噬菌体抗体库筛选技术

噬菌体展示技术（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）为制备高亲和性抗体提供了有力的工具。噬菌体抗体库的筛选是其中关键的环节,为了提高筛选效率,用包被在固体表面的抗原进行筛选的传统方法不断地被改进,如宿主菌直接洗脱和双层膜筛选系统和抗抗体替代抗原筛选系统。将噬菌体感染宿主菌的过程与筛选过程相关联,产生了选择性感染筛选系统。     

噬菌体展示抗体库筛选技术研究进展

噬菌体展示技术已成为制备高亲和力抗体的强有力的工具。而噬菌体抗体库的筛选是在获得高亲和力抗体过程中很关键的一个环节。总结了针对不同复杂程度的抗原所须采用的不同筛选方法,并简单介绍了高通量筛选的优势。     

噬菌体抗体库筛选技术研究进展

噬菌体抗体库技术是一项新兴的基因工程抗体技术,应用这项技术获得高特异性抗体的关键之一就是筛选环节。根据抗原性质以及筛选目的的不同,筛选方法的选择也不相同,各种筛选策略的优化对中和抗体的获得有至关重要的作用。     

噬菌体抗体库筛选技术

在过去的20年中,噬菌体抗体库筛选技术被广泛的应用于抗体筛选、疾病治疗,临床诊断以及基础研究之中。在该技术的应用过程中,快速有效的筛选出最适合的单克隆抗体并进行可靠和高效的数据管理和分析是十分重要的。文中总结了近年来噬菌体抗体库的高通量筛选方法并且对数据管理做了简要介绍。     

噬菌体抗体库技术与高通量筛选抗体

噬菌体抗体库技术是组合技术与基因工程抗体技术相结合的产物 ,为快速筛选特异性抗体提供了简便而高效的操作系统 ,随着蛋白质组学的飞速发展 ,对抗体的大规模制备的需求日益增加 ,迫切需要发展高质量的抗体库和与之相整合的高通量筛选技术。近年来 ,以上技术的发展和自动化设备的引入为大规模抗体制备的实现提供了条件 ,对这一领域的研究进展做一概述。     

噬菌体抗体库研究进展

治疗性抗体的发展经历了异源抗体、人源化抗体和人源性抗体几个阶段。目前,人源性抗体是治疗性抗体发展的主要方向,而噬菌体抗体库技术的出现为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台,并且逐渐成为目前获得人源性抗体的主要手段之一。噬菌体抗体库技术是20世纪90年代初期抗体工程领域的一项重大进展,它是噬菌体展示和抗体库2种技术的集成,目前广泛应用于生物医学领域。本文对该技术的原理、类型、特点及研究进展进行了综述。     

噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体库技术用ＰＣＲ扩增出抗体的全套可变区基因,通过噬菌体表面表达技术,把Ｆａｂ段或单链抗体表达在噬菌体表面,经过“吸附－洗脱－扩增”过程筛选并富集特异性抗体。     

基于细胞的噬菌体抗体库筛选技术

肿瘤细胞表面抗原的表达量低,免疫原性弱,因抗原构象改变的原因,用传统的固定化抗原方法很难获得有价值的噬菌体抗体。这类抗原大多具有复杂的结构,且其转运、定位与细胞类型及所处的微环境有关。在基于细胞的筛选中,靶抗原以天然状态存在,不需纯化,甚至可以对未知抗原进行筛选,因此广泛用于对内化抗体和血管内皮抗原表位抗体的筛选。基于细胞的抗体筛选中的主要问题是因非特异结合造成的选择背景过高,迄今,已有许多旨在改善选择灵敏度和特异性的研究开展起来。随高通量流式细胞术、组合化学及蛋白质组学研究技术在细胞筛选中的运用,必将使其日趋实用和成熟。我们拟以细胞和组织筛选的技术做一概括,为了解基于细胞的筛选和优化设计提供参考。     

噬菌体抗体库技术研究进展

噬菌体抗体库技术是近10年来发展起来的一项新技术,它的建立是抗体技术领域中的一个革命性进展,使得单克隆抗体的制备得到根本改观。该技术在分子生物学领域和免疫学领域中的应用均有诱人的广阔前景。本文对这一项技术的研究进展作了概括总结。     

噬菌体抗体库技术的研究进展

从显示在丝状噬菌体表面的重组抗体库中选择抗体的方法已成为获得试剂、诊断及治疗的重要手段。本文介绍该技术的原理、发展及运用,但着重描述如何利用细胞筛选、改进洗脱条件、增加库容及进一步筛选以获得高亲和力抗体的方法。     

抗松材线虫纤维素酶单链抗体库的构建及筛选

构建鼠源性松材线虫纤维素酶（Bursaphelenchus xylophilus cellulase, BXC）的噬菌体单链抗体库,从中筛选特异性BXC的单链抗体。以BXC为抗原免疫BALB/C小鼠,从脾脏提取总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链（V_H）和轻链(V_L)可变区基因。经重叠PCR(SOE-PCR)在体外将V_H和V_L连接成单链抗体(scFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,成功构建了库容为5×10⁴的Anti-BXC单链抗体库,并从该抗体库中初步筛选到了特异性识别BXC的噬菌体单链抗体scFv。将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌HB2151进行可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,可溶性scFv获得表达,且与BXC具有结合活性,为松材线虫的检验检疫以及病理学研究奠定了基础。     

噬菌体抗体库技术筛选抗VEGF165单克隆抗体

目的:获得抗血管内皮生长因子165(VEGF165)单克隆抗体,并对其功能进行初步验证。方法:利用噬菌体抗体库展示技术筛选与VEGF165结合的噬菌体克隆并测序,以测序正确的阳性克隆质粒为模板,PCR扩增抗体的轻重链可变区基因,并克隆至哺乳动物细胞表达载体中,构建全抗体表达载体;将全抗体表达载体转染293E细胞,收取培养细胞上清,利用ProteinA亲和纯化抗体;通过结合ELISA、表面等离子共振检测抗体的亲和力,以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模型验证抗体功能。结果:经过噬菌体抗体库展示技术筛出1个与VEGF165特异性结合的抗体序列VG2;293E细胞表达了VG2全抗体蛋白,SDS-PAGE显示VG2抗体纯度较高;BIAcore检测结果表明该抗体具有较高亲和力(KD=0.56nmol/L),竞争抑制ELISA结果表明VG2抗体能抑制VEGF与VEGF受体(VEGFR)的结合(IC50为1.470μg/mL),进一步实验结果表明VG2能够抑制VEGF引起的HUVEC增殖。结论:制备了靶向VEGF165的全人源单克隆抗体VG2,该抗体具有较高的亲和力,能阻断VEGF165/VEGFR2的结合,并抑制HUVEC的增殖,可以作为潜在药物应用于肿瘤治疗。     

噬菌体抗体库的构建及抗乳腺癌细胞单链抗体的筛选

构建抗人乳腺癌细胞MCF 7的噬菌体单链抗体库 ,从中筛选MCF 7细胞特异性单链抗体。用MCF-7细胞免疫BALB C小鼠 ,取脾脏 ,提取总RNA ,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链 (V_H)和轻链 (V_L)可变区基因 ,经重叠PCR(SOE-PCR) ,在体外将V_H和V_{L连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染 ,构建噬菌体单链抗体库。从该抗体库中筛选特异性识别MCF-7细胞的噬菌体单链抗体 ,将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌TOP10进行可溶性表达。成功地构建了库容为12×10⁶ 的抗MCF-7乳腺癌细胞的单链抗体库 ,初步筛选到了与MCF 7细胞特异性结合的scFv,Westernblot检测表明 ,在大肠杆菌TOP10中实现了单链抗体可溶性表达}     

噬菌体抗体库技术及其应用研究进展

噬菌体呈现抗体库是近年发展的一项分子生物学新技术,它的建立是抗体技术领域中的一次革命性进展。它以其独特的构建和筛选系统,彻底改变了抗体制备的传统途径,使抗体工程技术进入了一个新的发展阶段,并对生物学领域中许多技术的发展起到了巨大的推动作用。该技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的制备抗体技术。我们简要综述此项技术的研究应用进展。     

用硫氰酸盐洗脱法直接测定噬菌体抗体的相对亲和力

抗体与相应抗原的结合可以被硫氰酸盐洗脱而解离,抗体的亲和力越高则解离所需要的硫氰酸盐浓度就越大,这一原理在传统的免疫学实验中被用来测定单克隆抗体或多克隆抗体的相对亲和力。如果证明该原理同样适用于噬菌体抗体库技术,则可以建立一种直接测定噬菌体抗体相对亲和力的简便方法。首先将噬菌体抗体与工作浓度的硫氰酸盐共孵育,以证明这一过程并不影响其后的ELISA反应,然后参照硫氰酸盐洗脱法测定完整抗体分子和Fab段相对亲和力的方法,在ELISA实验中以酶标抗M13为二抗检测了5个单克隆噬菌体抗体的相对亲和力,并与相对应的可溶性Fab段的相对亲和力进行了比较。被测抗体中包括3个克隆的抗角蛋白抗体和2个克隆的抗乙型肝炎表面抗原抗体。结果发现,用硫氰酸盐洗脱法测定5个噬菌体抗体所得到的亲和力排序与测定其相应可溶性Fab段所得结果一致,表明硫氰酸盐洗脱法可作为一种简便快速的方法用来直接测定噬菌体抗体的相对亲和力。     

利用重组系统构建大容量噬菌体抗体库

噬菌体抗体库技术是获得人源抗体的重要方法,此文探讨大容量天然噬菌体抗体库在筛选人源抗体中的实际应用价值。从正常人外周血分离淋巴细胞,通过基因工程方法获得抗体基因并且构建到含有重组位点的载体pDF中获得初级噬菌体抗体库,初级库在重组系统中重组之后获得了容量为9×1010的天然Fab噬菌体抗体库,通过序列测定和重组蛋白筛选来对抗体库的质量进行初步鉴定。对随机挑取的96个克隆测序序列分析表明各种型别比例基本合适;用四种抗原筛选有明显的富集,并且获得了针对其中一种抗原的阳性抗体克隆。     

噬菌体单链抗体文库的构建及筛选

噬菌体抗体是继多克隆抗体、单克隆抗体之后兴起的第3代基因工程抗体.噬菌体抗体库技术是抗体基因文库技术和噬菌体表面展示技术相结合形成的一项新技术与方法,在生物科学领域极具潜力.现主要就近年来该技术在抗体基因扩增、抗体库的构建、筛选方法等方面的进展进行综述.     

人源单克隆抗人免疫缺陷病毒1型抗体Fab段基因的获得

应用噬苏体抗体库技术有效地筛选出了多株抗ＨＩＶ－１人源单克隆抗体。以逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从ＨＩＶ－１感染者外周血淋巴细胞中扩增抗体轻重链可变区基因,插入载体ｐＣＯＭＢ３,建立噬菌体抗体库。分别以ＨＩＶ－１ｇｐ１２０和ｇｐ１６０为固相抗原,经过多轮筛选,从中获得了多株抗ＨＩＶ－１ｇｐ４１、ｇｐ１２０和ｇｐ１６０的单克隆抗体Ｆａｂ段基因。抗ＨＩＶ特异性噬菌体抗体随抗体库的筛选高度富集,抗     

利用噬菌体抗体库筛选U251细胞血清应答基因蛋白特异抗体

利用噬菌体表面展示抗体库对不同血清处理U251细胞吸附的抗体进行差异筛选,筛选获得血清饥饿细胞吸附的阳性噬菌体克隆96个和血清饥饿后恢复血清培养细胞吸附的阳性噬菌体克隆82个。细胞免疫组化检测发现应答反应差异较大的抗体2个,即血清饥饿培养细胞特异反应的抗体1个（11号抗体）和血清饥饿后恢复血清培养细胞特异反应的抗体1个（2号抗体）,其中2号抗体在恢复血清培养细胞中的应答反应强于血清饥饿培养细胞,是一个血清应答基因蛋白特异抗体,且在血清饥饿后恢复血清培养不同时间的U251细胞中具有一定的特异性反应。该研究为寻找与细胞周期调控有关的因子奠定了基础,同时对肿瘤的诊断和治疗研究也有重要意义。