DNA双链断裂修复的选择性调控机制

在各种DNA损伤中,DNA双链断裂(double-strand break,DSB)是最为严重的一种,快速准确地修复DSB对维持基因组稳定性起着至关重要的作用。真核生物细胞通过一系列复杂的信号转导途径激活对DSB的修复,其中最为重要的是同源重组和非同源末端连接机制。最近的研究表明,这两种方式在DSB修复的早期是相互竞争的关系,其选择在很大程度上受到53BP1及同源蛋白质的调控。将讨论53BP1作为DSB修复途径的核心因子,在染色质水平整合BRCA1、Ct IP等修复因子和多种组蛋白修饰构成的信号途径,介导同源重组和非同源末端连接通路选择的分子机制。     

DNA双链断裂修复途径的选择与调控

DNA双链断裂(double strand break,DSB)是一种导致基因组不稳定性的高毒性损伤,可引起染色质畸变诱发癌症.真核生物中演化出多条保守的DSB损伤修复途径,其中最重要的修复途径是典型的非同源末端连接(clas-sical non-homologous end joining,cNHEJ)和同源重组(h...     

基于CRISPR编辑系统的DNA片段删除技术

基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术已成为基因功能研究和遗传修饰的重要工具。在引导RNA的引导下,Cas9蛋白对基因组靶位点进行精准切割产生DNA双链断裂(DSB),借助细胞内的DSB修复机制,可实现基因组靶位点碱基的缺失、插入或者替换,甚至发生片段删除。该文介绍了基于CRISPR/Cas9基因组编辑系统的D...     

BRCA1与DSB修复路径取向

乳腺癌易感基因1(BRCA1)是一个肿瘤抑制基因.BRCA1参与DNA末端切除、细胞周期调控以及染色体修饰等来维护基因组的稳定性.有研究表明,它能够促进正确的DNA双链断裂(DSBs)修复,如同源重组修复(HDR)和经典的非同源末端连接(C-NHEJ);而抑制错误性的DSB修复,如单链退火修复(SSA)和非经典的末端连接(A-EJ);其机制是通过与某些DNA修复相关蛋白质的相互作用来引导DSB修复.目前,BRCA1在DSB修复通路中的作用机制尚未完全明确,仍有待进一步的研究.本文主要阐述BRCA1在DSB各修复通路中是如何发挥其引导作用的.     

动物基因组定点整合转基因技术研究进展

传统转基因技术,如显微注射、转座子、慢病毒转染等将目的基因插入基因组内的整合方式是随机的,这些随机整合对后期转基因动物品系组建和育种带来诸多不利,因此有研究人员提出了定点整合转基因技术。目前该技术的定点整合效率非常低,主要取决于两个方面：一是靶位点产生DNA双链断裂(double-strand break, DSB)的效率;二是断裂后的靶位点与携带同源臂及外源基因的供体质粒发生同源重组的效率,其中同源重组修复(homologous recombination repair, HDR)是基因组定点整合最为依赖的修复机制。靶位点产生DSB后,机体的DNA修复既可能发生HDR,也可能发生非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ),并且两者之间存在竞争关系,因此激活HDR或抑制NEHJ都可提高定点整合转基因的效率。本文结合影响定点整合的因素,对提高定点整合效率最新探索方面进行了综述。     

一种新型提高HDR效率的CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统

近年来，CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展，在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。基于DNA双链断裂(double-stranded break, DSB)同源指导修复(homology-directed repair, HDR)机制的基因敲入和点编辑是基因编辑的重要策略，但效率偏低亟待提高。本文提出了驱动供体DNA富集至DSB处以提高HDR效率的新策略，并设计了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统(donoradapting system, DAS)。该系统主要利用Gal4 DNA结合域(Gal4 binding domain, Gal4BD)作为配体蛋白与Cas9融合表达，将Gal4BD结合序列(Gal4 binding sequence, Gal4BS)作为受体序列与双链DNA (double-stranded DNA, dsDNA)供体结合，以期提高HDR效率。使用HEK293T-HDR.GFP报告细胞系的初步研究结果表明当dsDNA供体同源臂在一定长度(100～60 bp)时该系统能够提高HDR效率2～4倍。进一步的优化研究表明...     

泛素连接酶Brl2在DNA双链断裂修复中的作用分析

组蛋白H2B单泛素化在基因转录、DNA复制及损伤修复中发挥着重要的调控作用。在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中,Brl2作为一个泛素化连接酶,调节H2B的119位赖氨酸的单泛素化。目前,有关Brl2在DNA损伤修复中的作用研究较少,本研究利用药物喜树碱(camptothecin, CPT)处理裂殖酵母产生高毒性的DNA双链断裂(DNA double-strand breaks, DSBs),探索Brl2在DSB修复过程中的作用。研究发现,brl2基因缺失的菌株对CPT高度敏感,并导致细胞内DNA自发重组频率下降。荧光分析表明Brl2和重组修复蛋白Rad52共定位到DSB处,且Brl2促进Rad52在DSB处的募集。在CPT产生的DSB条件下,Brl2会发生磷酸化。以上研究发现揭示了Brl2在DSB修复过程中起重要作用,为具体阐明Brl2在DNA同源重组及双链断裂修复的分子机制奠定了进一步研究的基础。     

基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑研究进展

基于CRISPR/Cas的基因编辑是近年发展起来的一项变革性生物技术。其过程包括在目标DNA位点引入双链断裂(double strand break,DSB)以及其后续的细胞修复。细胞修复DSB主要有两种方式：非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)以及同源重组介导的修复(homology-directed repair,HDR)。前者是大多数细胞修复DSB的主要方式,其特点在于修复简单、效率高但极易出错,往往会引发难以预测的核苷酸插入或删除。点突变是自然界中最常见的遗传突变类型,引起了超过半数的人类遗传疾病以及许多重要农艺性状变异。碱基编辑能够实现单个碱基的替换,既不需要引入DSB,又无需修复模板参与,具有高效、编辑结果可控等优点,在基因治疗、作物育种及生物技术研究等方面具有重大的应用潜能。自首个碱基编辑工具开发以来,碱基编辑相关技术得到快速发展及广泛应用。本文综述了目前DNA碱基编辑研究进展,重点阐述了碱基编辑器及其在编辑效率、精度以及特异性提高和编辑范围扩展等方面的最新进展以及仍存在的瓶颈,并展望其研究和应用前景。     

DSB重组修复与肿瘤关系的研究进展

DNA损伤未及时有效地修复可导致基因组不稳定,增加肿瘤发生率。DSB是基因突变、染色体断裂的主要原因之一,并对肿瘤发生、发展具有一定影响,其修复主要是通过HR和NHEJ两条重组途径完成的。本综述了国外近来对DSB重组修复的HR和NHEJ途径,其与肿瘤抑制蛋白如P53、ATM、BRCA1和BRCA2之间的联系;DSB重组修复异常与某些肿瘤及具有肿瘤易感特征的共济失调性毛细血管扩张症和Nijmegen断裂综合征等疾病之间关系的研究进展。     

RNA干扰猪NHEJ通路修复因子对HR效率的影响

非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)是动物基因组DNA双链断裂(double-strand break, DSB)修复的优选途径,通过与同源重组(homologous recombination, HR)竞争DSB靶点,进而抑制HR的效率。为提高HR效率,本研究针对猪NHEJ通路修复关键因子PNKP、LIG4和NHEJ1的编码序列,设计并合成相应的靶向小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),组成若干对RNAi (RNA interference)系统,将RNAi系统与报告质粒SSA-GFP reporter、HDR -GFP system和ssODN-GFP system共转染至猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs),检测敲低上述NHEJ关键修复因子后对HR的影响。RNAi结果显示,针对PNKP、LIG4和NHEJ1设计的siRNA均可显著敲低PNKP、LIG4和NHEJ1基因的表达(P<0.05)。选择干扰效果最好的siRNA与报告载体共转染PFFs,结果表明干扰PNKP基因表达后可显著提高单链退火(single strand annealing, SSA)修复效率、双链或单链DNA介导的同源重组定向修复(homology-directed repair, HDR)效率分别为55.7%、37.4%和73.1% (P<0.05),而干扰LIG4和NHEJ1分别提高双链和单链介导的HDR效率为37.5% 和 76.9% (P<0.05)。