异育银鲫源杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的分离鉴定

【目的】分离鉴定江苏省扬州市养殖场异育银鲫患病病原。【方法】采用常规的理化特性和分子生物学的方法,对从濒死异育银鲫肝脏处分离到的菌株YZ-1进行表型生物学、分子生物学及药敏试验的系统研究。【结果】该菌株16S r RNA基因(序列长度1 446 bp,Gen Bank登录号为JX164202)与其它杀鲑气单胞菌16S r RNA基因一致性在99%-100%之间,构建发育树确定该菌株为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)。人工回感可导致异育银鲫死亡。药敏试验结果显示:对头孢呋辛、复方新诺明、恩诺沙星等23种抗生素敏感;对阿米卡星、四环素、大观霉素、头孢拉定等11种抗生素中度敏感;对青霉素G、链霉素、庆大霉素、氟苯尼考、万古霉素等10种抗生素耐药。【结论】研究结果证实引起异育银鲫死亡的病原为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种。     

一株感染杨尺蠖蛹的病原真菌的分离及鉴定

【目的】从山西省洪洞县的杨树丰产林中采集到几头自然染菌的杨尺蠖Apocheima cinerarius越冬蛹虫尸,经分离纯化得到一株病原真菌,定名为YHT01,确定该菌株的分类地位。【方法】用该菌株孢子悬浮液(1.0×108 conidia/m L)感染杨尺蠖蛹进行回接杀虫实验,扫描电镜观察菌株形态学特征,ITS序列测定并构建系统发育树对YHT01菌株进行分子鉴定。【结果】经YHT01菌株感染之后,杨尺蠖蛹节间处长出白色菌丝。该菌株在PDA培养基上的菌落呈椭圆形,白色,绒毛状,菌落背面呈橙黄色;扫描电镜观察结果显示,该菌株孢梗束呈扫帚状,分生孢子小,卵形至椭圆形,壁光滑,大小为(2.1-3.4)μm×(1.1-1.8)μm。该菌株的r DNA-ITS序列与Gen Bank中粉棒束孢Isaria farinosa(Holm:Fr.)Fr.(AB233337)的序列相似性达99%,在系统发育树的同一分支上。【结论】YHT01是杨尺蠖蛹的一株病原真菌,粉棒束孢Isaria farinosa。     

大熊猫肠道芽孢杆菌的分离鉴定及部分生物学特性

【目的】分析大熊猫肠道中芽孢杆菌的种类、纤维素分解能力、抗微生物作用和常用抗生素药物敏感性。【方法】利用芽孢耐高温特性分离菌株,基于16S r RNA基因序列构建系统发育树,通过测量芽孢杆菌在刚果红纤维素培养基上的分解圈分析其纤维素分解能力,采用牛津杯法测定芽孢杆菌的抑菌能力,结合软件分析抑菌能力和进化树之间的关系,通过PCR调查芽孢杆菌的抗菌肽分布规律,最后通过药敏试验检测芽孢杆菌是否对常用抗生素敏感。【结果】共分离得到21株芽孢杆菌;进化树显示,这些芽孢杆菌分为6个类别(Category);羧甲基纤维素钠水解结果显示,所有菌株均能分解纤维素;大部分芽孢杆菌菌株对3种肠道病原菌有较强的抑制能力,聚类分析表明,菌株的抗菌能力与基于16S r RNA基因的分类有一定的关联性;66.67%(14/21)的菌株中可以检测到2个或3个抗菌肽基因;药敏试验结果显示,菌株整体药物耐受率低,仅为7.54%(19/264),但仍有少数菌株对抗生素耐受。【结论】分离菌株种类丰富,分布平均,且均具有纤维素分解能力。21株菌株都含有抗菌肽基因,代谢产物对3种肠道病原菌具有明显抑制作用。常用抗生素耐受性低,对规范临床用药具有指导性。     

一株猪葡萄球菌的分离鉴定、生物学特性研究及全基因组测序分析

【背景】2021年6月,广东省茂名市某散养户送检了一头发病仔猪,猪身上长有脓疱,四肢关节肿大,关节内可见脓液。【目的】确定引起仔猪发病的病原菌,分析其药物敏感性,为临床用药提供指导;对分离菌株进行全基因组序列分析,挖掘其毒力因子和耐药基因,揭示该菌致病和耐药的分子机制。【方法】取关节脓液分离细菌;通过革兰氏染色、16S rRNA基因和全基因组测序分析,鉴定细菌种类;通过溶血试验、血浆凝固酶试验和生长曲线测定,确定分离菌株的溶血活性、血浆凝固酶活性和生长特性;用小鼠感染模型评估分离菌株的致病性;用纸片扩散法测定分离菌株的药物敏感性;通过全基因组序列分析挖掘分离菌株的毒力因子和耐药基因。【结果】分离菌株被鉴定为猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus);该菌不溶血,无血浆凝固酶活性,在胰蛋白胨大豆肉汤培养基中于37℃、120r/min条件下生长良好;小鼠感染试验结果显示,该菌具有高致病性;药敏试验结果显示,该菌对苯唑西林、大观霉素等7种药物敏感,对青霉素G、红霉素等9种药物耐药;全基因组序列分析结果显示,该菌携带多个毒力因子和耐药基因。【结论】从发病仔猪的关节脓液中分离到一株猪葡萄球菌,可用苯唑西林、大观霉素等药物防控该菌感染;解析了该菌的基因组信息,为后续深入研究该菌致病和耐药的分子机制奠定了基础。     

侧孢短芽孢杆菌AMCC 100017的分离鉴定及其生防潜力

【目的】从土壤中分离、筛选和鉴定具有抑制病原真菌活性等生防效果的菌株,为进一步开发利用具有良好定殖能力的生防菌株奠定基础。【方法】利用对峙试验筛选拮抗菌并评价其拮抗性能,根据其形态特征、生理生化特性、16S r RNA基因序列测定及Gen Bank序列相似性分析进行分离菌株的分类鉴定,并通过福林酚法测定该菌株的蛋白酶活力。【结果】从山东泰安各种类型土壤中分离得到侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus),保藏编号为AMCC100017。平板对峙试验结果表明该菌株对多种植物病原真菌均有较强的拮抗作用,尤其是对镰刀菌属致病菌拮抗效果明显。另外,本试验还初步验证该菌能产生较高活性的胞外蛋白酶。【结论】侧孢短芽孢杆菌AMCC 100017在作物真菌病害生物防治方面,有较好的开发和利用潜力,并可望应用于线虫生物防治。     

水稻种子内生泛菌(Pantoea spp.)系统发育多样性及其促生功能

【目的】Pantoea菌株是广泛分布在自然界中的一类功能多样的细菌。本研究对分离自水稻种子内生的Pantoea菌株进行系统发育分析及功能评价,从而确定分类地位、种类多样性、分布特征及功能特性。【方法】采用乙醇-次氯酸钠联合灭菌方法进行水稻种子的表面灭菌,进行内生细菌的分离与纯化;其次将纯化后的菌株进行16Sr RNA基因PCR扩增及序列分析,通过MEGA7软件构建系统发育树;将分离得到的菌株进行功能实验检测,如溶磷、产IAA、产铁载体、拮抗病原真菌等特性,最后检测菌株的溶血性;水稻分型采用SSR方法,并对水稻农学性状如分蘖数、株高、植株重及产量进行调查。【结果】本研究对分离自8个不同基因型水稻种子中的146株内生Pantoea菌株进行系统发育分析及功能评价,结果发现所分离到的泛菌菌株主要属于Pantoea dispersa、Pantoea agglomerans、Pantoea cypripedii以及Pantoea brenneri四个种,其中P. dispersa的菌株数量最多,分布最广,并且存在于所有的8个水稻种子样品中。对其中66株菌进行功能检测,发现86.3%和69.7%的菌株具有溶磷和产IAA能力,有7株菌具有产铁载体能力,未发现对真菌病害Fusarium moniliforme有拮抗作用的菌株,并发现3株菌具有溶血性;本实验未发现泛菌组成与水稻系统发育及农学性状存在明显的相关性。【结论】本研究首次对水稻种子中泛菌的多样性及其功能进行报道,发现不同基因型的水稻种子所含Pantoea种类及组成存在差异,种子选择性地积累了Pantoea类群,大部分菌株具有一定的促生特性。该研究结果有助于进一步探究微生物与植物的共进化、种子微生物的传播途径及作用方式。     

广义虫草属二新记录种

【背景】广义虫草属是一类重要的虫生真菌资源。【目的】对我国西南地区虫生真菌及其相关真菌资源进行调查。【方法】在贵州省习水县和花溪区进行标本采集,采用含双抗的PDA培养基分离目的菌株;基于形态学特征和ITS rDNA序列系统发育分析相结合的方法进行菌株鉴定。【结果】从采集到的标本中分离获得5个菌株,菌株GY1113、GY90809和GY90810在形态特征上与马拉维白僵菌模式菌株非常相近;系统发育树中二者以高持率(ML/BI为99/1)聚成一个分支。菌株A1997在形态特征上与鳞翅目虫草模式菌株非常吻合;系统发育树中二者以较高支持率(ML/BI为78/0.95)聚成一个分支。菌株A1972在形态上与苏格兰白僵菌模式菌株的形态特征非常相近;系统发育树中二者以高支持率(ML/BI为99/1)聚成一个分支。因此分别鉴定为马拉维白僵菌、鳞翅目虫草及苏格兰白僵菌。【结论】马拉维白僵菌和鳞翅目虫草为中国新记录种。     

一株分离自流浪猫的猪链球菌9型的分子生物学鉴定北大核心CSCD

【目的】猪链球菌是一种能感染人和猪的人畜共患病病原,并且还可零星感染多种哺乳动物。本试验旨在调查流浪猫携带猪链球菌的情况。【方法】在流浪猫身上分离猪链球菌,经血清凝集实验和PCR检测,鉴定其血清型;经多序列位点分型分析,鉴定其ST型;将所分离的细菌与Gen Bank上已公布的猪链球菌构建16S rRNA的系统发育树,分析该菌株与其他猪链球菌的亲缘关系;药敏纸片法分析其耐药性;小鼠攻毒试验分析其毒力。【结果】本试验在流浪猫身上分离到一株猪链球菌,命名为m70,其血清型为9型。多序列位点分型显示,m70株属于一个新的ST型。与Gen Bank上已公布的猪链球菌16S rRNA进行系统发育树分析,结果显示m70属于一个单独的分支。m70与临床菌株的耐药情况相似,对四环素耐药,对红霉素中介耐药,对氨苄西林敏感。小鼠攻毒试验显示,感染10~8 CFU剂量m70的小鼠,死亡率达到60%–80%（3/5–4/5）,3次攻毒试验的平均LD（50）为5.1×107 CFU;而本实验室保存的猪链球菌强毒株HA9801感染小鼠的平均LD（50）为3.9×107 CFU,两者之间没有显著差异（P〈0.05）。【结论】从流浪猫身上分离得到的猪链球菌m70属于优势血清型,且毒力较强,提示一些流行血清型的猪链球菌强毒株具有从流浪猫传染人的潜在风险。     

斑马鱼嗜水气单胞菌的鉴定和人工感染组织病理学研究

从患病斑马鱼体内分离致病菌株并进行鉴定,观察人工感染分离菌株后组织病理学变化。通过对分离菌株ZF4形态特征、生理生化特性、保守基因和系统发育树建立等综合分析进行鉴定。结果显示,ZF4为β溶血的革兰氏阴性短杆菌,吲哚试验为阳性,发酵葡萄糖、蔗糖等糖类,AHA_0438、ASP、gyr B和16S r RNA等基因均为阳性,基于gyr B、16S r RNA基因系统发育分析结果显示ZF4为嗜水气单胞菌。人工感染后斑马鱼临床症状明显,发生肝脏组织变性、肠道内膜脱落、脾脏充血、胰腺间质纤维组织增生等组织病理学变化。斑马鱼体内分离的ZF4鉴定为致病性嗜水气单胞菌,且斑马鱼对该菌敏感,因此斑马鱼可作为研究嗜水气单胞菌的动物模型。     

鳜源致病性维氏气单胞菌的鉴定及药敏试验

【目的】通过对从患病的鳜(Siniperca chuatsi)肝脏中分离得到的一株优势菌WJ2014-1进行鉴定,旨在确定病因并筛选出敏感药物,为今后鳜维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的防治提供参考。【方法】从患病鳜肝脏分离致病菌,通过对其生理生化特征与16S r RNA基因序列分析进行鉴定,并通过纸片扩散法进行药敏试验。【结果】用菌株WJ2014-1进行人工回归感染试验后,鳜发病症状与自然发病症状相似。根据该菌株的形态特征、生化特性、16S r RNA基因序列分析结果鉴定为维氏气单胞菌。该菌株对复方新诺明、强力霉素、罗红霉素、头孢噻肟、哌拉西林等21种抗生素敏感,对氯霉素、诺氟沙星、萘啶酸等9种抗生素耐药。【结论】分离得到的菌株WJ2014-1对鳜有致病性,生产中可选用复方新诺明、强力霉素、罗红霉素等药物进行防治。     

一株林麝肺源创口博德特氏杆菌全基因组及细胞致死性肿胀毒素分析

【目的】为探究林麝的死亡原因,本研究无菌采集1只死亡林麝肺脏后进行细菌的分离鉴定。【方法】通过细菌分离纯化、生化试验和16S rRNA序列分析,对分离菌株进行鉴定;然后通过药敏试验、全基因组测序与分析以及细胞致死性肿胀毒素(cytolethal distendin toxin subunit B,CDTB)分析,对分离菌株耐药性和致病性进行研究。【结果】在死亡林麝肺脏中分离出1株革兰阴性菌,经鉴定为创口博德特氏杆菌,命名为ZL0001。经过细胞培养观察和CDTB分析表明该菌为胞内寄生菌,含有细胞致死性肿胀毒素,能导致细胞凋亡。药敏结果表明该分离株对氨苄西林、亚胺培南、链霉素和四环素等药物敏感;对氨曲南、林可霉素、克林霉素和呋喃妥因耐药。全基因组测序分析结果表明,该菌株与其他创口博德特氏杆菌的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)值均97%,基因组大小为4350644 bp,共发现22个耐药相关基因。此外,该菌株基因组包含63个毒力相关基因,其参与鞭毛蛋白、脂多糖、铁摄取、抗血清蛋白以及细胞致死性肿胀毒素等毒力因子的合成。【结论】本研究首次在动物呼吸道中分离出创口博德特氏杆菌,并证明其为胞内寄生菌,对林麝肺炎的发病机理研究具有重要意义。     

尼古丁降解菌SCUEC1菌株的分离及其降解基因

【目的】分离并鉴定1株具有尼古丁降解能力的细菌,研究其尼古丁降解特性并对其降解基因进行分析,为尼古丁微生物降解提供基础。【方法】从烟草种植地土壤中分离1株具有尼古丁降解能力的细菌,通过16S r RNA基因和生理生化特性对该菌株进行鉴定,检测该菌株尼古丁降解率与生长量的关系,并进一步对该菌株进行尼古丁浓度耐受性测定,采用高通量测序技术对菌株进行全基因组测序,BLAST比对分析尼古丁降解相关基因。【结果】筛选到1株具有尼古丁降解能力的细菌,经鉴定命名为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumerficience)SCUEC1菌株,根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解率可达到94.81%,该菌株在尼古丁浓度为0.50–5.00 g/L范围内生长良好且有较高的尼古丁降解能力。对根癌土壤杆菌SCUEC1菌株全基因组序列进行BLAST比对分析,推测该菌株的尼古丁降解代谢途径与中间苍白杆菌SYJ1菌株的尼古丁降解途径相似。【结论】本研究揭示了Agrobacterium tumerficienceSCUEC1菌株具备尼古丁降解特性,初步推测出尼古丁降解相关基因和降解代谢途径,为尼古丁微生物降解提供基础。     

假单胞菌T1-3-2的抑菌特性及其对杉木的抗病促生作用

【背景】生物防治是“基于自然的解决方案”,有利于生态文明和可持续发展,开展生物防治技术研究的基础是明确菌株的生防作用和抑菌特性。【目的】探究杉木内生菌株T1-3-2的抑菌促生特性,为研制该菌株生防菌剂、防治杉木炭疽病(Cunninghamia lanceolata anthracnose)奠定基础。【方法】通过形态学特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析,确定菌株T1-3-2的分类地位;通过平板对峙、菌落径向生长抑制率和平板倒扣等方法测定细菌及其挥发性气体和次级代谢产物的抑菌作用;同时,测定其促生作用和室内防效。【结果】菌株T1-3-2与桉生假单胞菌(Pseudomonas eucalypticola)亲缘性较近,属于假单胞菌属。该菌株对分属于6个属的10株靶标菌株具有较强的拮抗作用,尤其对炭疽菌属、拟盘多毛孢属、黑孢霉属和葡萄座腔菌属的6株靶标菌株抑制率高达80%以上。室内盆栽试验显示：菌株T1-3-2用Kings Medium B液体培养基的发酵菌液对杉木炭疽病的防效可达74.20%,同时能有效改善杉木幼苗的生长状况、增加生物量。【结论】菌株T1-3-2隶属于假单胞菌属,对杉木具有良好的抗病促生作用,是一株具有开发潜力的生防菌株。     

一株兔源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定和全基因组测序及分析

【背景】多杀性巴氏杆菌可导致猪肺疫、牛出血性败血症和兔出血性败血症等多种疾病,严重威胁多种动物畜牧养殖业的健康发展。【目的】重庆某兔场送检一批病死兔,为研究其病原和治疗方法,对病原进行了微生物分离和全基因组测序分析。【方法】从2022年重庆某兔场送检兔病料中进行细菌分离纯化、生化试验、16S rRNA基因鉴定、荚膜血清型分型、药敏试验和毒力基因检测,同时通过全基因组测序结果进行毒力、耐药基因注释和遗传进化等分子生物学信息分析。【结果】该菌为兔源A:ST74多杀性巴氏杆菌,命名为LXSS001,基因组序列上传到NCBI数据库(登录号为CP119523.1),药敏试验显示该菌对四环素、杆菌肽、复方新诺明和磺胺异恶唑耐药,对头孢噻肟、头孢哌酮和丁胺卡那等药物敏感。全基因组长度为2 480 671 bp,并注释到了58个毒力基因和9类药物的靶向抗药基因。通过联合建树表明其与3480株一致性最高。【结论】本研究完成了一株A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定和全基因组测序,并揭示了其与国内外其他分离株的进化关系,为多杀性巴氏杆菌的后续研究提供了参考依据。     

双组分系统rcsC基因影响禽致病性大肠杆菌的致病性及相关生物学特性

【目的】双组分系统Rcs感受外界环境变化,并调控细菌的适应性及生存等。本文探讨Rcs双组分系统传感器激酶RcsC对禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)相关生物学特性及致病性的影响。【方法】采用Red同源重组的方法构建rcsC基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株,然后比较野生株、基因缺失株与互补株的生长特性、运动性、生物被膜、凝集沉淀能力、致病力及毒力基因转录水平的差异。【结果】rcsC基因缺失不影响APEC的生长速度,然而,缺失RcsC导致APEC的运动能力升高、生物被膜形成能力降低和凝集能力增强。凝集试验结果显示rcsC基因有助于APEC的凝集沉降。细胞黏附入侵结果表明,rcsC在APEC侵袭DF-1细胞过程中发挥作用,而对黏附能力无影响。动物感染试验结果表明rcsC基因缺失能显著降低APEC的毒力。荧光定量PCR检测结果表明,rcsC基因缺失株中ompA、aatA、fyuA和luxS基因的转录水平均显著降低,而fimC和tsh基因的转录水平显著升高。【结论】RcsC参与调控APEC的运动性、生物被膜形成、凝集沉降和致病力。     

红树林土壤中产聚羟基脂肪酸酯细菌的分离及其评估

[背景] 细菌能通过合成聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalknoates,PHA）在细胞内储存物质和能量,提高对环境的适应能力。在红树林中,由于土壤周期性受海水浸没,形成营养物质种类丰富和含量波动大的特殊生境,为细菌进化出特殊的PHA合成途径提供了条件。[目标] 为了增加对红树林产PHA细菌资源的了解,获得产PHA细菌,使用纯培养方法分离和鉴定细菌,并评估菌株的产PHA能力。[方法] 采集红树植物海桑根系和红树滩涂土壤样品,连续5周培养、分离纯化获得细菌菌株;通过16S rRNA基因相似性及系统进化分析鉴定细菌分类地位,利用PHA合成酶基因（phaC）鉴定细菌合成PHA的能力;通过基因组草图测序,分析细菌的phaC基因种类、代谢通路及系统进化关系;通过气相色谱分析细菌产PHA的累积量及组成。[结果] 从红树林土壤样品中分离得到97株细菌,其中13株带有phaC基因,包括坚强芽孢杆菌（Cytobacillus firmus）、弯曲芽孢杆菌（Bacillus flexus）、除烃海杆菌（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）和酯香微杆菌（Microbacterium esteraromaticum）。B. flexus MN15-19以丙酮酸盐为碳源,可累积细胞干重11%的PHA,同时具有固碳功能的还原性三羧酸循环通路,有开发成为固碳产PHA工程菌株的潜力。酯香微杆菌可产PHA,但是其phaC基因结构特殊,基因组注释未能识别出任何已知phaC基因。[结论] 研究发现红树林土壤可培养细菌中存在未知的PHA合成途径,说明红树林生态系统中的细菌具有资源挖掘的重要价值。     

肌醇、唾液酸及岩藻糖代谢途径对嗜水气单胞菌致病性的影响

【目的】调查肌醇、唾液酸以及岩藻糖代谢途径在嗜水气单胞菌感染宿主过程中对细菌致病性的影响。【方法】采用同源重组技术分别缺失嗜水气单胞菌NJ-35株的肌醇代谢相关基因iolC、唾液酸代谢相关基因nanA和岩藻糖代谢相关基因fucK,测定各缺失株对斑马鱼的半数致死量(LD_(50));将野生株与缺失株共感染鲫鱼,统计野生株和缺失株在不同组织中的细菌载量。【结果】各代谢相关基因的缺失均成功阻断了菌株对相应底物的降解能力。iolC的缺失导致菌株对斑马鱼的LD50升高近12倍,而nanA和fucK的缺失对LD50没有明显影响。野生株与iolC缺失株共感染鲫鱼,肝脏、脾脏和肾脏中野生株的载量显著高于缺失株,表现出明显的生长优势;nanA和fucK缺失株与野生株共感染鲫鱼,野生株和缺失株载量在各组织中均无明显差异。【结论】肌醇代谢途径在嗜水气单胞菌感染致病过程中发挥重要作用,而唾液酸和岩藻糖代谢途径对细菌无明显影响。     

加州鲈源鰤鱼诺卡氏菌的分离鉴定及致病性

[背景] 鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolae）是一种严重危害水产养殖业的病原菌,可引起以体表溃疡、出血及组织器官形成结节为特征的鱼类慢性肉芽肿疾病,目前尚无有效的防治方法。[目的] 明确引起安徽省临泉县某养殖场加州鲈（Micropterus salmonoides）结节病的病原菌,探讨其致病性,为该病的有效防治提供科学依据。[方法] 取肝脏结节病灶接种于TSB培养基分离优势细菌,利用表型检查结合分子生物学方法鉴定分离菌株。进一步通过检测分离菌株的毒力基因、测定其对加州鲈的半数致死量（LD₅₀）以及所感染加州鲈的组织病理学变化与组织载菌量,分析其致病性。[结果] 从病鱼体内分离到一株优势菌株NI,综合NI分离株的表型特性、16S rRNA基因序列与鰤鱼诺卡氏菌参考株相应序列的一致性以及特异性PCR扩增结果,确定其为鰤鱼诺卡氏菌。鰤鱼诺卡氏菌NI分离株携带毒力基因gapA、ibeA和mip,人工回归感染后加州鲈出现与自然病例相似的症状,其对加州鲈的LD₅₀为2.58×10⁶ CFU/尾。组织病理学观察到头肾、心脏、肝脏、胃和脾脏均出现慢性肉芽肿病变,肠管肌层疏松、肠绒毛脱落,肌肉组织中肌纤维疏松、间隙增宽。qPCR检测结果显示,组织中鰤鱼诺卡氏菌载量由高到低依次为头肾、心、肝、胃、脾、肠和肌肉。[结论] 鰤鱼诺卡氏菌是引起此次加州鲈结节病的病原菌,对该菌致病性的研究为加州鲈诺卡氏菌病的防控提供了理论依据。     

乌鳢源杀鱼爱德华菌的分离鉴定及药敏特性研究

[背景] 江苏省扬州市某乌鳢养殖场发生疾病,给养殖户造成了严重的经济损失。[目的] 确定病因并筛选出敏感药物,为乌鳢相关疾病的防治提供参考。[方法] 从患病乌鳢体内分离致病菌,并从形态、生理生化特征、16S rRNA和gyrB基因序列及特异性PCR检测等方面对分离菌株进行鉴定,同时开展人工感染试验分析其致病性,通过纸片扩散法进行药敏特性分析。[结果] 从患病乌鳢体内分离获得优势菌株SHL,经形态特征、理化特性、16S rRNA和gyrB基因序列及特异性PCR检测鉴定为杀鱼爱德华菌。进一步人工感染试验证实其对乌鳢有较强的致病性,LD₅₀为1.6×10⁵ CFU/g,发病症状与自然发病症状相似。药敏试验结果显示,该菌株对青霉素、氯霉素、四环素等28种抗菌药物高度敏感,对红霉素中度敏感,对苯唑西啉、克拉霉素、万古霉素等6种药物耐药。[结论] 引起江苏省扬州市某养殖场的乌鳢体表溃烂及死亡的病原菌为杀鱼爱德华菌,这是我国首次从淡水鱼类中检出致病性杀鱼爱德华菌,表明该菌的感染谱在扩大,需引起水产养殖领域的重视,在养殖过程中可根据药敏实验结果选用合适的国标渔药进行防治。     

嗜虫耶尔森氏菌HlyA及HasA外分泌表达系统的构建

【目的】构建一株具备外分泌蛋白功能的工程菌,解决杀虫毒素无法由胞内分泌至胞外,无法直接作用于虫体等问题,为松墨天牛防治提供新思路。【方法】本研究先测定从松墨天牛肠道及其生境中分离出的嗜虫耶尔森氏菌(CSLH88)的生长特性及抗性,进而对其进行分子改造。构建HlyA (pGHKW2)以及HasA (pGHKW4)外分泌表达载体,利用电穿孔法将其转入CSLH88菌株,获得能够表达绿色荧光蛋白的工程菌。利用稀释涂板及荧光体式镜检测技术对两个质粒进行遗传稳定性检测,并采用SDS-PAGE及Western blotting技术验证蛋白外分泌功能。【结果】CSLH88菌株培养2–4 h能够进入对数生长期,并对卡那霉素(Kan)敏感。成功构建了含有Kan抗性基因的pGHKW2(GenBank:MK562405)和pGHKW4(GenBank:MK562404)两个外分泌表达载体的CSLH88工程菌株。其中,发现pGHKW4质粒更加适合在嗜虫耶尔森氏菌中稳定遗传。SDS-PAGE及Western blotting检测结果表明HlyA系统无法在CSLH88菌株中将目的蛋白分泌到胞外,而HasA系统则可以有效地发挥外分泌表达功能。【结论】通过对HlyA及HasA两个外分泌表达系统进行研究,从中筛选出HasA型血红素转运系统作为CSLH88菌株的外分泌表达系统,为后续外分泌杀虫毒素蛋白菌株构建以及CSLH88菌株的致病性研究奠定基础。