共表达PRRSV修饰的GP5与M蛋白的重组改良型痘苗病毒安卡拉株的构建及其生物学特性

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)修饰的ORF5(MORF5)与ORF6基因分别克隆入笔者构建的改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified vaccinia virus ankara, MVA) 转移载体pLR-gpt的两个多克隆位点中, 构建重组转移载体pLR-MORF5/ORF6。经脂质体介导, 将构建好的pLR-MORF5/ORF6 转染已感染亲本MVA 2h的BHK-21细胞单层, 用药物选择性培养基(MXHAT)在24孔板上进行连续筛选纯化, 得到带有筛选标记的重组病毒rMVAgpt-MGP5/M。将rMVAgpt-MGP5/M 感染表达Cre重组酶的BHK-21细胞(BHK-Cre), 获得删除筛选标记的重组病毒rMVA-MGP5/M。PCR证明MORF5与ORF6成功插入MVA基因组中; Western blotting与间接免疫荧光证明重组病毒能表达MGP5与M蛋白; 重组病毒的生长特性表明与亲本MVA出现病变的时间及病毒滴度基本一致。结果表明, 本研究成功构建了共表达PRRSV MGP5与M蛋白的重组MVA, 并且表达产物具有免疫原性; 外源基因的插入不影响MVA复制, 具较好的稳定性, 从而为PRRSV新型基因工程疫苗的研制奠定了良好的基础。     

共表达猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒NJ-a株ORF4、ORF5与ORF6基因重组改良型痘苗病毒安卡拉株的构建

为探讨共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinerep roductive and respiratory syndrome Virus,PRRSV)保护性抗原基因的重组改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia Virus Ankala,MVA)的免疫效力,将PRRSVNJ-a株ORF4、ORF5和ORF6基因插入转移载体pⅡLR中,获得了三基因共表达的转移载体pⅡLR-ORF5/ORF6/ORF4,通过同源重组的方法获得重组病毒rMVA-GP5/M/GP4。以lacZ为报告基因进行噬斑筛选和重组病毒纯化后,PCR方法证明ORF4、ORF5和ORF6成功的插入MVA基因组中;经Western blot检测与间接免疫荧光试验证实,重组病毒感染细胞能正确表达PRRSVGP4、GP5与M蛋白。用rMVA-GP5/M/GP4免疫6周龄Babl/C小鼠,首免后3周可检测到特异性PRRSV中和抗体,8周后中和抗体效价可达25,并能继续维持4周;淋巴细胞增殖试验结果表明,重组病毒免疫小鼠产生强烈的特异性细胞增殖反应。上述研究结果表明rMVA-GP5/M/GP4具有良好的免疫原性,可作为预防PRRS的候选疫苗进一步研究。     

表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建与鉴定

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是目前危害世界养猪业的两种重要病原。本研究采用PCR方法构建PRRSV疫苗株TJM-F92全长cDNA克隆载体pCMV-TJM,并在其ORF7和3′UTR之间插入AflⅡ/MluⅠ酶切位点和转录调控序列TRS6,构建获得pCMV-TJM-TRS表达载体。将PCV2ORF2基因插入该载体AflⅡ/MluⅠ位点,获得重组质粒pCMV-TJM-Cap。将pCMV-TJM、pCMV-TJM-TRS和pCMV-TJM-Cap分别转染Marc-145细胞,拯救获得3种重组病毒rTJM、rTJM/TRS和rTJM/Cap。基因测序列、酶切鉴定、Western blot、间接免疫荧光和病毒生长特性结果显示,3种重组PRRSV病毒都含有特征性分子标记,在Marc-145细胞增殖特性与亲本病毒相似;rTJM/Cap传至第8代,仍含有外源Cap基因,病毒感染细胞能有效表达PCV2Cap蛋白,从而为PRRSV致病机制和PRRSV-PCV2疫苗研究奠定了重要基础。     

表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组脑心肌炎病毒的构建与鉴定

以脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)作为病毒载体,寻找基因组里理想的外源基因插入位点,为构建多价疫苗奠定基础。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征等多种疾病。脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)宿主谱广,能够天然感染多种哺乳动物。本研究采用EMCV NJ08毒株cDNA感染性克隆,将PCV2ORF2基因插入EMCV L蛋白基因第6位及第7位氨基酸之间,拯救获得重组EMCV rNJ08/Cap,拯救病毒含有分子遗传标记。Western Blot和IFA结果显示,该重组病毒成功表达Cap蛋白。重组病毒rNJ08/Cap在BHK-21细胞上生长曲线和病毒蚀斑大小与亲本病毒NJ08相似,证明EMCV可以作为表达外源基因的病毒载体,为PCV2和EMCV疫苗研究奠定了重要基础。     

PRRSV-PCV2重组病毒的构建及PRRSV转录调控机制研究

目的 本研究旨在探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性cDNA克隆作为猪圆环病毒(PCV2)的主要免疫原开放阅读框架2(ORF2)表达载体的可行性,以及利用重组病毒对PRRSV复制转录过程进行解剖.方法 以北美株PRRSV感染性克隆pAPRRS为平台进行反向遗传操作,分别在pAPRRS的ORF1和ORF2间,ORF5和ORF6间,ORF6和ORF7间插入PCV2 ORF2,且对拯救病毒vPCV进行了病毒学及分子生物学鉴定.结果 vPCV的sgmRNA2.1利用了PRRSV mRNA2的转录调控序列(TRS),形成由PRRSV GP2和PCV2衣壳蛋白组成的sgmRNA2.1.外源基因的插入同时也导致重组病毒启用新的TRS 而产生3条新亚基因组,其中sgmRNA2.2和sgmRNA2.3采用PCV2上的序列来取代PRRSV RNA2本身的TRS;另一条sgmRNA2.4则为非经典型亚基因组,其TRS在PRRSV相应的AUG下游.结论 2株PRRSV-PCV2重组病毒可以稳定传代,为进一步研发PRRSV遗传标疫苗奠定了基础;插入片段上一些类似TRS序列的引入及插入片段(718bp)过长导致PRRSV ORF2 TRS 本身和其两翼序列的RNA结构变化是引起重组病毒遗传不稳定性的最主要原因;PRRSV可以利用TRS样外源序列作为转录启动子,这为进一步解剖PRRSV复制转录过程奠定了基础.     

共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5和M蛋白增强DNA疫苗免疫应答的研究

为了增强猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗免疫效力,分别以PRRSV ORF5m(修饰型ORF5基因)及ORF6为候选基因,构建了单基因或双基因共表达的真核表达质粒pCI-ORF5m、pCI-ORF6及pCI-ORF5m/ORF6。转染BHK-21细胞,Western blot检测证实ORF5m和ORF6基因均获得正确表达,并且共表达的GP5m和M蛋白能够形成异源二聚体。将构建的表达质粒免疫小鼠,首免后6周共表达ORF5m和ORF6基因的pCI-ORF5m/ORF6免疫组小鼠血清中和抗体全部阳转,8周时最高可达到1:32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答,明显高于单独表达ORF5m基因的pCI-ORF5m免疫组。进一步将DNA疫苗免疫断奶仔猪,pCI-ORF5m/ORF6免疫组同样能诱发优于pCI-ORF5m免疫组的中和抗体和细胞免疫反应。上述研究结果表明采用ORF5m和ORF6双基因共表达策略能够显著提高PRRSV DNA疫苗效力,为PRRSV新型疫苗的研制提供了有用的数据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白介导的E蛋白假型鼠白血病病毒的构建

利用RT-PCR法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5和ORF6基因,分别构建pcDNA-ORF5、pcD-NA-ORF5/6和pcDNA-ORF5-ORF6真核表达载体,磷酸钙共沉淀法瞬时转染293T细胞,48h后收集细胞,流式细胞仪检测,结果表明:PRRSV ORF5基因编码囊膜蛋白(E蛋白)能在在293T细胞表面表达,而由共表达M蛋白(ORF6基因编码的基质蛋白)介导的E蛋白的表达量比单独E蛋白表达量高,串联表达与单独E蛋白相比较低.将pcDNA-ORF5、pcDNA-ORF5/6和pcDNA-ORF5-ORF6分别与MuLV假病毒构建体系的两种骨架载体pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHITlll(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)瞬时共转染293T细胞,48h后收集假病毒上清,超速离心后通过Western blot证实E蛋白能够在此假病毒颗粒表面表达,证明E蛋白已整合到此假病毒粒子表面.将整合PRRSVE蛋白的假病毒粒子分别感染Marc-145和PAM宿主靶细胞,均能检测到LacZ基因的表达,结果表明:所构建的假病毒粒子具有感染性,且由M蛋白介导的MuLv-E/M感染性比MuLV-E假病毒感染性高.     

PRRSV-PCV2重组病毒的构建及PRRSV转录调控机制的研究

目的 本研究旨在探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性cDNA克隆作为猪圆环病毒(PCV2)的主要免疫原开放阅读框架2(ORF2)表达载体的可行性,以及利用重组病毒对PRRSV复制转录过程进行解剖。方法 以北美株PRRSV感染性克隆pAPRRS为平台进行反向遗传操作,分别在pAPRRS的ORF1和ORF2间,ORF5和ORF6间,ORF6和ORF7间插入PCV2ORF2,且对拯救病毒vPCV进行了病毒学及分子生物学鉴定。结果 vPCV的sg mRNA2.1利用了PRRSV mRNA2的转录调控序列(TRS),形成由PRRSVGP2和PCV2衣壳蛋白组成的sgm RNA2.1。外源基因的插入同时也导致重组病毒启用新的TRS而产生3条新亚基因组,其中sgm RNA2.2和sgm RNA2.3采用PCV2上的序列来取代PRRSVRNA2本身的TRS;另一条sgm RNA2.4则为非经典型亚基因组,其TRS在PRRSV相应的AUG下游。结论 2株PRRSV-PCV2重组病毒可以稳定传代,为进一步研发PRRSV遗传标疫苗奠定了基础;插入片段上一些类似TRS序列的引入及插入片段(718bp)过长导致PRRSV ORF2 TRS 本身和其两翼序列的RNA结构变化是引起重组病毒遗传不稳定性的最主要原因; PRRSV可以利用TRS样外源序列作为转录启动子,这为进一步解剖PRRSV复制转录过程奠定了基础。     

PRRSV NJ-a株ORF5基因A表位的修饰与糖基化位点的突变对其DNA疫苗免疫效力的影响

为了提高PRRSV ORF5基因的免疫效力,对ORF5基因进行了改造,将CpG序列和通用型辅助性T淋巴细胞表位插入A表位与B表位之间,并对N33与N51位糖基化位点进行了点突变,获得改造的ORF5基因。在此基础上构建了由两个CMV启动子调控的共表达改造的ORF5(MORF5)与ORF6基因的真核表达质粒pcDNA-M5A-6A。经Western-blot与IFA验证真核质粒的体外表达后,免疫6周龄Balb/c小鼠,利用微量中和试验检测免疫后的中和抗体,利用MTT法检测免疫后淋巴细胞的增生情况,并与未改造ORF5基因真核表达质粒pcDNA-5A-6A、弱毒疫苗以及灭活疫苗的免疫效果进行比较。结果表明,pcDNA-M5A-6A不但能够刺激免疫小鼠在较短的时间内产生更高水平的中和抗体,而且可以诱导产生更强烈的T淋巴细胞增殖反应。所构建的共表达PRRSV改造的ORF5基因与ORF6基因的DNA疫苗pcDNA-M5A-6A,能够较好的诱发小鼠产生较高的特异性针对PRRSV的中和抗体和细胞免疫应答,为研究能够更好地防制PRRSV的新型疫苗提供了新的思路。     

PRRSV全长感染性cDNA克隆的构建：非结构蛋白和结构蛋白之间编码区的分离

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是近两年来流行于我国大部分省份的“猪高热综合征”的主要病原体．该病毒在繁殖过程中具有遗传多变性和高频率的抗原突变．如何设计有效的疫苗来防治持续多变的流行变异株是研究者所关注的焦点．本研究中我们构建了Ⅱ型PRRSV弱毒株的感染性cDNA克隆,并对编码结构蛋白的ORF1和编码结构蛋白的ORF2之间插入几个酶切位点．通过RT-PCR和DNA测序以及分子克隆方法,获得了细胞致弱株（APRRS）的全长cDNA克隆．APRRSV基因组RNA为15521个核苷酸（不包括poly（A）尾）．与PRRSV Nsp株和疫苗株的相似性均为99．7％．根据测序结果,利用基因组上的酶切位点将全长PRRSV cDNA克隆到pBlueScript载体中,在病毒5＇末端引入T7启动子序列．为了区分重组病毒和亲本病毒,在ORF5编码区引入Mlu I酶切位点．将最初构建的全长cDNA和带有Mlu I酶切位点的cDNA分别体外转录成RNA后转染MA-104,均能够观察到典型的细胞病变（cytopathic effect,CPE）．拯救的重组病毒与亲本病毒有着相同的病毒学特性．通过突变PCR的方法将编码非结构蛋白基因ORF1和编码结构蛋白基因ORF2-7之间的编码区分离,从而构建了克隆pCSA．pCSA体外转录产物具有感染性,而且拯救的病毒与亲本病毒具有相同的病毒学特性．本研究为构建嵌合病毒作为疫苗候选株以此对遗传多变的PRRSV毒株提供有效的交叉保护提供了宝贵的工具,同时也为建立PRRSV为基因表达载体来构建针对其他重要的猪源疾病重组疫苗搭建了一个很好的平台．     

改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体

为了构建改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体,利用Cre/LoxP DNA重组系统以及本实验室表达Cre酶的BHK-21细胞系 (BHK-Cre),以大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (Eco gpt) 为筛选标记构建可删除筛选标记的双表达穿梭载体pLR-gpt。将Eco gpt 基因以及调控其表达的启动子基因置于2个同向的LoxP位点之间,2个独立的多克隆位点位于2个LoxP位点之外,最终获得的重组病毒可以在BHK-Cre细胞系上删除筛选标记Eco gpt。为了验证系统的有效     

Expression and cellular immunogenicity of a transgenic antigen driven by endogenous poxviral early promoters at their authentic loci in MVA

CD8(+) T cell responses to vaccinia virus are directed almost exclusively against early gene products. The attenuated strain modified vaccinia virus Ankara (MVA) is under evaluation in clinical trials of new vaccines designed to elicit cellular immune responses against pathogens including Plasmodium spp., M. tuberculosis and HIV-1. All of these recombinant MVAs (rMVA) utilize the well-established method of linking the gene of interest to a cloned poxviral promoter prior to insertion into the viral genome at a suitable locus by homologous recombination in infected cells. Using BAC recombineering, we show that potent early promoters that drive expression of non-functional or non-essential MVA open reading frames (ORFs) can be harnessed for immunogenic expression of recombinant antigen. Precise replacement of the MVA orthologs of C11R, F11L, A44L and B8R with a model antigen positioned to use the same translation initiation codon allowed early transgene expression similar to or slightly greater than that achieved by the commonly-used p7.5 or short synthetic promoters. The frequency of antigen-specific CD8(+) T cells induced in mice by single shot or adenovirus-prime, rMVA-boost vaccination were similarly equal or marginally enhanced using endogenous promoters at their authentic genomic loci compared to the traditional constructs. The enhancement in immunogenicity observed using the C11R or F11L promoters compared with p7.5 was similar to that obtained with the mH5 promoter compared with p7.5. Furthermore, the growth rates of the viruses were unimpaired and the insertions were genetically stable. Insertion of a transgenic ORF in place of a viral ORF by BAC recombineering can thus provide not only a potent promoter, but also, concomitantly, a suitable insertion site, potentially facilitating development of MVA vaccines expressing multiple recombinant antigens.     

Deletion of Fifteen Open Reading Frames from Modified Vaccinia Virus Ankara Fails to Improve Immunogenicity

Modified vaccinia virus Ankara (MVA) is a highly attenuated strain of vaccinia virus, which has been used as a recombinant vaccine vector in many vaccine development programmes. The loss of many immunosuppressive and host-range genes resulted in a safe and immunogenic vaccine vector. However it still retains some immunomodulatory genes that may reduce MVA immunogenicity. Earlier reports demonstrated that the deletion of the A41L, B15R, C6L, or C12L open reading frames (ORFs) enhanced cellular immune responses in recombinant MVA (rMVA) by up to 2-fold. However, previously, we showed that deletion of the C12L, A44L, A46R, B7R, or B15R ORFs from rMVA, using MVA-BAC recombineering technology, did not enhance rMVA immunogenicity at either peak or memory cellular immune responses. Here, we extend our previous study to examine the effect of deleting clusters of genes on rMVA cellular immunogenicity. Two clusters of fifteen genes were deleted in one rMVA mutant that encodes either the 85A antigen of Mycobacterium tuberculosis or an immunodominant H2-K^d-restricted murine malaria epitope (pb9). The deletion mutants were tested in prime only or prime and boost vaccination regimens. The responses showed no improved peak or memory CD8⁺ T cell frequencies. Our results suggest that the reported small increases in MVA deletion mutants could not be replicated with different antigens, or epitopes. Therefore, the gene deletion strategy may not be taken as a generic approach for improving the immunogenicity of MVA-based vaccines, and should be carefully assessed for every individual recombinant antigen.     

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK^- gE^- LacZ⁺ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK^- gE^- gI^- ORF1-ORF2⁺ ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK^- gE^- LacZ⁺ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。     

Selective transfer of individual human chromosomes to recipient cells.

Two hypoxanthine phosphoribosyltransferase-deficient human cell lines, D98/AH-2 and HT1080-6TG, were stably transfected with pSV2 gpt, a plasmid containing the selectable marker Escherichia coli xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (Eco gpt). Hypoxanthine-aminopterin-thymidine-resistant transformants arose with a frequency of ca. 10(-6) and contained mostly single, but occasionally multiple, copies of the plasmid sequences. These transformants actively express the Eco gpt marker. Single chromosomes from two different HT1080 gpt transformants and one D98 gpt transformant, containing the integrated plasmid sequences, were transferred via microcell-mediated chromosome transfer to hypoxanthine phosphoribosyl transferase-deficient mouse A9 cells. The transferred human chromosomes were identified as 2, 4, and 22, by using a combination of G-11 staining, G-banding, isoenzyme analysis, and in situ hybridization. This system is being used to create a library of interspecies microcell hybrid clones, each clone containing a unique single human chromosome in a mouse background. The complete library will represent the entire human karyotype.