Reconstitution of Telomerase Activity Extends the Proliferative Life-span and Maintains the Neurogenetic Potential of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Fetal Muscle

目的 :通过重建端粒酶活性延长胎儿肌肉源间充质干细胞寿命 ,并对其成神经潜能进行研究 ,为组织工程神经修复提供种子细胞。方法 :将人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因通过脂质体转染法导入胎儿肌肉源间充质干细胞 ,RT PCR检测hTERTmRNA的表达 ,TRAP PCR检测细胞端粒酶活性。用bFGF诱导已重建端粒酶活性的肌肉源间充质干细胞向神经细胞分化 ,免疫荧光及免疫印迹法检测分化情况。结果 :转染hTERT的胎儿肌肉源间充质干细胞能稳定表达端粒酶活性。转染后传 75代的细胞经bFGF诱导仍维持着自我更新及向神经细胞分化的潜能 ,且无恶性转化倾向。结论 :重建端粒酶活性可延长胎儿肌肉源间充质干细胞寿命并维持自我更新及成神经潜能 ,为建立组织工程标准细胞系提供了新的实验手段     

hTERT基因片段的克隆、表达和抗hTERT抗体用于端粒酶及hTERT检测的研究

端粒酶是一种重要的肿瘤生物学标志,其活性在生殖细胞、绝大多数肿瘤细胞和体外培养的永生细胞可以测知,但在大多数体细胞中不易测出。人端粒酶由两部分组成,包括hTERC和hTERT,hTERC在正常细胞和肿瘤细胞中均有表达,而hTERT的表达似乎受到严格的调控且和端粒酶活性一致。为了检测肿瘤细胞中端粒酶及hTERT的表达,我们制备了抗hTERT蛋白的特异性多克隆抗体。首先用RT-PCR方法克隆了hTERTcDNA的一个片段,将其连接到GST融合表达载体pGEX-5X-3后在大肠杆菌中融合表达。将纯化的融合蛋白抗原免疫动物,制备抗hTERT蛋白的多克隆抗体。不同的细胞抽提物用该抗体进行了Westernblot分析,结果表明该抗体可特异识别端粒酶阳性细胞株中的hTERT及端粒酶,为端粒酶及hTERT的检测初步提供了一个简单有效的检测手段。     

外源性端粒酶基因对人脐静脉内皮细胞的影响

为了观察外源性端粒酶逆转录酶基因(hTERT)在人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的表达及对细胞功能和生长的影响。采用逆转录病毒载体转导的方法,将hTERT基因转入HUVEC,检测基因转导后内皮细胞端粒酶的活性和生物学特性。结果发现hTERT转导后细胞端粒酶表达阳性,未转导的亲代细胞为阴性;转导细胞的体外生存时间延长但未永生化,而内皮细胞黏附分子表达的功能未受影响。     

重建端粒酶活性延长人成纤维细胞寿命的研究

正常人体细胞DNA的端粒随着细胞分裂而缩短,当缩短至一定长度时细胞将停止增殖并衰老死亡。细胞中的端粒酶对端粒起着补足长度的作用。但端粒酶在正常体细胞中不表达,只在生殖细胞、干细胞和肿瘤细胞中表达。最近已有将人端粒酶亚单位基因导入正常人体细胞而使细胞寿命延长的报道。本研究将人端粒酶催化亚基(hTERT)基因用电穿孔法转入正常人体成纤维细胞,筛选出阳性克隆后传代培养,确认外源性端粒酶基因表达和端粒酶活性的重建,证实细胞衰老延缓;同时,通过DNA整倍性和染色体核型分析,明确这些寿命延长的细胞并未发生恶性转化。目的在于通过在具有成骨潜能的成纤维细胞中重建端粒酶活性来延长它们作为骨修复种子细胞的寿命,并且对它们进一步用于临床的安全性进行考察。     

端粒酶抑制剂

端粒酶被激活被认为是发生恶性肿瘤的主要因素,其激活及表达程度与肿瘤的发生和转移密切相关,因此端粒酶是肿瘤靶向治疗的理想靶点。研究和开发端粒酶抑制剂将为肿瘤治疗揭开新的篇章。端粒酶全酶复合物有很多可以做抑制剂的靶点,包括hTR(端粒酶RNA成分)、hTERT(端粒酶逆转录催化亚单位)、引物锚定位点、全酶的组装和那些招募端粒酶到端粒的因子。     

人端粒酶催化亚基基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体

为获得端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达载体用于癌症的基因治疗 ,克隆并构建了人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因启动子调控的萤光素酶报告载体 .用脂质体转染法将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞 ,检测其在肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性 .hTERT启动子在所检测的 4种端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性 ,平均为阳性对照的 4 4 3% ;而在端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞中则无明显的转录活性 .提示hTRET启动子的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调 ,由hTERT启动子构建的载体可能是一种新颖和有前景的肿瘤细胞特异性表达的基因治疗载体     

乙型肝炎病毒X蛋白与端粒酶的关系

端粒（telomere）是真核细胞染色体末端的重复序列,对维持染色体的稳定性具有重要作用 .端粒酶（telomerase）是维持端粒长度必需的一种逆转录酶,在细胞增殖、衰老、永生化 和癌变等方面具有重要的作用.在肿瘤细胞中端粒酶发生明显变化,有较高水平的表达和很 强的活性,成为肿瘤细胞的重要特征之一.乙型肝炎病毒（hepatitis B virus）X蛋白（HBx ）与肝癌的发生密切相关,HBx可以通过多种途径发挥致癌作用,其中一个重要的分子机制 ,即激活人端粒酶反转录酶hTERT（为端粒酶的催化亚单位）使细胞发生永生化而癌变.因此 ,详细阐明HBx与hTERT的关系对于揭示乙肝病毒致癌机制具有重要的意义.本文对HBV的分子 结构和HBx的分子生物学特性进行了详细的阐述,对HBx与hTERT及其调控因子的关系进行了 归纳和总结,有助于进一步阐明HBx的致癌机制.     

EBV LMPl通过诱导c-myc表达活化端粒酶hTERT

利用原代人胚鼻咽上皮细胞和Tet—on—LMP1 HNE2等良好的细胞体系,采用报道基因法和Western blot法等,分别检测Epstein—Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMPl)诱导的c—myc反式激活活性和蛋白表达水平。从LMPl诱导细胞内c—myc表达的角度,探讨LMPl诱导端粒酶表达的分子机制。结果表明,LMPl促使细胞内c-myc反式激活活性增强,c-Myc蛋白表达量升高;导入反义LMPl表达质粒阻断LMPl表达后。c—myc反式激活活性下降。将端粒酶hTERT启动子上c—myc：结合位点突变后,LMP1不能诱导端粒酶hTERT表达。因而认为,EB病毒LMPl通过诱导c—mvc表达而活化端粒酶hTERT。