通过定点诱变法研究耐热碱性磷酸酯酶的活性位点、耐热性和亲热性

通过对耐热碱性磷酸酯酶ＴＡＰＮＤ２７活性位点Ｓ（６９）两侧的Ｅ（６８）和Ｓ（７０）的定点突变,得到了３个突变子Ｅ６８Ｓ、Ｓ７０Ａ和Ｅ６８ＳＳ７０Ａ。在蛋白纯化的基础上测定了３个变体的一些酶学性质,与ＴＡＰＮＤ２７相比,Ｅ６８Ｓ的比活力上升８倍,Ｔｍ下降了３℃,最适反应温度上升了２０℃;Ｓ７０Ａ的比活力上升了１部,Ｔｍ下降了２℃,最适反应温度上升了５℃;Ｅ６８ＳＳ７０Ａ的比活力下降了５０％,Ｔｍ下降     

一个耐热碱性磷酸酯酶突变型的研究

为了进一步揭示蛋白质的耐热机制,对含有耐热碱性磷酸酯酶（ＦＤ－ＴＡＰ）的表达质粒ｐＴＡＰ５０３Ｆ进行了随机诱变,用菌落原位显色法从约５０００个转化子中筛选到４个耐热性下降的突变型克隆,并对其中１克隆（ＴＡＰＭ３）进行了部分酶学性质、ＤＮＡ和氨基酸序列的研究。酶学性质研究表明,与野生型相比,该突变型酶的耐热性有较大幅度的下降,而热激活性无明显改变。ＤＮＡ序列分析表明在１２３９位ＴＡＰＭ３发生Ｇ→Ａ转     

嗜热细菌的碱性磷酸酯酶的研究

从５８株来自国内温泉的嗜热细菌中分离到一株菌,它所产生的耐热碱性磷酸酯酶在９５℃中保温６０ｍｉｎ后仍保留原来活力的７５％．测定了酶的一系列性质,包括酶作用的最适ｐＨ、最适离子强度、最适温度,以及酶的热稳定性、米氏常数、活化能等等,还研究了一些无机离子、氨基酸以及表面活性剂对酶活的影响．ＤＮＡ杂交方面的初步实验结果表明用该酶标记的核酸作为非放射性探针可用于在高温下进行的杂交反应．     

嗜热细菌的碱性磷酸酯酶的研究

从５８株来自国内温泉的嗜热细菌中分离到一株菌,它所产生的耐热碱性磷酸酯酶在９５℃中保温６０ｍｉｎ后仍保留原来活力的７５％。测定了酶的一系列性质,包括酶作用的最适ＰＨ,最适离子强度,最适温度,以及酶的热稳定性,米氏常数,活化能等等,还研究了一些无机离子,氨基酸以及表面活性剂对酶活的影响。     

耐热碱性磷酸酯酶的功能结构域的定位

 为了确定耐热碱性磷酸酯酶 (TAPND2 7)发挥活性所必需的功能结构域 ,通过 PCR介导的诱变缺失 ,得到了 N端分别缺失 8、1 6、2 5个氨基酸的 3个缺失体 p TAPN8、p TAPN1 6和p TAPN2 5以及 C端分别缺失 1 0和 30个氨基酸的两个缺失体 p TAPC1 0和 p TAPC30 .经表达和活性测定 ,发现 p TAPN8和 TAPC1 0保持了较高的活性而其余 3个缺失体则失去酶活性 .据此 ,TAPND2 7的活性区域被定位在 8～ 465氨基酸之间 .在分离纯化的基础上测定了一些酶学性质 .发现 TAPN8和 TAPC1 0的比活没有大的改变 ,Tm 下降了 5.5℃ ;TAPN8的最适反应温度上升了1 0℃ .结果提示了 N端和 C端的这些氨基酸残基对热稳定性有一定的贡献 ,N端氨基酸残基还对酶的亲热性有贡献 .     

耐热碱性磷酸酶突变体耐热性变化机理研究

从耐热碱性磷酸酶（TAP）200多个随机突变体的克隆库中选出耐热性明显下降的4株突变体,进行全序列及表达产物的最高耐受温度和最适反应温度测定和酶分子高级结构的模拟,分析突变位点、高级结构和耐热性表现三者的关系,探讨引起耐热性变化的机理。结构模拟显示所有突变位点都仅能引起细微的、局部的结构变化,除T320→I外都未直接触及酶的活性中心;结构上的细微改变虽然对最适反应温度影响不明显,但却使最高耐受温度降低了10℃左右;T320→I靠近酶的活性中心,尽管未能引起结构的较大变化,但却使最高耐受温度和最适反应温度同时显著降低。可见,多数点突变对高级结构的影响都不剧烈,但对耐热性尤其是最高耐受温度的影响却比较明显,一般地,在非活性区的突变通常只能引起最高耐受温度的降低,靠近活性区的突变则能同时引起最适反应温度和最高耐受温度的降低。     

耐热碱性磷酸酯酶的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

以pUC118质粒为载体,以E.coil TGl为受体,构建了产耐热碱性磷酸酯酶(FD-TAP)的菌株Thermus sp.FD3041的染色体基因文库。在包含1.2万个转化子的文库中,90％的转化子插入有3～10kb的外源DNA片段。用菌落原位碱性磷酸酯酶显色法从文库中筛选到5个阳性克隆。对其中的1个克隆(pTAP362)所产的TAP进行了研究,发现克隆的TAP与出发菌株所产的TAP的热稳定性、最适反应温度和最适pH等性质都相同。通过做物理图谱和测定部分缺失的质粒的TAP活性,将TAP基因定位于2kb的BamHⅠ-HindⅢ DNA片段上。模拟PCR实验表明该酶可用于PCR扩增产物的检出。     

大豆磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶研究Ⅲ、非专一性酸性磷酸酯酶的纯化与特性

从大豆叶片中分离能水解磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的酸性磷酸酯酶,通过硫酸胺分部(20%～50%饱和度)沉淀、DEAE纤维素层析、刀豆球蛋白琼脂糖凝胶亲和层析将酶纯化了422.47倍,活性达78.16U/mg蛋白。该酶对PEP专一性不强,Km为1.09mmol/L(PEP),最适pH5.8,在pH4.8～7.0范围内及60℃以下较稳定,水解PEP的活性被Mg2+、Mn2+激活,F、Cu2+、Zn2+、PO43、MoO42及3磷酸甘油酸(3PGA)、三磷酸腺苷ATP等代谢物抑制,受异柠檬酸等有机酸影响较小。     

信号肽去除的耐热碱性磷酸酯酶FD-TAP在大肠杆菌中的亚克隆和高表达

通过计算机辅助分析,发现在耐热碱性磷酸酯酶（简称ＦＤ－ＴＡＰ）的Ｎ端存在２６个氨基酸的信号肽序列。但一般信号肽切点并非是完全专一的,所以利用基因工程手段将ＦＤ－ＴＡＰ的Ｎ端分别缺失２４、２５、２６和２７个氨基酸,得到了Ｎ端分别缺失２４、２５、２６和２７个氨基酸的克隆子ｐＴＡＰＮＤ２４、ｐＴＡＰＮＤ２５、ｐＴＡＰＮＤ２６和ｐＴＡＰＮＤ２７。考虑到这样的无隆子其翻译起始区所形成的能量较低结构稳定的二组     

耐热碱性磷酸酶(FD-TAP)的结构模型研究

 以大肠杆菌碱性磷酸酶 (BAP)为主要结构模板 ,用计算机同源结构模拟方法构建了耐热碱性磷酸酶 (FD TAP)的三维结构 ,对它们的结构特征进行了分析比较 ,并用Profile 3D和Ramachand ran图等方法分析了结构的合理性 .在此基础上 ,又构建了FD TAP 3个突变体的结构 ,用CHARMM能量计算法研究了FD TAP及其 3个突变体的能量与酶蛋白热稳定性之间的关系 ,得到了与实验完全一致的结果 .结果说明 ,如果氨基酸残基置换使蛋白质分子的总能量降低 ,疏水性增高和柔韧性减小 ,往往使蛋白质的耐热性增加     

无机磷酸盐对耐热碱性磷酸酶耐热性的影响

 为研究体外磷酸根离子对嗜热菌 (Thermussp .30 4 1)碱性磷酸酶TAPND2 7耐热性的影响 ,通过克隆于高表达质粒上编码TAPND2 7的基因在E .coli中的诱导表达和蛋白产物的纯化 ,获得了电泳纯的TAPND2 7.耐热性实验表明磷酸根离子能显著提高该酶的热稳定性 ,在 10mmol L磷酸根离子存在下 ,TAPND2 7的Tm 值从 91℃上升到了 97℃ ;酶的动力学实验证实无机磷酸盐 (Pi)对TAP ND2 7的酶活性有可逆竞争性抑制作用 ,Ki 值为 0 99× 10 -4 mol L .上述结果说明 ,TAPND2 7耐热性的提高是由于磷酸根离子对TAPND2 7活性位点的竞争性结合 ,这种结合 ,推测为Pi 与氨基酸残基间的非共价相互作用 ,减小了TAPND2 7的自由能 ,从而提高了它的热稳定性     

耐热碱性磷酸酶功能结构域的进一步定位

为了进一步精确定位耐热碱性磷酸酶 (TAP)的功能结构域和建立酶功能结构域定位的有效方法 ,在对TAP进行序列相容性比对及二级结构统计预测的基础上 ,以二级结构单元的完整性为依据对其功能结构域进行定位 .TAP的功能结构域在 35～ 4 76氨基酸之间 ,记为TAPN3 4C2 5(TAP的N端去掉 34个氨基酸而C端去掉 2 5个氨基酸 ) ,比盛小禹等定位的少 15个氨基酸 .克隆、表达实验结果证明了TAPN3 4C2 5的酶学活性 ,其最适反应温度为 72℃ ,比TAPND2 7(N端去除了 2 7个信号肽氨基酸的TAP)上升了 7℃ ,而最高耐受温度为 83℃ ,比TAPND2 7下降了 16℃ .实验结果表明 ,以二级结构预测结果进行酶功能结构域定位是一种更为精确的方法 .     

五氯酚对人胎盘碱性磷酸酶抑制的研究

监测人胎盘碱性磷酸酶在不同浓度五氯酚溶液中活力与荧光光谱的变化;测定五氯酚对其抑制的类型及pH对其抑制的影响.结果显示：低浓度的五氯酚(＜1.0 mmol/L)使酶活力及其荧光强度迅速下降,发射峰位明显红移;继续提高五氯酚浓度,其活力与荧光强度逐渐下降,发射峰位仍在红移;五氯酚浓度为5.0 mmol/L时,荧光淬灭,但酶仍保留51.4%的活力;五氯酚浓度高达10.0 mmol/L时,酶剩余活力为30.0%.进一步实验表明五氯酚使L-色氨酸的荧光强度降低,并伴有发射峰位的红移,当五氯酚浓度为5.0 mmol/L时,L-色氨酸的荧光淬灭.五氯酚是人胎盘碱性磷酸酶的反竞争性抑制剂,其抑制常数(K_i)为3.86 mmol/L.其抑制也受溶液pH影响,pH＜7.5时,对酶无抑制;pH为7.5～10.5时,随pH的增加,抑制作用逐渐增强.提示五氯酚能够进入酶分子内部使其荧光淬灭,并抑制了酶活力;表明酶活力抑制与五氯酚的解离状态有关.     

Non radioactive probes

This work concentrates on a single procedure, namely hybridizing Southern blots with nonradioactive probes. Stress is placed on features of the procedures where attention to detail is necessary to obtain strong signals and clear background. Some indications are given to the future development of the technology.