

AREBs转录因子家族基因主要参与干旱、高盐、低温等胁迫应答反应,在植物抵御各种逆境胁迫中起着非常重要的作用。该研究经序列电子拼接克隆了陆地棉GhAREB4基因,该基因全长1 784bp,其开放阅读框为1 227bp,编码408个氨基酸,预测分子量为44.3kD,等电点为8.88。蛋白结构预测发现,该蛋白二级结构中含有bZIP基因家族的保守结构域。系统进化树分析表明,GhAREB4与可可的AREB转录因子同源性最高。绿色荧光蛋白亚细胞定位分析表明,GhAREB4蛋白分布在细胞核内。qRT-PCR分析表明,GhAREB4基因在花中的表达量最高;且GhAREB4基因表达受到干旱、高盐、低温、脱落酸(ABA)等处理的诱导,其可能调控棉花对非生物逆境的耐性响应。研究结果为进一步研究该基因对棉花耐逆调控机制奠定了基础。