破伤风毒素近况(续三)

<正> 培养中的细胞相互作用 近年来,许多工作致力于用破伤风毒素作为神经元细胞的特异性标记。Dimpbel等(26)发现:胚胎CNS的原代培养细胞能结合破伤风毒素,而其它的被检细胞系都没有这种作用。这些作者进一步证实:活的细胞是籍它们的神经节苷脂结合破伤风毒素。Dimbbelio小组的工作被Mirsky等补充和专一性化了。他们报导:非神经元细胞和神经元细胞不同,它们不能被破伤风毒素“染污”。他们的结果也证明:神经元细胞结合破伤风毒素好象是所有神经元的一个普遍特征,因为神经系统各个部份的神经原都结合该毒素。体内不同的神经元结合毒素的差异和这些神经原易接近性有关。毒素结合依赖于神经节苷脂。在细胞培养中至少神经节脂苷(GD_(1b),GT_I)是处在神经元细胞的表面,     

破伤风毒素近况(续二)

<正> 毒素的化学性质下面简述一下破伤风毒素的物理化学行质并用最近的资料澄清一些过去混乱的结果。 破伤风毒素可能存在着两个不同的分子状态,即细胞内和细胞外毒素。细胞外毒素因带有肽链刻痕而与细胞内毒素不同。然而,两个被刻痕的毒素片段被一个二硫键连接在一起。所以,虽然两种毒素的结构不同,但他们的物理化学性质基本相同。物理、化学性质破伤风毒素是一个150,000中等分子量的完全蛋白质(14、63、85)。许多关于氨基酸组成的报告,结果相当一致(5、21、52、     

用皂土法制造型特异性肉毒诊断血清

用皂土为载体与类毒素结合方法及破伤风类毒素抗原抗体絮状反应方法去除A、B、C、D、E、F型肉毒抗血清原料中的异型和异种抗毒素(破伤风抗毒素)。制备的A、B、C、D、E、F型肉毒诊断血清每1m l均能中和相应型的肉毒毒素10000LD50以上,而中和异型肉毒毒素或破伤风毒素均低于5 LD50;A、B、C、D、E、F各型混合后的混合型血清每1m l能中和各型肉毒毒素亦大于10000 LD50,中和破伤风毒素低于5 LD50,即效价和特异性符合规程要求。     

抗霍乱毒素B亚单位合成肽抗体的特性

<正> 有几个研究小组已报道霍乱毒素B亚单位合成肽能有效激发产生抗霍乱毒素的中和抗体。该合成肽有希望表现出霍乱毒素的生物功能,它对于研究霍乱毒素B亚单位的结构与功能(霍乱毒素结合GM_1-神精节苷脂和毒素进入细胞膜内分化)很有帮助。 我们根据霍乱毒素B亚单位结构制备出合成肽并检测了它的生物学活性。 1)根据Merrified的固相法我们合成了3个肽,CTB30-48,CTB41-50和CTB84-97(数字代表B亚单位N末端氨基酸残基的限定位置)。在合成中承蒙大阪大学Dr_1 Shimonish合作。 2)用肽-BSA(牛血清白蛋白)结合体免疫家免制备的抗肽血清与霍乱毒素呈     

细菌毒素的膜受体

<正>对某些个别的或性质相似的毒素其结构功能关系和作用机理,已经发表了很多综述性的文章。本文旨在综述有关细菌毒素,特别是毒素受体和它们相互作用的最新文献。但我们所述及的,仅限于A-B结构(用于比较的大肠杆菌的耐热毒素除外)的多肽毒素。其中的一些毒素开始被合成为单链,只是经过蛋白酶解后才成由二硫键联结的A-B分子的双链(包括白喉毒素、绿脓杆菌外毒素A、破伤风毒素和肉毒毒素)。另一些毒素则是由单独合成的亚单位或原体联结在一起才成为A-B结构的(如霍乱毒素、大肠杆菌不耐热毒素、百日咳菌毒素和痢疾毒素)。另外,     

用ELISA定量测定破伤风毒素

<正>破伤风毒素的测定一般是按MLD(最小致死量)试验检定其毒力;或者按絮凝反应法用标准抗血清(ATS)检测其免疫反应性(Lf活性)。MLD测定法需要大量动物,经过很多时日,且受到实验动物的影响,测定依赖于毒素活性,而不是直接定量测定样品的毒素蛋白,尽管絮凝反应法操作简便,但它仅仅是毒素量的间接测定,是半定量的方法,不具备在酶免疫测定中可以获得的灵敏度。 本文介绍了破伤风毒素的夹心ELISA定量测定法,并与常规絮凝法进行了比较。     

破伤风毒素生产和纯化的快速、简便方法

<正>破伤风梭菌产生的破伤风毒素是已知毒性最大的毒素之一。它的分子量大约是150,000,它产生于菌体内,并在菌体自溶时释放于培养基中。 在这以前,毒素是用菌体自溶后的培养滤液制备的。自Raynaud研制了菌体自溶前从菌体中提取毒素的方法以来,几个研究组已用细菌提取物作为纯化毒素的原始材     

白喉和破伤风类毒素的定量测定——2.Mancini试验和火箭免疫电泳试验与絮状试验的比较

<正> 在Ramon絮状试验中,最广泛用于表示白喉和破伤风毒素及类毒素浓度的Lf单位,其原始定义为分别与一个国际单位(Iu)的白喉和破伤风抗毒素等价结合的毒素或类毒素量。如果已知类毒素的浓度(Lf/ml),则可采用絮状试验测定抗毒素的效价(Iu/ml)。同样,用已知效价的抗毒素(Iu/ml)可以 测定未知类毒素的浓度(Lf/ml)。由于一些抗毒素和对应毒素的中和能力及凝絮能力不同,因此,就难于维持这种定义。这两种特性似乎不是相同的。因此,建立了用于絮状试验的白喉抗毒素专用参考品。对于破伤风抗毒素,国际标准品指定两种效价:以国际单位(Iu)标定的破伤风抗毒素效价和以Lf-当量单位标定的第二效价。 最近,决定用Lf单位标定的类毒素代替抗毒素作为参考品的结果进行了研究。这种     

重组α-银环蛇毒素P22-A31的原核表达及功能分析

α-银环蛇毒素在神经科学研究以及在临床和制药上有重要作用,为获得大量的α-银环蛇毒素,我们用已构建的pGEX-BgTX(P22-A31)质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并用谷胱甘肽Sepharose FF纯化GST-α-银环蛇毒素融合蛋白,再用凝血酶切掉融合标签谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase,GST),得到了较纯的重组α-银环蛇毒素同工毒素,得率约为1.225mg/L。用重组α-银环蛇毒素制备多克隆抗体,经ELISA和Western杂交鉴定后可知重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素的抗原性一致。小鼠毒性试验表明,重组α-银环蛇毒素同工毒素的半致死剂量LD50为1.598mg/kg,约为天然α-银环蛇毒素的1/5。小鼠化学法镇痛试验显示,重组α-银环蛇毒素有一定的镇痛药效,1/4LD50剂量的镇痛百分率为55.2%,1/8LD50剂量的镇痛百分率为20.5%,在外周镇痛作用中呈一定的量效关系。     

镰刀菌毒素的研究II．T-2毒素的提取、纯化及结构鉴定

本文报道了三线镰刀菌M-20(Fusarium tricinctum)接种于已灭菌的玉米粒培养基中,于13℃培养30天后,提取培养物所得粗毒素。经二次硅胶柱层析纯化后,经丙酮-正己烷结晶,可获得白色针状结晶。根据它的熔点(151—2℃)R_f0.56,LD_(50)2.5,mg/kg。分子量466,FD质谱测定,~1H核磁共振谱及EI质谱,确证结晶为T-2毒素。     

镰刀菌毒素的研究 Ⅱ.T-2毒素的提取、纯化及结构鉴定

本文报道了三线镰刀菌M-20(Fusarium tricinctum)接种于已灭菌的玉米粒培养基中,于13℃培养30天后,提取培养物所得粗毒素。经二次硅胶柱层析纯化后,经丙酮-正己烷结晶,可获得白色针状结晶。根据它的熔点(151—2℃)R_f0.56,LD_(50)2.5,mg/kg。分子量466,FD质谱测定,~1H核磁共振谱及EI质谱,确证结晶为T-2毒素。     

美日医学科学协作规划第二十二次联合学术讨论会——甲壳类腹泻毒素

<正> 在日本东北部(Tohoku省),初夏时,由于食用捕获的甲壳类而引起的腹泻病流行偶有发生。这种病被命名为腹泻性甲壳类中毒。在欧州国家已为人所知。近几年病人总数超过一万。病人可患严重腹泻三天,康复后无任何后遗症。尚未见死亡病例报导。(见图)已从甲壳类消化腺中分离出三 种聚醚化合物并鉴定为致病性毒素。Okadaic acid是欧州赂贝的主要毒素而35-meth-ylokadaic acid(=鳍藻毒素-1)及其7-0-酰基衍生物(=鳍藻毒素-3)则为日本甲壳类的主要毒素。对成年人,口服约40微克鳍藻毒素-1即可引起腹泻。这种毒素可使乳鼠小肠中液体大量蓄留,腹腔注     

构象稳定的破伤风毒素Hc 片段突变体 (HcM) 的制备及其免疫原性分析

破伤风是由破伤风杆菌侵入人体伤口、生长繁殖、产生毒素而引起的一种急性特异性感染,其死亡率高,严重危害人民生命健康。研究证实破伤风毒素重链C端 (Hc) 具有与毒素受体结合的活性,完全保留了全分子的免疫原性,有望开发成为新的基因工程破伤风亚单位疫苗以替换传统的甲醛灭活类毒素疫苗。由于野生型Hc蛋白 (HcW) 易形成分子间及分子内二硫键,且各构象分子之间易发生不稳定的转换,为疫苗的生产工艺带来困难,因此,通过将破伤风HcW蛋白的869位半胱氨酸突变为丙氨酸,构建构象稳定的破伤风亚单位疫苗突变体HcM,对Hc     

疫苗

931251用ni rB启动子指导异漂抗原在沙门氏菌口服度苗株中粗定农达[英〕/Chatfied,5.N.1 Bio/Te-ehnol一1。。2,10(s)一555~592〔译自DBA,1992,11(20),92一11274〕 质粒pTET niris指导由缺氧诱导的nirB启动子表达破伤风毒素的无毒性免疫原片段C。将此质粒引入到鼠伤寒沙门氏菌a     

大肠杆菌O_(157):H_7产生的免疫学上与志贺氏菌毒素无关的Vero毒素的特性

<正> 目前已报道了几篇有关大肠杆菌产生的类志贺氏毒素纯化及特性研究的文章。我们也报道过大肠杆菌O_(157):H_7(E,coli82-2035)产生的类志贺氏毒素的理化、生物学及免疫学特性和I型志贺氏痢疾杆菌产生的志贺氏毒素相同。 最近发现,从东京一例出血性结肠炎病人身上分离的一株大肠杆菌O_(157):H_7(E,coli J-2)尽管显示有很强的Vero细胞毒性,但它并不能被抗志贺氏毒素抗体所中     

Up and Down法与寇氏法测定破伤风毒素LD50的比较

目的比较研究Up and Down法与寇氏法测定破伤风毒素LD50值。方法 NIH小鼠皮下注射破伤风毒素,分别使用寇氏法和Up and Down法计算LD50值。结果同一破伤风毒素经寇氏法计算得LD50值为4.97ng/Kg体重,Up and Down法计算LD50值为4.93 ng/Kg体重,95%置信区间为（4.71～5.13）ng/Kg体重。结论应用Up and Down法可测出与寇氏法相同结果的LD50值,且动物使用数量仅用8只。     

破伤风毒素功能牲片段C的克隆与表达

<正>用DNA聚合酶链反应(PCR)增殖破伤风杆菌相应于破伤风毒素片段C的DNA部分。将其克隆入表达载体PTTQ8,并受控于tac启动子。该质粒在大肠杆菌表达产生的蛋白其组成是破伤风毒素的460个氨基酸和C端融入的载体的8个氨基酸。此蛋白(r—片段C)可用片段C特异的抗肽抗体通过ELISA和免疫印迹方法检测,经免疫亲和层析法可达到很高的纯度。r片段C免疫小鼠产生能保护小鼠抵御破     

人源抗破伤风毒素单链抗体(ScFv)的原核表达、纯化及功能鉴定

实验通过DNA重组技术从一株可中和破伤风毒素的人源单克隆抗体细胞(G6)中扩增出了抗体VH、VL的基因,通过重叠PCR使连接片段与VH、VL连接成单链ScFv。经测序证实VH、VL为抗体的可变区序列,命名为ScFv-G6。将ScFv-G6连接转化PET/26b质粒,构建了抗体的表达载体,被命名为PET/26b/ScFv-G6。以该载体在大肠杆菌中分泌表达产物经Ni-亲和柱纯化后的小鼠试验证实,可抵抗破伤风毒素的攻击,表明为中和抗体。具有组织穿透力强,不易过敏,可直接靶向于毒素等特点,适合于破伤风的防治,具有重要的应用价值。     

破伤风毒素C片段(TTc)在大肠杆菌中的表达、优化与鉴定

HTSS以一株破伤风生产菌株基因组DNA为模板,通过上游引物中几个碱基的修改,PCR扩增出破伤风毒素C片段(TTc)基因,构建了原核表达质粒pET-42(b)/TTc,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。重组蛋白分子量约50kD,表达量为22%,超声波破碎显示为可溶性重组蛋白。通过对培养基、诱导时间、诱导温度的优化,重组蛋白的表达量和可溶性均有提高。Western blotting检测表达产物可与破伤风C片段单克隆抗体产生特异的免疫反应。该工作为亚单位疫苗或载体蛋白的开发奠定了基础。     

破伤风毒素 B 片段在人工膜上形成单离子通道的特性

用高效蛋白层析柱纯化破伤风毒素的 B 片段,用膜片箝(patch clamp)技术证明纯化的 B 片段于人工磷脂膜上能够形成离子通道.在中性和酸性 pH 时形成离子通道的几率很小,在有 pH 梯度存在的情况下却较容易测到通道活性.形成的离子通道的电导系数为2.3pS. B 片段形成的离子通道允许 K⁺双向通过.离子通道打开的持续时间一般在20—120ms之间,多为20—40ms 和 100—120ms;闭合持续时间一般在20—40ms 间,多为20ms.表明通道的开和闭非常频繁.